CN112946294B - 新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒2019‑nCoV抗体检测试纸条及其制备方法与应用。试纸条的层析膜的检测区(T)包被有新型冠状病毒2019‑nCoVS蛋白片段，质控区(C)包被有羊抗鸡IgY抗体，所述层析膜的膜下缘与样品垫交界处的金标垫上包被有胶体金标记的新型冠状病毒2019‑nCoV S蛋白片段和鸡IgY抗体；所述新型冠状病毒2019‑nCoV S蛋白片段为新型冠状病毒2019‑nCoV S蛋白胞外区或新型冠状病毒2019‑nCoV S蛋白受体结合结构域。本发明提供的新型冠状病毒2019‑nCoV抗体检测试纸及试剂盒，特异性和敏感性高，可作为现场取样初步筛查的检测手段，该试剂盒能检出抗体阳性，提示可与核酸检测形成互补，对于新冠溯源研究中大规模多物种抗体筛查工作以及流行病调查工作提供切实可行的检测手段。

Description

新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条及其制备方法与 应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒 2019-nCoV抗体检测试纸条及其制备方法与应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒 呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140mm。其基因特征与SARS-CoV 和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒 (bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。

目前的临床或实验室诊断方法为核酸检测(RT-PCR或/和NGS)并辅 以IgM检测。由于新型冠状病毒2019-nCoV溯源研究工作涉及物种繁多，关系到野生动物捉放时间，应激反应等问题。而目前的诊断方法存在一定 的局限性，包括操作过程较为繁琐，环境要求高，检测时间长等因素。

发明内容

有鉴于此，为了发明一种操作简便、快速、特异性、敏感性高的检测 方法，适用于新型冠状病毒2019-nCoV溯源的大规模多物种现场筛查，本 发明的目的之一是提供一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条，本 发明的目的之二是提供上述新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条的制 备方法，本发明的目的之三是提供上述新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测 试纸条的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明首先提供一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条，由样 品垫、层析膜、金标垫、吸水垫和衬垫构成，所述层析膜的检测区T包被 有新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段，质控区(C)包被有羊抗鸡IgY 抗体，所述层析膜的膜下缘与样品垫交界处的金标垫上包被有胶体金标记 的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段和鸡IgY抗体；

所述新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段为新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区或新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白受体结合结构域，所述新 型冠状病毒2019-nCoV受体结合结构域的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，所述新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区的氨基酸序列如Seq ID NO.2 所示。

其中，所述检测区T包被的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区的 浓度为1.0-2.0mg/ml。

所述金标垫包被的胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV受体结合结 构域的浓度为10-20μg/ml。

所述质控区C包被的羊抗鸡IgY抗体的浓度为1.0-1.5mg/ml。

所述金标垫上包被的鸡IgY抗体的浓度为5-10μg/ml。

作为优选的，所述层析膜的检测区(T)包被的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段与金标垫上包被的胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋 白片段不同。更优选的，所述层析膜的检测区(T)包被的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段为新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区，金标垫 上包被的胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段为新型冠状病 毒2019-nCoV S蛋白受体结合结构域。

本发明还提供了上述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条的制 备方法，包括以下步骤：

S1、制备金标垫：胶体金标记的新型冠状病毒受体结合结构域 10-20μg/ml胶体金，胶体金标记的鸡IgY抗体5-10μg/ml胶体金，胶体金 标记的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白受体结合结构域和胶体金标记的鸡 IgY抗体以4:1的比例混合，以金标混合物4-10μl喷涂1cm玻璃纤维素膜；

S2、制备层析膜：层析膜检测区(T)包被新型冠状病毒2019-nCoV S 蛋白胞外区，包被浓度为1.0-2.0mg/ml，划膜量为0.6-1.5μl/cm，质控区(C) 包被羊抗鸡IgY抗体，包被浓度为1.0-1.5mg/ml，划膜量为0.6-1.5μl/cm；

S3、组装：将样品垫、金标垫、层析膜和吸水垫组装到衬垫上，得到 所述试纸条。

此外，本发明还提供了上述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸 条在制备检测或辅助检测新型冠状病毒2019-nCoV抗体产品中的应用。

具体为：上述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条在制备体外 定性检测哺乳动物血清、血浆或静脉全血样本中新型冠状病毒2019-nCoV 抗体产品中的应用。

所述产品为试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

冠状病毒进入宿主细胞是由跨膜刺突(S)糖蛋白介导的，其中S蛋白 形成从病毒表面突出的同型三聚体。S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2， 其中远端的亚单位S1亚基含有受体结合结构域(RBD)，负责与宿主细胞 受体结合，可以更加特异的与新型冠状病毒IgM和IgG抗体结合，膜锚定 端的亚单位S2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。本发明分别以S-RBD蛋白 和/或S-ECD(S蛋白胞外区)为抗原采用双抗原夹心法研制新型冠状病毒 2019-nCoV抗体检测试纸，在检测区应用双抗原夹心法、在质控区应用抗 原抗体反应，结合胶体金免疫层析技术定性检测哺乳动物血液中的新型冠 状病毒2019-nCoV抗体，进一步提高检测方法的特异性和敏感性。

本发明提供的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸及试剂盒，可作 为现场取样初步筛查的检测手段，该试剂盒能检出抗体阳性，提示可与核 酸检测形成互补，对于新冠溯源研究中大规模多物种抗体筛查工作以及流 行病调查工作提供切实可行的检测手段。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对 实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附 图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可 以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的S-RBD和S-ECD蛋白SDS-PAGE结果。

图2为本发明实施例3提供的试纸条结构示意图。

图3为本发明实施例4提供的检验结果示意图。

图4-5为本发明实施例5提供的阳性血清检测结果。

图6-11为本发明实施例5提供的哺乳动物血清检测结果。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合 实施例对本发明作进一步的详细介绍。下述实施例中所使用的实验方法如 无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特 殊说明，均可从商业途径得到。鸡IgY抗体和羊抗鸡IgY抗体均为市售产 品。

实施例1S-RBD和S-ECD的制备

本发明根据昆虫细胞密码子偏爱性对2019-nCoV S蛋白胞外区 (S-ECD)基因和S蛋白受体结合结构域(S-RBD)基因进行优化设计， 利用特异性引物(见表1)扩增S蛋白受体结合结构域(S-RBD)和S蛋 白胞外区(S-ECD)基因(上海生物工程有限公司完成)，S-RBD基因序 列如Seq ID NO.3所示，S-ECD基因序列如Seq ID NO.4所示。

表1 S-ECD和S-RBD特异性引物

其中：

酶切位点：GGATCC

起始、终止密码子：ATG、TTA

His标签：ATGGTGATGGTGATGATG

将扩增的S-RBD和S-ECD基因通过酶切位点连入pFast-Bac-Dual质 粒，构建表达目的基因的重组供体质粒。将鉴定正确的供体质粒转化 DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选制备重组杆状病毒质粒。利用 Cellfectin II Reagent转染试剂将重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞，拯救重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9细胞，27℃培养72h，收 获细胞上清液，利用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，获得检测抗原。将纯 化的蛋白以SDS-PAGE进行鉴定，结果如图1所示，S-RBD蛋白的氨基酸 序列如Seq ID NO.1所示，S-ECD蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

实施例2S-RBD蛋白与S-ECD蛋白交叉配对检测结果

将纯化的S-RBD蛋白和S-ECD蛋白分别以相同的浓度(20μg/ml)标 记胶体金，以相同浓度(1.5μg/ml)包被NC膜，干燥37℃5小时后，分别交叉配对，滴加阳性血清对照品，选择信号强度最大者为捕获单抗和包 被单抗的最优组合。结果(见表2)显示，两种蛋白能与新型冠状病毒 2019-nCoV抗体产生特异性反应，通过倍比稀释间接检测结果表明，抗体 稀释1280倍时，S-RBD与S-ECD的组合仍然可以检测到，因此S-RBD与 S-ECD为最优组合，灵敏度最高。

表2 S-RBD蛋白与S-ECD蛋白交叉配对检测结果

实施例3试剂盒的制备

1、试纸条的制备

金标垫的制备：

(1)胶体金颗粒：1％氯金酸：1％柠檬酸三钠体积比＝1:1，紫外分光 光度计检测金颗粒约40nm。

(2)标记：用0.2M K₂CO₃溶液调整胶体金溶液PH至8，按照20ug/ml 金加入新型冠状病毒S蛋白受体结合结构域；按照8ug/ml金加入鸡IgY抗 体。在放置30分钟后7500转/分钟，4度离心20分钟，弃上清。用胶体金 标记物稀释液按1/10复溶沉淀，2～8℃冰箱存放。

(3)喷金：胶体金标记的新型冠状病毒受体结合结构域与胶体金标记 的鸡IgY抗体以4:1的比例混合，以金标混合物10ul喷涂1cm玻璃纤维素 膜，37℃干燥箱中干燥2小时。裁剪成0.5cm×30cm规格，密闭保存备用。

层析膜的制备：

(1)检测区T为新型冠状病毒S蛋白胞外区，包被浓度为1.5mg/ml， 划膜量为1ul/cm，37℃干燥箱中干燥2小时。

(2)质控区C为羊抗鸡IgY抗体，包被浓度为1.0mg/ml，划膜量为 1ul/cm，37℃干燥箱中干燥2小时。

(3)置室温(湿度30％以下)自然干燥24小时后，裁剪成2.5cm×30cm 规格，密闭保存备用。

样品垫：玻璃纤维素膜，裁剪成1.8cm×30cm规格。

吸水纸：裁剪成1.8cm×30cm规格。

衬垫：PVC底板。

试纸条组装：

如图2所示，将层析膜平贴于PVC底板的中央，距上端2cm，下端 1.5cm；金标垫平贴于层析膜检测线的上方，重叠层析膜0.1cm；样品垫平 贴于金标垫的上方，重叠金标垫0.1cm；吸水纸平贴于层析膜质控线的下方， 重叠包被膜0.1cm。均匀平压后切割机剪裁成合适大小(0.4cm宽)试纸条， 直接夹入特制的塑料卡内，取1条试纸条、1包干燥剂与1个塑料滴管， 铝箔袋密封包装。

2、样本缓冲液制备

称取0.2mol/L硼酸盐缓冲液、0.025％NaN₃、0.5％Tween-20和 1.0％TritonX-100依次加入800ml注射用水完全溶解后，定容至1000ml， 混匀后0.22μm滤膜过滤，1ml/管。

3、试剂盒组装：每个试剂盒包含10份试纸条(铝箔袋中包含一份试 纸条、一份干燥剂、一份滴管)，1瓶样本缓冲液，1份说明书。

实施例4检测方法

1、加样

用滴管吸取血液样本10μl±2μl，垂直滴加至检测试纸加样处，滴加4 滴样本缓冲液(约40微升)于加样处，开始计时。

2、检测

15分钟后观察，如图3所示；

如图3①所示，如果质控区C显色，检测区T不显色，则样本不含有 新型冠状病毒2019-nCoV抗体；

如图3②所示，如果质控区C、检测区T均显色，则样本中含有新型 冠状病毒2019-nCoV抗体；

如图3③所示，如果质控区C不显色，则为结果为无效。

实施例5性能检测结果评价

1.材料

1.1阳性血清：新型冠状病毒临床康复者血清，来源于军事科学院军 事医学研究院军事兽医研究所。新型冠状病毒(2019-nCoV)S蛋白免疫马 血清，来源于吉林大学。

1.2哺乳动物血清：

正常人血清、恒河猴血清(灵长类)，正常人血清来源于长春西诺生 物科技有限公司研发人员，恒河猴血清来源于军事科学院军事医学研究院 军事兽医研究所。

穿山甲血清(鳞甲类)，来源于军事科学院军事医学研究院军事兽医 研究所。

兔血清(兔型类)，来源于长春西诺生物科技有限公司。

鼠血清(啮齿类)，为MERS病毒阳性血清，来源于军事科学院军事 医学研究院军事兽医研究所。

犬血清、猫血清、雪貂血清、东北虎血清、华南虎血清和远东豹血清 (食肉类)，其中犬和猫血清为犬冠状病毒阳性和猫冠状病毒阳性血清， 来源于长春西诺生物科技有限公司，雪貂血清、东北虎血清、华南虎血清 和远东豹血清来源于军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所。

犀牛血清、马血清(奇蹄类)，来源于军事科学院军事医学研究院军 事兽医研究所。

牛血清、猪血清、骆驼血清、羊驼血清(偶蹄类)，猪血清和牛血清 来源于长春西诺生物科技有限公司，骆驼血清和羊驼血清来源于军事科学 院军事医学研究院军事兽医研究所。

方法

采用实施例4的检测方法。

3.结果

3.1阳性血清检测结果

将检测临床康复者血清用生理盐水分别稀释至8倍和160倍，经检测 均可出现阳性反应(见图4)，将新型冠状病毒S蛋白免疫的马血清，用 生理盐水分别稀释至200倍、600倍和1000倍，经检测均可出现阳性反应 (见图5)。

3.2哺乳动物血清检测结果

对上述收集的哺乳动物的各类血清进行检查，均未产生阳性反应，表 明该试剂盒特异性良好，详见图6-11。

4.结论

本发明的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒具有良好的敏感 性和特异性，可用于新冠溯源研究中大规模多物种抗体筛查工作。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑， 对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可 以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质 上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

序列表

<110> 长春西诺生物科技有限公司

军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条及其制备方法与应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 2

<211> 1208

<212> PRT

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

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Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

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690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

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Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

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Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

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Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

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Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

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Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

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Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

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Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

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Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

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Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

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Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

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Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

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Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

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Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln

1205

<210> 3

<211> 669

<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 3

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180

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tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300

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aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660

gtcaatttc 669

<210> 4

<211> 3624

<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 4

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcag 3624

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 5

cgcggatcca tgagagtcca accaacagaa t 31

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 6

tgctctagat taatggtgat ggtgatgatg gaaattgaca catttgtttt t 51

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<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

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ccgctcgaga tgagagtcca accaacagaa t 31

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<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

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ataggtacct taatggtgat ggtgatgatg gaaattgaca catttgtttt t 51

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<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

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cgcggatcca tgtttgtttt tcttgtttta ttgccacta 39

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<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

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tgctctagat taatggtgat ggtgatgatg ctgctcatac tttccaagtt cttggagatc 60

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<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

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ccgctcgaga tgtttgtttt tcttgtttta ttgccacta 39

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<211> 60

<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 12

ataggtacct taatggtgat ggtgatgatg ctgctcatac tttccaagtt cttggagatc 60

Claims (9)

1.一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条，由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫和衬垫构成，其特征在于，所述层析膜的检测区(T)包被有新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段，质控区(C)包被有羊抗鸡IgY抗体，所述层析膜的膜下缘与样品垫交界处的金标垫上包被有胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段和鸡IgY抗体；

所述新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段为新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区或新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白受体结合结构域，所述新型冠状病毒2019-nCoV蛋白受体结合结构域的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，所述新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示；

所述层析膜的检测区(T)包被的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段与金标垫上包被的胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段不同，层析膜的检测区(T)包被的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段为新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区；金标垫上包被的胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白片段为新型冠状病毒2019-nCoV蛋白受体结合结构域。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条，其特征在于，所述检测区(T)包被的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区的浓度为1.0-2.0mg/ml。

3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条，其特征在于，所述金标垫包被的胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV蛋白受体结合结构域胶体金的浓度为10-20μg/ml。

4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条，其特征在于，所述质控区(C)包被的羊抗鸡IgY抗体浓度为1.0-1.5mg/ml。

5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条，其特征在于，所述金标垫上包被的鸡IgY抗体的浓度为5-10μg/ml。

6.根据权利要求1-5任一项所述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备金标垫：胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV蛋白受体结合结构域10-20μg/ml，胶体金标记的鸡IgY抗体5-10μg/ml，胶体金标记的新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白受体结合结构域和胶体金标记的鸡IgY抗体以4:1的比例混合，以金标混合物4-10μl喷涂1cm玻璃纤维素膜；

S2、制备层析膜：层析膜检测区(T)包被新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白胞外区，包被浓度为1.0-2.0mg/ml，划膜量为0.6-1.5μl/cm，质控区(C)包被羊抗鸡IgY抗体，包被浓度为1.0-1.5mg/ml，划膜量为0.6-1.5μl/cm；

S3、组装：将样品垫、金标垫、层析膜和吸水垫组装到衬垫上，得到所述试纸条。

7.根据权利要求1-5任一项所述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条在制备检测或辅助检测新型冠状病毒2019-nCoV抗体产品中的应用。

8.根据权利要求1-5任一项所述的新型冠状病毒2019-nCoV抗体检测试纸条在制备体外定性检测哺乳动物血清、血浆或静脉全血样本中新型冠状病毒2019-nCoV抗体产品中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。