CN111233985A - 一种新型冠状病毒IgA抗体快速检测试纸条的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测新型冠状病毒2019‑nCoV IgA抗体的重组蛋白、试纸条、制备方法和应用；属于病毒检测技术领域；所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品吸收垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有抗人IgA抗体，所述质控区喷涂有羊抗鸡IgY抗体。本发明中所述试纸条通过检测唾液样本中的IgA抗体，能够简单、快速、准确的检测新型冠状病毒，实现新型冠状病毒的早期检测。

Description

一种新型冠状病毒IgA抗体快速检测试纸条的制备方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒 2019-nCoV IgA抗体的重组蛋白、试纸条、制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合 征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型 冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，2019-nCoV是 人类分离的第七类冠状病毒。相关疾病监测，发现多起病毒性肺炎病 例，均诊断为病毒性肺炎/肺部感染。
现有证据表明，2019新型冠状病毒主要通过飞沫、气溶胶、直接接触分 泌物传播，能在人与人之间传播，传播力极强。
新型冠状病毒感染人体后有3～7天(不超过14天)的潜伏期，潜伏期 内可无临床症状，不易发现。目前的证据表明，潜伏期感染者也有传染性， 增大了阻断病毒传播的难度。新型冠状病毒感染临床症状主要表现为发热、 咳嗽、乏力等非特异症状，与普通感冒难以区分，其确诊依赖实验室诊断技 术。
目前新型冠状病毒感染诊断主要依赖基于聚合酶链式反应(PCR)或核 酸测序检测病毒特异性基因序列来进行。但是核酸诊断需要有特殊的实验室 (要求有4个在物理空间上完全相互独立的区域)和数十种配套设备以及专 业操作人员(需认证)才能完成，且检测过程操作复杂，需要数小时才能完 成；极易产生气溶胶污染，造成假阳性，也存在因为取样不合适造成漏检的 情况，因此核酸检测不适合现场大规模开展。
免疫学诊断主要是通过抗原抗体免疫反应检测人体感染病毒以后产生 的特异性抗体来诊断。免疫学诊断方法具有操作简单、检测速度快、无需特 殊场地及(复杂)仪器设备，且敏感性高等优点，适用于现场大规模开展新 型冠状病毒感染筛查及诊断工作。免疫学诊断已报道的方法学主要是胶体金 法，检测血液中的病毒特异性IgM和IgG抗体。但是血液样本属于侵入性样 本，首先需要专业的医护人员才能采血，且对病人造成不适，采样的过程可 能造成不必要的交叉感染。因此市面上缺少无创、快速、准确筛查针对2019 新型冠状病毒感染的检测试剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的重组蛋白、试纸条、制备方法和应用。
当新型冠状病毒2019-nCoV入侵人体后，机体免疫系统会针对病毒的 NP蛋白和Spike蛋白产生免疫反应，早期的IgA型抗体会分泌到唾液中。 本发明中所述的重组蛋白能够与新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体特异性结 合；因此通过检测唾液中的抗病毒IgA含量可以在早期诊断是否感染新型冠 状病毒。
本发明的另一个目的是提供一种能够快速、准确的检测新型冠状病毒 2019-nCoVIgA抗体时间分辨免疫荧光试纸条，用于唾液样本的检测，无创 检测，易被患者，尤其是幼儿接受。所述试纸条的检测时间低于15min，且 采用的新型冠状病毒的N蛋白，通过加入特殊氨基酸，实现抗原的定向偶联， 从而更好的展示抗原结构，更准确的检测抗病毒IgA抗体，有利于新型冠状 病毒的防控、治疗工作。
本发明提供了一种检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的重组蛋白， 所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的试纸条， 包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品吸收垫、荧光微球垫、硝酸纤维 素膜和吸水垫，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的2019新型冠状病毒 特异性抗原，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂 有抗人IgA抗体，所述质控区喷涂有羊抗鸡IgY抗体；所述2019新型冠状 病毒特异性抗原为所述的重组蛋白。
优选的，所述试纸条检测的样本为唾液样本。
优选的，所述试纸条还包括样本稀释液；所述样本稀释液包括PB溶液 和Tween-20；所述PB溶液的浓度为0.008～0.012mol/L；所述样本稀释液中Tween-20的体积含量为0.4％～0.6％。
优选的，所述荧光微球为聚苯乙烯包裹稀土离子Eu+的微球，所述荧光 微球表面有氨基基团；所述荧光微球的直径为100～300nm。
优选的，所述荧光微球的氨基基团与重组蛋白的巯基通过交联剂偶联。
优选的，所述抗人IgA抗体包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单 克隆抗体、兔抗人IgA多克隆抗体和兔抗人IgA单克隆抗体中的一种。
本发明提供了所述的试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)将荧光微球活化后，与所述重组蛋白混合偶联获得荧光微球标记的 2019新型冠状病毒特异性抗原；
2)将所述荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原喷涂至玻璃纤 维膜上获得荧光微球垫；
3)将抗人IgA抗体和羊抗鸡IgY抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测 区和质控区获得固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；
(4)在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、荧光微球垫、固定有检测区 和质控区的硝酸纤维素膜、以及吸水垫获得试纸条。
优选的，步骤1)中所述荧光微球活化为将所述荧光微球、交联剂和活 化缓冲液混合震荡活化20～40min。
本发明还提供了所述的重组蛋白、所述的试纸条在制备2019新型冠状 病毒检测试剂中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的重组蛋白、试纸条采用了一种全新的方法学实现2019新 型冠状病毒的检测，具有检测仪器成本低、操作简便、快速的优点。本发明 提供的试纸条可常温储存运输，检测的样本为唾液样本，取样简单，可以实 现无创取样(现有的免疫学方法需要侵入性血液采集；核酸检测的方法需要 上皮细胞，取样要求高)。本发明提供的试纸条稳定性好(现有的核酸检测 需要冷藏试剂)；本发明提供的试纸条灵敏度高，本发明在抗原序列中引入 半胱氨酸，实现抗原的定向标记；由于IgA先于IgM和IgG分泌到唾液中， 本发明提供的试纸条检测唾液中的IgA，能够实现早期筛查。
对比RT-PCR法，本发明提供的试纸条的优点为：检测环境要求低，检 测仪器成本低，避免复杂前处理过程，检测速度快(15min)，样本采集容 错率高，可实现高通量检测，单人份包装，稳定性好，重复性高，操作简单 无需专业人员。
对比测序法，本发明提供的试纸条的优点为检测仪器成本低，试剂可常 温储存，单人份包装，稳定性好，重复性高，操作简单无需专业人员，检测 快速15min。
对比胶体金法，ELISA法，本发明提供的试纸条检测方法的优点为样本 采集简单(本发明为唾液，ELISA法为血液)，适用于临床推广使用。本发 明实现了抗原的定向偶联，特异性高，结果准确。本发明试纸条检测的是IgA， 而胶体金检测的为IgG，IgM，本发明所述试纸条检测病毒IgA，更有利于 早期筛查。
附图说明
图1为新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体检测试剂参考值的确定。
具体实施方式
本发明提供了一种检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的重组蛋白， 所述重组蛋白为在新型冠状病毒2019-nCoV NP蛋白在C末端加入了一个半 胱氨酸残基后获得，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体 如下：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLP NNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRG GDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKD HIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSR NSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQG QTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDD KDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQ TVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQAGSSC。在本发明具体实施过程 中，所述重组蛋白委托北京德奥平生物技术有限公司生产制备，所述重组蛋 白的纯度大于95％。
本发明还提供了一种检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的试纸条， 包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品吸收垫、荧光微球垫、硝酸纤维 素膜和吸水垫，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的2019新型冠状病毒 特异性抗原，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂 有抗人IgA抗体，所述质控区喷涂有羊抗鸡IgY抗体；所述2019新型冠状 病毒特异性抗原为所述的重组蛋白。
在本发明中，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的2019新型冠状病 毒特异性抗原，即荧光微球标记的重组蛋白。在本发明中，所述荧光微球标 记的重组蛋白的喷涂浓度优选为5～20ug/mL；在本发明中，所述喷涂优选的 通过金标点膜喷金仪实现。在本发明中，所述荧光微球优选为聚苯乙烯包裹 稀土离子Eu+的微球，所述荧光微球表面有氨基基团；所述荧光微球的直径 优选为100～300nm。本发明对所述荧光微球的来源没有特殊限定，采用本领 域常规的市售荧光微球即可。在本发明中，所述荧光微球的氨基基团与重组蛋白的巯基通过交联剂偶联。在本发明中，所述交联剂优选的包括SMCC、 MBS、EMCS和PMPI中的一种。
在本发明中，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区 喷涂有抗人IgA抗体，所述质控区喷涂有羊抗鸡IgY抗体。在本发明中，所 述抗人IgA抗体优选的包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、 兔抗人IgA多克隆抗体和兔抗人IgA单克隆抗体中的一种。本发明对所述抗 人IgA抗体的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品或自行制备获 得。本发明对所述羊抗鸡IgY抗体的来源没有特殊限定，采用本领域常规的 市售商品即可。在本发明中，所述抗人IgA抗体的喷涂浓度优选为 0.3～0.7mg/mL，更优选为0.5mg/mL；所述抗人IgA抗体的喷膜量优选为 1.0～1.4μL/cm，更优选为1.2μL/cm。在本发明中，所述羊抗鸡IgY抗体的喷 涂浓度优选为0.3～0.4mg/mL，更优选为0.3mg/mL；所羊抗鸡IgY抗体的喷 膜量优选为1.0～1.4μL/cm，更优选为1.2μL/cm。
本发明对所述底板、样品吸收垫和吸水垫没有特殊限定，采用本领域常 规的试纸条使用的底板、样品吸收垫和吸水垫即可。
在本发明中，所述试纸条检测的样本优选为唾液样本。在本发明中，所 述试纸条优选的还包括样本稀释液；所述样本稀释液优选的包括PB溶液和 Tween-20；所述PB溶液的浓度优选为0.008～0.012mol/L，更优选为 0.01mol/L，所述PB溶液的pH值优选为7.4；所述样本稀释液中Tween-20 的体积含量优选为0.4％～0.6％，更优选为0.5％。
本发明提供了所述的试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)将荧光微球活化后，与所述重组蛋白混合偶联获得荧光微球标记的 2019新型冠状病毒特异性抗原；
2)将所述荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原喷涂至玻璃纤 维膜上获得荧光微球垫；
3)将抗人IgA抗体和羊抗鸡IgY抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测 区和质控区获得固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；
(4)在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、荧光微球垫、固定有检测区 和质控区的硝酸纤维素膜、以及吸水垫获得试纸条。
在本发明中，将荧光微球活化后，与所述重组蛋白混合偶联获得荧光微 球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原。在本发明中，所述荧光微球的活 化为将所述荧光微球、交联剂和活化缓冲液混合、震荡活化20～40min。在 本发明中，所述荧光微球、交联剂和活化缓冲液的比例优选为 100μL:2mg:400μL。在本发明中，震荡活化的时间优选为30min。本发明对 所述荧光微球活化的温度没有特殊限定，20～25℃均可。在本发明中，所述 交联剂优选的包括SMCC、MBS、EMCS和PMPI中的一种。在本发明中， 所述活化缓冲液优选为80～120mmol/L的PB溶液，更优选为100mmol/L； 所述活化缓冲液的pH值优选为7.8～8.2，更优选为8.0。本发明在所述震荡 活化后，优选的进行离心，收集活化后的荧光微球；所述离心的转速优选为 8000～12000rpm，更优选为10000rpm，所述离心的时间优选的为8～12min，更优选为10min，所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。
本发明在所述荧光微球活化后，将活化后的荧光微球与所述重组蛋白混 合偶联获得荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原。在本发明中， 所述偶联具体为将所述活化后的荧光微球、重组蛋白和偶联缓冲液混合，震 荡偶联。在本发明中，以活化前荧光微球的体积计，所述荧光微球与重组蛋 白的比例优选为80～120μL:2μg，更优选为100μL:2μg。在本发明中，所述震 荡偶联的时间优选为50～70min，更优选为60min。本发明对所述震荡偶联的 温度没有特殊限定，20～25℃均可。在本发明中，所述偶联缓冲液优选为PB 溶液，所述PB溶液的浓度有选为80～120mmol/L，更优选为100mmol/L；所 述PB溶液的pH值优选为6.6～6.8，更优选为6.7。本发明在所述震荡偶联后， 优选的还包括震荡封闭步骤；所述震荡封闭优选的在所述震荡偶联体系中加 入BSA溶液进行震荡封闭；所述BSA溶液的质量浓度为0.8％～1.2％，更优 选为1.0％；所述BSA溶液与活化前荧光微球的体积比优选为(0.8～1.2):1， 更优选为1:1。在本发明中，所述震荡封闭的时间优选为10～14h，更优选为12h。
本发明在所述震荡封闭后，优选的进行离心、重悬和保存。在本发明中， 所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为10000rpm，所述离心的时 间优选的为8～12min，更优选为10min，所述离心的温度优选为3～5℃，更 优选为4℃。在本发明中，所述重悬的重悬液优选为包括质量分数0.01％NaN3和质量分数0.1％BSA的PB溶液，所述重悬液的pH值优选为7.3～7.5，更 优选为7.4。在本发明中，优选的用所述重悬液洗涤后进行保存，所述洗涤 的次数优选为1～2次。在本发明中，所述保存的温度优选为3～5℃，更优选 为4℃；所述保存优选的避光进行。
本发明在获得所述荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原后， 将所述荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原喷涂至玻璃纤维膜上 获得荧光微球垫。在本发明中，所述荧光微球标记的2019新型冠状病毒特 异性抗原优选的稀释后进行喷涂；在本发明中，所述稀释优选的采用上述重 悬液进行；所述稀释后的浓度优选为5～20μg/mL。在本发明中，优选的采用 金标点膜喷金仪进行喷涂，本发明在所述喷涂后，优选的进行干燥；所述干 燥的温度优选为35～40℃，更优选为37℃，所述干燥的时间优选为2～4h， 更优选为3h。
在本发明中，将抗人IgA抗体和羊抗鸡IgY抗体分别喷涂在硝酸纤维素 膜的检测区和质控区获得固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜。在本发明 中，所述抗人IgA抗体的喷涂浓度优选为0.3～0.7mg/mL，更优选为0.5mg/mL； 所述抗人IgA抗体的喷膜量优选为1.0～1.4μL/cm，更优选为1.2μL/cm。在本 发明中，所述羊抗鸡IgY抗体的喷涂浓度优选为0.3～0.4mg/mL，更优选为 0.3mg/mL；所羊抗鸡IgY抗体的喷膜量优选为1.0～1.4μL/cm，更优选为 1.2μL/cm。在本发明中，所述喷涂优选的通过金标点膜喷金仪进行；本发明 在所述喷涂后进行干燥；所述干燥的温度优选为35～40℃，更优选为37℃， 所述干燥的时间优选为4～6h，更优选为5h。
在本发明中，在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、荧光微球垫、固定 有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫获得试纸条。在本发明具体实施 过程中，优选的将样品吸收垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至 右依次搭接粘贴固定在底板上，所述样品吸收垫的末端与荧光微球垫始段相 连，所述荧光微球垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，所述硝酸纤维素膜 的末端与吸水垫的始端相连。在本发明中，所述样品吸收垫的始端与底板的 始端对齐，所述吸水垫的末端与底板的末端对齐。在本发明中，优选的采用 机器进行试纸条的切割；所述试纸条的宽度优选为3.5～4.5mm，更优选为 3.96mm。在本发明中，所述试纸条优选的装于塑料制卡中，形成试纸卡。
在本发明中，所述试纸条的使用方法包括以下步骤：S1)用样本稀释液 对样本进行稀释获得处理后的样本；S2)将处理后的样本滴加到试纸条上进 行检测；S3)将所述试纸条置于荧光监测分析仪中读取结果。在本发明中， 步骤S1)中所述稀释的倍数优选为8～12倍，更优选为10倍。步骤2)中所 述样本滴加体积优选为70～90μL，更优选为80μL；步骤2)所述的检测的时 间优选为13～17min，更优选为15min；检测温度优选为20～25℃。
本发明还提供了所述的重组蛋白、所述的试纸条在制备2019新型冠状 病毒检测试剂中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体检测试剂条的制备。
1.新型冠状病毒2019-nCoV重组NP蛋白的制备:
新型冠状病毒2019-nCoV重组NP蛋白在C末端加入了一个半胱氨酸残 基，氨基酸序列如序列Seq ID No.1所示。委托北京德奥平生物技术有限公 司生产制备，纯度大于95％。
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLP NNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRG GDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKD HIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSR NSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQG QTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDD KDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQ TVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQAGSSC
2.荧光微球标记新型冠状病毒2019-nCoV重组NP抗原的制备
(1)活化：取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有氨基官能团的微球悬 液100μL混悬于400μL活化缓冲液中(100mmol/L PB pH8.0)，加入 2mgSMCC，混匀后室温震荡活化30min；
(2)偶联：将(1)所述混悬液于4℃，10000rpm离心10min后弃上清，重 悬于偶联缓冲液(100mmol/L PB pH6.7)中，加入2μg新型冠状病毒 2019-nCoV重组NP抗原溶液，混匀后25℃震荡偶联60min；
(3)封闭：将(2)所述混悬液加入1％的BSA溶液100μL，混匀后室温震荡 封闭过夜；
(4)贮存：将(3)所述混悬液于4℃10000rpm离心10min后弃上清，重悬 于贮存缓冲液中(0.01％NaN3、0.1％BSA的pH 7.4的PB缓冲液)，以此 法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。
3.玻璃纤维垫的制备
将贮存的荧光微球标记的新型冠状病毒2019-nCoV重组NP抗原以贮存 缓冲液稀释到浓度为10μg/mL，用金标点膜喷金仪喷涂，喷涂速度为1μL/mL，37℃干燥3h，取出密封保存。
4.硝酸纤维素(NC)膜的制备
用0.05mol/L、pH 7.2的PB缓冲液将羊抗人IgA抗体稀释到0.5mg/mL， 用金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.2μL/cm； 用0.05mol/L、pH7.2的PB缓冲液将羊抗鸡IgY抗体稀释到0.3mg/mL，用 金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(C)，喷膜量为1.2μL/cm；37℃ 干燥5h，备用。
5.试纸条的组装
将样品吸收垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接 粘贴固定在底板上，样品吸收垫的末端与玻璃纤维垫始段相连，玻璃纤维垫 的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相 连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐， 然后用机器切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。
实施例2
检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的时间分辨荧光免疫层析试纸条 的应用
1、样品前处理
吸取20μL唾液样本加入到200μL样本稀释液，充分混匀。
2、用试纸条检测
用微量移液器准确吸取80μL待检样品溶液于试纸条加样孔中，室温 (20～25℃)作用15min；将试纸卡插入荧光检测仪的承载器中，通过触摸显 示屏选择待检项目，按下“开始检测”按键，荧光检测仪将自动对试纸卡进行 扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取或打印检测结果。
3、检测结果分析
定量检测
测试完成后，仪器获得试纸卡上检测区时间分辨荧光强度与质控区时间 分辨荧光强度的比值，基于预先内置的试纸卡上检测区时间分辨荧光强度与 质控区时间分辨荧光强度的比值与新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的关系 曲线，获得待测样品中新型冠状病毒2019-nCoV IgA的含量。
曲线方程采用四参数拟合:y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
其中：A＝3058.2477，B＝-0.85436，C＝38284.36669，D＝0.03176
若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸卡已失效。
实施例3
临床样本的参考值(cutoff值)的确定
选取临床样本60例健康人(无2019新型冠状病毒感染)，结果如图1 所示，本发明测定2019新型冠状病毒感染IgA时间分辨免疫层析试纸条测 定健康人群的cutoff值为1。
由上述实施例可知，本发明提供的重组2019新型冠状病毒抗原，即重 组蛋白，通过C端的半胱氨酸上的巯基同荧光微球的氨基偶联，实现了抗原 的定向偶联，有利于抗原结构的伸展，以及正确结构的展示，因此检测的特 异性，灵敏度更高。同时本发明所述试纸条采用唾液样本，避免了采血过程 对病人造成的不适以及交叉感染，可以早期、无创的进行2019新型冠状病 毒感染的筛查，有利于医疗机构尤其是基层医疗的推广，能够有效的辅助 2019新型冠状病毒的防控工作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和 润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京丹大生物技术有限公司
<120> 一种新型冠状病毒IgA抗体快速检测试纸条的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala Gly Ser Ser Cys
420

Claims (10)

1.一种检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种检测新型冠状病毒2019-nCoV IgA抗体的试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品吸收垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有抗人IgA抗体，所述质控区喷涂有羊抗鸡IgY抗体；所述2019新型冠状病毒特异性抗原为权利要求1中所述的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条检测的样本为唾液样本。
4.根据权利要求2或3所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条还包括样本稀释液；所述样本稀释液包括PB溶液和Tween-20；所述PB溶液的浓度为0.008～0.012mol/L；所述样本稀释液中Tween-20的体积含量为0.4％～0.6％。
5.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球为聚苯乙烯包裹稀土离子Eu+的微球，所述荧光微球表面有氨基基团；所述荧光微球的直径为100～300nm。
6.根据权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球的氨基基团与重组蛋白的巯基通过交联剂偶联。
7.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述抗人IgA抗体包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA多克隆抗体和兔抗人IgA单克隆抗体中的一种。
8.权利要求2～7任意一项所述的试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)将荧光微球活化后，与所述重组蛋白混合偶联获得荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原；
2)将所述荧光微球标记的2019新型冠状病毒特异性抗原喷涂至玻璃纤维膜上获得荧光微球垫；
3)将抗人IgA抗体和羊抗鸡IgY抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测区和质控区获得固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；
(4)在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、荧光微球垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜、以及吸水垫获得试纸条。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述荧光微球活化为将所述荧光微球、交联剂和活化缓冲液混合震荡活化20～40min。
10.权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2～7任意一项所述的试纸条在制备2019新型冠状病毒检测试剂中的应用。
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