CN109187969A

CN109187969A - 检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸、试剂盒和用途

Info

Publication number: CN109187969A
Application number: CN201811095800.0A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 王遵宝; 李俊辉; 李延涛; 任立松; 郑侃; 侯玉珍
Original assignee: Tiankang Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Tiankang Biological Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2019-01-11

Abstract

本发明提供了一种检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸、试剂盒和用途，涉及生物技术领域，该检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸，从加样端依次包被有捕捉抗体、检测抗原和质控抗体；其中，捕捉抗体为能够与猪源抗体结合的抗体，同时捕捉抗体经标记物标记；检测抗原包含猪瘟病毒的E0蛋白和E2蛋白；E0蛋白和E2蛋白为表达系统分别独立表达的蛋白；质控抗体为抗捕捉抗体抗体。该免疫层析试纸为实验筛猪、疫病流行学调查、疫苗效果评价和猪场猪瘟净化提供了新的高效的工具，缓解了现有技术中存在的缺乏一种能够检测E0和/或E2抗体的产品的问题。

Description

检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸、试剂盒和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸、试剂盒和用途。

背景技术

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，其主要特征是急性败血性变化，实质器官出血、坏死和梗死；慢性则呈纤维素性坏死性肠炎，后期常继发副伤寒及巴氏杆菌病。猪瘟是威胁养猪业的主要传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。在《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》中，猪瘟也被列为优先防控的重大动物疫病之一。

现国内外检测猪瘟病毒E2抗体的方法有间接ELISA、阻断ELISA法，检测E0抗体的方法主要是间接ELISA法，但在实际生产中，以上方法费时费力，且要求有专业的技术人员、配套多种检测设备才能进行检测，很多养殖场不具备检测条件。此外，猪瘟病毒E2亚单位疫苗的问世，为猪瘟净化提供了疫苗支持，免疫该疫苗的猪仅会产生对病毒有中和作用的E2抗体，若检出E0抗体，则可判定猪只受到野毒感染。而市面上未见报道能够同时、快速检测E0、E2抗体的免疫层析试纸。因此一种能够同时快速检测猪瘟病毒E0和E2抗体的产品是市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸，以缓解现有技术中存在的缺乏一种能够检测E0和/或E2抗体的产品的问题。

本发明的第二目的在于提供一种用于检测猪瘟病毒抗体的试剂盒，该试剂盒包含上述免疫层析试纸。

本发明的第三目的在于提供一种上述免疫层析试纸或试剂盒在筛选猪瘟病毒感染猪中的用途。

本发明的第四目的在于提供一种筛选猪瘟病毒感染猪的方法，该方法利用上述免疫层析试纸或试剂盒，能够从免疫了猪瘟病毒E0亚单位疫苗或E2亚单位疫苗的猪中筛选出野毒感染的猪。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

一种检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸，所述免疫层析试纸从加样端依次包被有捕捉抗体、检测抗原和质控抗体；

其中，所述捕捉抗体为能够与猪源抗体结合的抗体，同时所述捕捉抗体经标记物标记；

所述检测抗原包含猪瘟病毒的E0蛋白和E2蛋白；E0蛋白和E2蛋白为表达系统分别独立表达的蛋白；

所述质控抗体为抗捕捉抗体抗体。

优选地，编码E0蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码E0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，E0蛋白和E2蛋白分别独立的为昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达的蛋白。

优选地，所述标记物包括胶体金、乳胶或荧光标记物；优选胶体金。

优选地，所述捕捉抗体经胶体金标记；

所述免疫层析试纸包括由金标探针膜制成的胶体金结合区和主要由层析检测膜制成的检测区；

所述捕捉抗体包被于金标探针膜；所述检测抗原和所述质控抗体包被于层析检测膜；

优选地，所述金标探针膜主要由聚酯膜或玻璃纤维膜制成；

优选地，所述层析检测膜主要由PVDF膜或醋酸纤维素膜制成，优选醋酸纤维素膜。

优选地，所述层析检测膜设置检测线T_A和T_B；检测线T_A区域包被E0蛋白，检测线T_B区域包被E2蛋白；

优选地，检测线T_A包被E0蛋白1-5μg；

优选地，检测线T_B包被E2蛋白1-5μg；

优选地，检测线T_A和T_B的宽度分别独立的为1-4mm。

优选地，所述免疫层析试纸还包括主要由样品垫制成的加样区和主要由吸水垫制成的吸水区；

样品垫、金标探针膜、层析检测膜和吸水垫依次的相互部分重叠地固定于支撑板，组成免疫层析试纸。

本发明还提供了一种检测猪瘟病毒抗体的试剂盒，该试剂盒包含上述免疫层析试纸；

优选地，所述试剂盒还包括反应缓冲液、猪瘟病毒E2抗体阳性对照、快检比色卡和一次性定量移液管。

本发明还提供了一种上述免疫层析试纸或上述试剂盒在筛选猪瘟病毒感染的猪中的用途。

本发明还提供了一种筛选猪瘟病毒感染的猪的方法，所述方法包括检测猪的血清中是否存在猪瘟病毒E0和/或E2的抗体；若同时存在两种抗体则所述猪为被猪瘟病毒感染的猪；

所述猪为经猪瘟病毒E0亚单位疫苗或E2亚单位疫苗免疫的猪；

所述检测为使用上述免疫层析试纸或上述试剂盒检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸，从加样端依次包被有捕捉抗体、检测抗原和质控抗体；其中，捕捉抗体为能够与猪源抗体结合的抗体，同时捕捉抗体经标记物标记；检测抗原包含猪瘟病毒的E0蛋白和E2蛋白；E0蛋白和E2蛋白为表达系统分别独立表达的蛋白；质控抗体为抗捕捉抗体抗体。该免疫层析试纸包括独立的E0和E2蛋白，因此可以确定待测样品中的猪瘟病毒抗体来源。由于能同时检测猪瘟病毒E0、E2两种抗体，因此在鉴别野毒感染的同时能评价疫苗免疫效果，为实验筛猪、疫病流行学调查、疫苗效果评价和猪场猪瘟净化提供了新的高效的工具。

本发明还提供了一种用于检测猪瘟病毒抗体的试剂盒，该试剂盒包含上述免疫层析试纸，因此具有上述免疫层析试纸的所有有益效果，在此不再赘述。

本发明还提供一种免疫层析试纸或试剂盒在检测猪瘟病毒抗体中的用途。上述免疫层析试纸或试剂盒可为区分野毒感染与猪瘟病毒E0或E2亚单位疫苗免疫鉴别诊断提供重要技术指标。

本发明还提供了一种筛选猪瘟病毒感染猪的方法，其中猪为经猪瘟病毒E0亚单位疫苗或E2亚单位疫苗免疫的猪；该方法包括使用免疫层析试纸或试剂盒检测猪的血清中是否存在猪瘟病毒E0和/或E2的抗体；若同时存在两种抗体则所述猪为被猪瘟病毒感染的猪。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的胶体金检测卡平面结构区域图；

图2为本发明实施例1提供的胶体金检测卡组装前的纵切面结构图；

图3为本发明实施例1提供的胶体金检测卡组装后的纵切面结构图及操作示范图；

图4为本发明实施例1提供的胶体金检测卡结果判定参考示意图；

图5为本发明实施例2提供的试剂盒中的快速比色卡。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸，该试纸从加样端依次包被有捕捉抗体、检测抗原和质控抗体；其中，捕捉抗体为能够与猪源抗体结合的抗体，同时所述捕捉抗体经标记物标记；检测抗原包含猪瘟病毒的E0蛋白和E2蛋白；E0蛋白和E2蛋白为表达系统分别独立表达的蛋白；质控抗体为抗捕捉抗体抗体。

当待测样品从加样端流过捕捉抗体区域时，捕捉抗体可以和待测样品中的猪源抗体结合，形成猪源抗体-捕捉抗体-标记物复合物，当猪源抗体，例如猪瘟病毒E2抗体经捕捉抗体捕捉后，形成了猪瘟病毒E2抗体-捕捉抗体-标记物复合物，当该复合物中的猪瘟病毒E2抗体与免疫层析试纸上包被的E2蛋白结合后，由于标记了标记物，则会形成肉眼可见或仪器可检测的标记，例如标记胶体金可形成红色斑点，可达到快速检测待测样品中是否存在能够与检测抗原结合的抗体的目的。

本发明提供的免疫层析试纸可以将反应的时间大大缩短，仅需要数分钟就可以完成ELISA需数小时才能显示的结果。高浓度的抗体集中固定在固相载体的微孔中，待测抗原在层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。

本发明提供的免疫层析试纸包被的猪瘟病毒的E0蛋白和E2蛋白是表达系统独立表达的蛋白，并非融合蛋白，因此当待测样品中只包含猪瘟病毒的E0蛋白的抗体或E2蛋白的抗体时可以确定待测样品中存在的是何种抗体。

在一些可选的实施方式中，编码E0蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码E0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；在一些优选的实施方式中，E0蛋白和E2蛋白分别独立的为昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达的蛋白。

杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的病毒。杆状病毒可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。

昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus expressionvector system，IC-BEVS)具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点。昆虫细胞杆状病毒表达载体系统具有如下优势：①杆状病毒具有很好的安全性。②该系统与哺乳动物细胞表达系统相比载体构建周期短。③杆状病毒能容纳大分子的插入片段。④杆状病毒表达系统获得重组蛋白高水平的表达。⑤昆虫杆状病毒表达载体系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。⑥昆虫细胞杆状病毒表达载体系统是真核细胞表达系统，其表达的蛋白更接近于实际的蛋白的结构，因此其表达的蛋白上的抗原表位更接近于实际的蛋白，同时不易损失其构象抗原表位，使免疫层析试纸中的E0蛋白和E2蛋白更容易且更充分的与抗体结合。

由于抗体中多为IgG型抗体，因此捕捉抗体优选可以和猪IgG型抗体结合的抗体，例如可以为但不限于为鼠抗猪IgG抗体、兔抗猪IgG抗体或羊抗猪IgG抗体等，本发明对此不做限制。

需要说明的是，质控抗体为抗捕捉抗体抗体即可，即质控抗体为二抗，基于捕捉抗体的选取，质控抗体也优选与捕捉抗体IgG结合的抗体，例如当捕捉抗体为鼠抗猪IgG抗体时，质控抗体例如可以为但不限于为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体；当捕捉抗体为兔抗猪IgG抗体时，质控抗体例如可以为但不限于为羊抗兔IgG抗体或鼠抗兔IgG抗体；当捕捉抗体为羊抗猪IgG抗体时，质控抗体例如可以为但不限于为兔抗羊IgG抗体或鼠抗羊IgG抗体，本发明不限制其组合方式。在一些优选的实施方式中，所述捕捉抗体为小鼠抗猪IgG抗体，所述质控体抗体为羊抗小鼠lgG抗体。

在一些可选的实施方式中，所述标记物例如可以为但不限于为胶体金、乳胶或荧光标记物。在一些优选的实施方式中，所述捕捉抗体经胶体金标记。

胶体金是指金微小粒子(0-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，胶体金颗粒具有高电子密度的特性，用此金溶胶标记蛋白质(抗原或抗体)在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在固相载体上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。

当经过胶体金标记的抗体在本发明提供的免疫层析试纸上与抗原(E0蛋白和/或E2蛋白)结合后，包被有抗原的区域呈现红色或粉红色斑点，即可快速检验出待测样本中的是否含有E0蛋白抗体和/或E2蛋白抗体。

在一些可选的实施方式中，所述免疫层析试纸包括由金标探针膜制成的胶体金结合区和主要由层析检测膜制成的检测区；所述捕捉抗体包被于金标探针膜；所述检测抗原和所述质控抗体包被于层析检测膜。优选地，所述金标探针膜主要由聚酯膜或玻璃纤维膜制成；优选地，所述层析检测膜主要由PVDF膜或醋酸纤维素膜制成。

在一些可选的实施方式中，在所述层析检测膜设置检测线T_A和T_B；检测线T_A区域包被E0蛋白，检测线T_B区域包被E2蛋白，需要说明的是检测线T_A和T_B和E0蛋白和E2蛋白没有对应关系，检测线T_A的区域可以包被E0蛋白或E2蛋白，检测线T_B的区域也可以包被E0蛋白或E2蛋白；其中，检测线T_A和T_B的区域优选分别独立的包被E0蛋白和/或E2蛋白1-5μg；检测线T_A和T_B的宽度分别独立的优选为1-4mm。

在一些可选的实施方式中，所述免疫层析试纸还包括主要由样品垫制成的加样区和主要由吸水垫制成的吸水区；样品垫、金标探针膜、层析检测膜和吸水垫依次的相互部分重叠地固定于支撑板，组成免疫层析试纸。其中各部分的制作材料如下表所示：

需要说明的是，本发明的发明构思主要是基于待测样品中病毒抗体与本发明中选用的抗体的结合，因此只要不影响抗体抗原的结合，并且可以使待测样品层析的材料均可，本发明对此不做限制，例如制作吸水垫的吸水材料还可以为海绵、纱布、脱脂棉或吸水树脂等；又例如支撑板例如可以为但不限于为任意的有一定强度的板材均可。

本实施方式提供的免疫层析试纸具有如下有益效果：

(1)检测准确率高、特异性强：与其他猪易感病原体抗体没有交叉反应，检测灵敏度高。

(2)检测快速：检测时间只需5-10分钟，能够满足现场检测的需要。

(3)携带方便，操作简单：对操作人员不需要借助其它仪器设备，适合各级兽医院、猪场及个人使用。

(4)检测试纸在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达2年，且检测重复性好。

(5)能同时检测猪瘟病毒E0、E2两种抗体，在鉴别野毒感染的同时能评价疫苗免疫效果，为实验筛猪、疫病流行学调查、疫苗效果评价和猪场猪瘟净化提供了新的高效的工具。

(6)可用胶体金读数仪定量测定猪瘟E0、E2抗体，更好地反应样品抗体水平。

本发明还提供了一种检测猪瘟病毒抗体的试剂盒，该试剂盒包含了上述免疫层析试纸。因此具有上述免疫层析试纸的所有有益效果，在此不再赘述。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括反应缓冲液、猪瘟病毒E2抗体阳性对照、快检比色卡和一次性定量移液管，使检测更为方便。

在一些优选的实施方式中，快检比色卡为包被有已知抗体滴度的胶体金标记的抗体；以E2抗体为例，分别将猪瘟病毒E2抗体阳性对照稀释至抗体滴度为1:64、1:128、1:256、1:512和1:1024，然后分别包被于第一固相载体，每个第一固相载体上还设置有质控线。使用时先用胶体金读数仪测定抗体滴度为1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024共5个标准品的检测线色度，构建色度与E2抗体的标准曲线，然后用胶体金读数仪测定疫层析试纸检测待测样品后的检测线的色度，带入标准曲线中，即得待测样品中E2抗体的浓度。E0抗体的比色卡如上所述。

本发明还提供了一种上述免疫层析试纸或上述试剂盒在检测猪瘟病毒抗体中的用途。将本发明提供的免疫层析试纸或上述试剂盒应用于检测猪瘟病毒抗体，检测速度快，可应用于猪瘟病毒E0蛋白和/或E2蛋白，进一步的可应用于区分野毒感染猪和E0或E2亚单位疫苗感染猪。

本发明还提供了一种筛选猪瘟病毒感染猪的方法，所述方法包括使用免疫层析试纸或上述试剂盒检测猪的血清中是否存在猪瘟病毒E0和/或E2的抗体；若同时存在两种抗体则所述猪为被猪瘟病毒感染的猪；其中所述猪为经猪瘟病毒E0亚单位疫苗或E2亚单位疫苗免疫的猪。用猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫的猪只仅能检测到E2抗体，用猪瘟病毒E0亚单位疫苗免疫的猪只仅能检测到E0抗体，E0和E2抗体双阳性的猪为表明其可能感染野毒，需隔离观察，用其他抗体、病原检测方法进行验证后淘汰。E0或E2抗体呈阴性的猪只需尽快免疫猪瘟疫苗，避免病毒感染。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸及其制备方法

层析检测膜及其制备方法：

猪瘟病毒E0、E2蛋白真核表达及纯化：将带有His标签的E0、E2基因分别连接至杆状病毒表达载体，编码E0蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码E0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。筛选阳性克隆后，分别接种sf-9细胞进行表达，经蛋白印迹确定表达正确后，用镍亲和层析法纯化重组的E0、E2蛋白，并用双抗夹心ELISA法进行精确定量，用PBS(pH值7.4)稀释至50μg/ml，分装后置于-70度冻存备用。

检测线T_A、T_B和质控线C包被：取冻存的E0、E2蛋白及羊抗鼠IgG抗体，在硝酸纤维素膜上依次包被划线；检测线T_A包被猪瘟病毒E0蛋白1-5μg，检测线T_B包被猪瘟病毒E2蛋白1-5μg；质控线C包被羊抗小鼠IgG抗体1-5μg；每条线宽1-4mm，37度烘干2小时后置于装有干燥剂的密封袋中保存。

金标探针膜及其制备方法

小鼠抗猪IgG单抗的胶体金标记方法：取粒径为15-40nm，浓度为0.01％的胶体金及小鼠单克隆抗体，以0.5-2％的比例混匀，调节体系pH值至8.5-9.5，在室温下通过低速磁力搅拌振荡使其充分结合，加入0.05％的聚乙二醇(PEG 6000)及2％的牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，混匀后静置10分钟，以1000rpm离心15分钟，弃上清，离心管底深红色沉淀为小鼠抗猪IgG单抗与胶体金的复合物。

金标单抗涂覆：用含2％BSA、0.1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.1％聚乙二醇6000(PEG 6000)、0.2％脱脂奶粉(Dry Skim Milk)、0.04％酪蛋白(Casein)、0.02％叠氮钠(Sodium Azid)、0.3％吐温20(Tween-20)、2.5％葡萄糖(Glucose)的PBS(pH7.4)洗涤小鼠抗猪IgG单抗-胶体金复合物，离心弃上清，将深红色的沉淀用适量含2％BSA的PBS充分溶解，用喷涂设备均匀涂布于聚酯膜或玻璃纤维膜上0.1-0.2ml/cm²，真空干燥2小时后置于装有干燥剂的密封袋中保存。

垫片、膜片裁剪：依次取用作支撑板的聚乙烯板、样品垫的玻璃纤维膜、吸水滤纸、制备好的金标探针膜、层析检测膜，用切条机按照下表规格切成长方条状，备用，其中各部分的免疫层析试纸各组分规格如下表所示：

组分	长(cm)	宽(cm)	优选材料
				样品垫	30	3.0	玻璃纤维膜
金标探针膜	30	0.8	聚酯膜或玻璃纤维膜
				层析检测膜	30	2	硝酸纤维素膜
吸水垫	30	3	吸水滤纸
				支撑板	30	7.5	聚乙烯板

取层析检测膜的底面粘贴在粘有聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板上，两端分别粘贴裁好的金标探针膜和吸水垫，金标探针膜远离层析检测膜的一端上粘贴样品垫，外部用胶带包封，如图1-3所示，500为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯材料的支撑板；300为包被有重组E0、E2蛋白和羊抗小鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜，即检测区，301表示包被E0蛋白的检测线T_A，302表示包被E2蛋白的检测线T_B，303表示包被羊抗小鼠IgG抗体质控线C；200为涂覆了金标抗体的聚酯膜，即胶体金结合区；100为玻璃纤维膜构成的加样区；400为吸水滤纸，即吸水区。将制作好的免疫层析试纸置于装有干燥剂的密封袋中，常温干燥保存。

上述免疫层析试纸的使用方法可参考如下：

a)打开密封袋，取出免疫层析试纸，如图4A所示。

b)使用定量移液管将50μl的血清、血浆或全血样品滴加至加样区。

c)在加样区滴加3滴反应缓冲液(约100μl)。

d)等待10-15分钟后即可判读结果。

e)如需定量猪瘟病毒E2抗体，需用反应缓冲液将猪瘟病毒E2抗体阳性对照2倍梯度稀释至1:64，用胶体金读数仪测定1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024共5个标准品及待测样的T_B线色度，构建色度与中和抗体的标准曲线后，计算待测样的E2抗体效价。

结果判读：

(1)质控线C出现红色条带，表示免疫层析试纸有效，方可进行检测结果判读；若无表示此免疫层析试纸已失效、过期或操作不当，需重新测试；结果如图4中B-E所示：图4B表示待测样品中猪瘟病毒E0和E2抗体阳性；图4C表示待测样品中猪瘟病毒E0抗体阴性，E2抗体阳性；图4D表示待测样品中猪瘟病毒E0抗体阳性，E2抗体阴性；图4E表示待测样品中猪瘟病毒E0和E2抗体均为阴性。

(2)用胶体金读数仪测定滴度为1:64、1:128、1:256、1:512和1:1024共5个标准品及待测样的T_B线色度，构建色度与中和抗体的标准曲线后，计算待测样的E2抗体效价。

实施例2猪瘟病毒E0/E2抗体检测试剂盒

本实施例提供的试剂盒包括实施例3提供的免疫层析试纸，还包括反应缓冲液、猪瘟病毒E2抗体阳性对照、一次性定量移液管(50μl)和快检比色卡。

一次性定量移液管(50μl)如图3中600所示。

反应缓冲液配制：按以下配方配制反应缓冲液，在0.01mol/L的PBS(pH7.4)中添加0.1％的聚乙二醇6000(PEG 6000)、0.02％的叠氮钠(Sodium Azid)，充分溶解后分装至10ml聚乙烯滴瓶，备用。

猪瘟病毒E2抗体阳性对照：猪瘟病毒E2抗体阳性样品为猪瘟E2亚单位疫苗高免猪血清，经测定抗体滴度为1:1024。取阳性血清无菌分装至1.5ml离心管中，-20℃保存备用。

E2抗体快速比色卡：分别将猪瘟病毒E2抗体阳性对照稀释至抗体滴度为1:64、1:128、1:256和1:512，然后分别包被于第一固相载体，每个第一固相载体上还设置有质控线，如图5中A-D所示。其中图5A包被抗体滴度为1:64的E2抗体、图5B包被抗体滴度为1:128的E2抗体、图5C包被抗体滴度为1:256的E2抗体、图5D包被抗体滴度为1:512的E2抗体。

当T_B条带颜色与比色卡A相近，即无条带时，表示样品为猪瘟病毒E2抗体阴性；颜色深度与B相近时，表示样品为猪瘟病毒E2抗体弱阳性，抗体滴度介于1:16-1:64之间；颜色深度与C相近时，表示样品为猪瘟病毒E2抗体阳性，抗体滴度介于1:128-1:512之间；颜色深度与D相近时，表示样品为猪瘟病毒E2抗体强阳性，抗体滴度不低于512。

实施例3筛选猪瘟病毒感染猪

将猪瘟病毒抗体阴性的猪隔离饲养，其中50头免疫猪瘟病毒灭活疫苗(全病毒)，50头免疫猪瘟病毒E2亚单位疫苗，另10头不免疫，35天后采血测，使用实施例4提供的试剂盒检测猪血清中的抗体，按上述方法进行检测。免疫猪瘟病毒灭活疫苗(全病毒)E0抗体阳性率96％，免疫猪瘟病毒E2亚单位疫苗E0抗体阳性率0％，E2抗体阳性率100％，证明了上述试剂盒具有良好的敏感性和特异性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物股份有限公司

<120> 检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸、试剂盒和用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 856

<212> DNA

<213> 猪瘟病毒（Hogcholera virus, Swine fever virus）

<400> 1

aggaagaaac tagaaaaagc cctgttggct tgggcagtgg tagcaatcgt gctataccag 60

cctgtagcag ctgagaatat aactcaatgg aacctgagtg acaatggcac aaatggcatc 120

cagcgagcca tgtatcttag gggggttaat aggagcttgc acgggatctg gcctgaaaaa 180

atatgtaagg gagttcccac tcatctggcc accgatactg aactggcaga gatacgcggg 240

atgatggatg caagcgagag gacaaactac acatgctgta ggttacagag acacgaatgg 300

aacaaacatg gatggtgtaa ctggtacaac atagaccctt ggattcagtt aatgaacagg 360

acccaaacaa atttgacaga gggccctcca gataaagagt gtgccgtgac ttgcaggtac 420

gataaaaatg ccgatgtcaa cgtggtcacc caggccagaa ataggccaac cactctgact 480

ggttgcaaaa aagggaaaaa attttccttc gcaggtacag tcatagaagg cccatgcaat 540

ttcaacgtat ctgtggagga cattttatat ggagatcatg agtgcggcag cctgcttcag 600

gacacggctc tgtacctact ggatgggatg actaacacta tagagaatgc caggcaaggt 660

gcggcaaaag ttacatcatg gcttgggagg caacttagta tcgcagggaa gaagctagag 720

aggaggagca aaacttggtt cggcgcctat gccctgtcac cctactgcaa cgtaacaagg 780

aaaatagggt acatatggta cacaaacaat tgcaccccgg catgcctccc taagaacaca 840

tcaccatcac catcac 856

<210> 2

<211> 285

<212> PRT

<213> 猪瘟病毒（Hogcholera virus, Swine fever virus）

<400> 2

Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val Val Ala Ile

1 5 10 15

Val Leu Tyr Gln Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu

20 25 30

Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gln Arg Ala Met Tyr Leu Arg Gly

35 40 45

Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Lys Gly

50 55 60

Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Ala Glu Ile Arg Gly

65 70 75 80

Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln

85 90 95

Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp

100 105 110

Pro Trp Ile Gln Leu Met Asn Arg Thr Gln Thr Asn Leu Thr Glu Gly

115 120 125

Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn Ala

130 135 140

Asp Val Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr

145 150 155 160

Gly Cys Lys Lys Gly Lys Lys Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile Glu

165 170 175

Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp

180 185 190

His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gln Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu Asp

195 200 205

Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala Ala Lys Val

210 215 220

Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gln Leu Ser Ile Ala Gly Lys Lys Leu Glu

225 230 235 240

Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Cys

245 250 255

Asn Val Thr Arg Lys Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr Asn Asn Cys Thr

260 265 270

Pro Ala Cys Leu Pro Lys Asn His His His His His His

275 280 285

<210> 3

<211> 1137

<212> DNA

<213> 猪瘟病毒（Hogcholera virus, Swine fever virus）

<400> 3

cggctagcct gcaaggaaga ttacaggtac gcaatatcgt caaccgatga gatagggcta 60

cttggggccg gaggtctcac caccacctgg aaggaataca accacgattt gcaactgaat 120

gacgggaccg tcaaggccag ttgcgtggca ggttccttta aagtcacagc acttaatgtg 180

gtcagtagga ggtatttggc gtcattgcat aagaaggctt tacccacttc cgtgacattc 240

gagctcctgt tcgacgggac caacccatca actgaggaaa tgggagatga cttcaggtcc 300

gggctgtgcc cgtttgatac gagtcctgtt gttaagggaa agtacaatac gaccttgttg 360

aacggtagtg ctttctatct tgtctgccca atagggtgga cgggtgtcat agagtgcaca 420

gcagtgagcc caacaactct gaggacagaa gtggtaaaga ccttcaggag agacaagccc 480

tttccgcaca gaatggattg tgtgaccacc acagtggaaa atgaagattt attctattgt 540

aagttggggg gcaactggac atgtgtgaaa ggcgagccag tggtctacac agggggggta 600

gtaaaacaat gtagatggtg tggcttcgac ttcgatgggc ctgacggact cccgcattac 660

cccataggta agtgcatttt ggcaaatgag acaggttaca gaatagtaga ttcaacggac 720

tgtaacagag atggcgttgt aatcagcaca gaggggagtc atgagtgctt gatcggtaac 780

acgactgtca aggtgcatgc atcagatgaa agactgggcc ctatgccatg cagacctaaa 840

gagattgtct ctagtgctgg tcctgtaatg aaaacctcct gtacattcaa ctacacaaaa 900

actttgaaga acaggtacta tgagcccagg gacagctact tccagcaata tatgcttaag 960

ggtgagtatc agtactggtt tgacctggat gcgactgacc gccactcaga ttacttcgca 1020

gaatttgttg tcttggtggt ggtagcactg ttaggaggaa gatatgtcct gtggctgata 1080

gtgacctacg tagttttaac agaacaactc gccgctggtc atcaccatca ccatcac 1137

<210> 4

<211> 379

<212> PRT

<213> 猪瘟病毒（Hogcholera virus, Swine fever virus）

<400> 4

Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asp

1 5 10 15

Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu

20 25 30

Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ser Cys

35 40 45

Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe

65 70 75 80

Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp

85 90 95

Asp Phe Arg Ser Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys

100 105 110

Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val

115 120 125

Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro

130 135 140

Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro

145 150 155 160

Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu

180 185 190

Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Val Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly

195 200 205

Phe Asp Phe Asp Gly Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys

210 215 220

Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp

225 230 235 240

Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys

245 250 255

Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu

260 265 270

Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro

275 280 285

Val Met Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys Asn

290 295 300

Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys

305 310 315 320

Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala Thr Asp Arg His Ser

325 330 335

Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Val Val Leu Val Val Val Ala Leu Leu Gly

340 345 350

Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Ile Val Thr Tyr Val Val Leu Thr Glu

355 360 365

Gln Leu Ala Ala Gly His His His His His His

370 375

Claims

1.一种检测猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸，其特征在于，所述免疫层析试纸从加样端依次包被有捕捉抗体、检测抗原和质控抗体；

所述质控抗体为抗捕捉抗体抗体。

2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于，编码E0蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码E0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于，E0蛋白和E2蛋白分别独立的为昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达的蛋白。

4.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述标记物包括胶体金、乳胶或荧光标记物；优选胶体金。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述捕捉抗体经胶体金标记；

优选地，所述金标探针膜主要由聚酯膜或玻璃纤维膜制成；

6.根据权利要求5所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述层析检测膜设置检测线T_A和T_B；检测线T_A区域包被E0蛋白，检测线T_B区域包被E2蛋白；

优选地，检测线T_A包被E0蛋白1-5μg；

优选地，检测线T_B包被E2蛋白1-5μg；

优选地，检测线T_A和T_B的宽度分别独立的为1-4mm。

7.根据权利要求5所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述免疫层析试纸还包括主要由样品垫制成的加样区和主要由吸水垫制成的吸水区；

8.一种检测猪瘟病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的免疫层析试纸；

9.一种权利要求1-7中任一项所述的免疫层析试纸或权利要求8所述的试剂盒在筛选猪瘟病毒感染的猪中的用途。

10.一种筛选猪瘟病毒感染的猪的方法，其特征在于，所述方法包括检测猪的血清中是否存在猪瘟病毒E0和/或E2的抗体；若同时存在两种抗体则所述猪为被猪瘟病毒感染的猪；

所述猪为经猪瘟病毒E0亚单位疫苗或E2亚单位疫苗免疫的猪；

所述检测为使用权利要求1-7中任一项所述的免疫层析试纸或权利要求8所述的试剂盒检测。