CN112710844B - 用于检测新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体检测领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法。包括竞争法试剂盒和双夹心法试剂盒，竞争法试剂盒包括含有上转换发光颗粒标记的重组S‑RBD‑C抗原的检测卡，双夹心法试剂盒包含内含有上转换发光颗粒标记的重组S‑RBD‑C抗原或上转发光颗粒标记的S1抗原的检测卡，重组S‑RBD‑C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，用于与S‑RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键。本发明的试剂盒可广泛用于监测接种新型冠状病毒疫苗后的受试者或感染新型冠状病毒后人体内是否产生中和抗体，并对产生的中和抗体效价进行半定量评价，且操作简单。

Description

用于检测新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及抗体检测领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法。
背景技术
冠状病毒分为α、β、γ、δ等4个属，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属，可引起严重呼吸系统相关疾病。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)表面棘突蛋白(S蛋白)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，包含S1、S2两个亚基，其中S1蛋白亚基包含S蛋白受体结合区(S-RBD蛋白)，S-RBD蛋白与人细胞表面的ACE2相互作用，致使新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进入人细胞并导致感染，S-RBD蛋白是新型冠状病毒中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。
新型冠状病毒中和抗体是接种新型冠状病毒疫苗或感染新型冠状病毒后人体产生的一种具有保护作用的抗体，中和抗体具有识别新型冠状病毒的表面S-RBD蛋白、阻断S-RBD与细胞表面特异性受体(ACE2)结合的功能，发挥抗病毒作用。中和抗体是否产生及其产生数量或效价是接种新冠疫苗后一项重要免疫保护效果指标，也是疫苗评估和质控的重要依据，同时也可以用于评估新型冠状病毒感染后的治疗效果及其治愈评价的重要指标之一。
目前中和抗体检测主要方法为中和抗体病毒滴度试验，该方法操作复杂，检测周期长，生物安全等级要求高；不适用于疫苗接种后大范围人群进行接种疫苗后的评价。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的竞争法半定量试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的双抗原法半定量试剂盒。
本发明的第三发明目的在于提供一种用于检测接种新冠状病毒疫苗后新冠状病毒中和抗体的方法。
为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的竞争法半定量试剂盒，所述试剂盒包括：中和性抗体竞争法检测卡、样品稀释液、用于半定量检测的比色卡；
所述中和性抗体竞争法检测卡内含有胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原；
所述重组S-RBD-C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，所述附加氨基酸序列用于与S-RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键；优选的，所述附加氨基酸序列中含有奇数个半胱氨酸，进一步优选的，所述附加氨基酸序列中含有1个半胱氨酸。
可选的，所述中和性抗体竞争法半定量检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，所述冻干试剂垫上标记有所述胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。
可选的，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被有人源重组可溶性ACE2，所述包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL；所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体，所述包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL。
本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的双抗原法半定量试剂盒，所述试剂盒包括：中和性抗体双抗原法检测卡、样品稀释液、用于半定量检测的比色卡；
所述中和性抗体双抗原法检测卡内含有胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原或胶体金示踪颗粒标记S1抗原；
所述重组S-RBD-C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，所述附加氨基酸序列用于与S-RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键；优选的，所述附加氨基酸序列中含有奇数个半胱氨酸，进一步优选的，所述附加氨基酸序列中含有1个半胱氨酸。
可选的，所述中和性抗体半定量检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，所述冻干试剂垫上标记有所述胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原胶体金示踪颗粒标记S1抗原。
可选的，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被有重组新型冠状病毒S1抗原或重组S-RBD-C抗原，所述包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL；所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体，所述包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL。
可选的，所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
可选的，所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列还包括Fc标签序列和/或FP信号肽结合位点序列，
和/或，Fc标签序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，
和/或，FP信号肽结合位点序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；
和/或，所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
可选的，所述样品稀释液的组成为磷酸二氢钾0.2～0.3g/L、磷酸氢二钠1.4～0.15g/L、氯化钠7～9g/L、氯化钾0.1～0.3g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.08～0.16％；所述样品稀释液的优选为磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.1％。
可选的，所述用于半定量检测的比色卡包括中和抗体效价为1:8显色条带、中和抗体效价为1:64显色条带。
可选的，所述试剂盒的检测样本为接种新冠状病毒疫苗后的人体血液样本和/或感染新冠状病毒后的人体血液样本。
本发明还涉及一种用于检测接种新冠状病毒疫苗后新冠状病毒中和抗体的方法，采用上述竞争法试剂盒进行检测；
和/或，判定方法包括：
所述中和性抗体检测卡检测后颜色＞所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带，则新型冠状病毒中和抗体低表达或未表达；
所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带≤所述中和性抗体检测卡检测后颜色≤所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带，表示新型冠状病毒中和抗体正常表达；
所述中和性抗体检测卡检测后颜色＜所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带、或未显色，表示新型冠状病毒中和抗体高表达。
本发明还涉及一种用于检测接种新冠状病毒疫苗后新冠状病毒中和抗体的方法，采用上述双抗原发试剂盒进行检测；
和/或，判定方法包括：
所述中和性抗体检测卡检测后颜色＜所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带、或未显色，表示新型冠状病毒中和抗体低表达或未表达；
所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带≤所述中和性抗体检测卡检测后颜色≤所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带，表示新型冠状病毒中和抗体正常表达；
所述中和性抗体检测卡检测后颜色＞所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带，表示新型冠状病毒中和抗体高表达。
本发明至少具有以下有益的效果：
与现有技术相比，通过本发明应用，可广泛用于监测接种新型冠状病毒疫苗后的受试者或感染新型冠状病毒后人体内是否产生中和抗体，并对产生的中和抗体效价进行半定量评价，且操作简单，检测时间仅15min。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为重组S-RBD-C-hFc抗原和重组S-RBD-hFc抗原的SDS-PAGE电泳图；
图2为重组S-RBD-C-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测结果；
图3为重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测结果；
图4为基于竞争法原理的中和性抗体半定量检测的比色卡；
图5为基于双抗原夹心法原理的中和性抗体半定量检测的比色卡。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
针对现有技术的不足，本发明实施例提供了一种用于检测新冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒。本发明应用可广泛用于监测接种新型冠状病毒疫苗后的受试者或感染新型冠状病毒后人体内是否产生中和抗体，并对产生的中和抗体效价进行半定量评价。
本发明实施例提出一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的竞争法半定量试剂盒，包括：中和性抗体竞争法检测卡、样品稀释液、用于半定量检测的比色卡；中和性抗体竞争法检测卡内含有胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。
本发明实施例提出一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的双抗原法半定量试剂盒，包括：中和性抗体双抗原法检测卡、样品稀释液、用于半定量检测的比色卡；中和性抗体双抗原法检测卡内含有胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原或胶体金示踪颗粒标记S1抗原。
已公开S-RBD的全序列中包含9个半胱氨酸形成的9个二硫键，无法形成完整的配对，容易在后期重组抗原表达过程中形成二聚体，影响重组抗原的检测效果。S-RBD全序列如SEQ ID No.2所示：
SEQ ID No.2：
NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE。
为此，本发明实施例的重组S-RBD-C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，该附加氨基酸序列用于与S-RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键，优选的，附加氨基酸序列中含有奇数个半胱氨酸。
进一步优选含有1个半胱氨酸，从而使重组S-RBD-C抗原氨基酸序列具备10个半胱氨酸，形成5对二硫键，减少二聚体的产生。
进一步可选的，重组S-RBD-C抗原包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列：
SEQ ID No.1：
NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS。
为增加重组S-RBD-C抗原的表达和可溶性，重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列还可以进一步包括Fc标签序列和/或FP信号肽结合位点序列，优选的，Fc标签序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，更优选的，FP信号肽结合位点序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。
Fc标签序列SEQ ID No.4：
MDFGLSLVFLVLILKGVQCRVQPTESIVRFP
FP信号肽结合位点序列SEQ ID No.5：
ASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGKZGS
进一步可选的，重组S-RBD-C抗原包含SEQ ID No.3所示的氨基酸序列：
SEQ ID No.3序列：
MDFGLSLVFLVLILKGVQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSASEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GKZGS。
本发明实施例用于检测新型冠状病毒中和抗体的竞争法半定量试剂盒包括新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡，具体包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板；冻干试剂垫上标记有胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。
包被硝酸纤维素膜上的T线包被有人源重组可溶性ACE2，包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL；包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体，包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL。
本发明实施例用于检测新型冠状病毒中和抗体的双夹心法半定量试剂盒包括新型冠状病毒中和性抗体双夹心检测卡，具体包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板；包被硝酸纤维素膜上的T线包被有重组新型冠状病毒S1抗原或重组S-RBD-C抗原，包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL；包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体，包被的浓度优选为0.5～1.0mg/mL。
其中，重组新型冠状病毒S1抗原为市售抗原，羊多抗为羊抗鼠IgG多抗。
具体的，样品稀释液的组成为磷酸二氢钾0.2～0.3g/L、磷酸氢二钠1.4～0.15g/L、氯化钠7～9g/L、氯化钾0.1～0.3g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.08～0.16％；样品稀释液的优选为磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.1％。
具体的，用于半定量检测的比色卡包括中和抗体效价为1:8显色条带、中和抗体效价为1:64显色条带。竞争法原理的半定量检测比色卡如图4所示、双抗原夹心法原理的半定量检测比色卡如图5所示。
本发明实施例试剂盒的检测样本为接种新冠状病毒疫苗后的人体血液样本和/或感染新冠状病毒后的人体血液样本。
本发明实施例试剂盒的使用方法为：取20～30μL样品(吸管吸取约1滴)，加入新型冠状病毒中和性抗体检测卡的样品孔中，再加入80μL样品稀释液(吸管吸取约3滴)，10～30℃静置孵育15分钟，与半定量检测的比色卡进行颜色比对并判定结果。
2、结果判定
1)竞争法原理的中和性抗体半定量检测检测结果与竞争法原理的半定量检测比色卡进行颜色比对，进行结果判定：包括：
新型冠状病毒中和性抗体检测卡检测后颜色＞用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带，则新型冠状病毒中和抗体低表达或未表达；
用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带≤新型冠状病毒中和性抗体检测卡检测后颜色≤用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带，表示新型冠状病毒中和抗体正常表达；
新型冠状病毒中和性抗体检测卡检测后颜色＜用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带、或未显色，表示新型冠状病毒中和抗体高表达；
2)双抗原夹心法原理的中和性抗体半定量检测结果与双抗原夹心法原理的半定量检测比色卡进行颜色比对，进行结果判定：包括：
新型冠状病毒中和性抗体检测卡检测后颜色＜中和抗体效价为1:8显色条带或未显色，表示新型冠状病毒中和抗体低表达或未表达；
中和抗体效价为1:8显色条带≤新型冠状病毒中和性抗体检测卡检测后颜色≤中和抗体效价为1:64显色条带，表示新型冠状病毒中和抗体正常表达；
新型冠状病毒中和性抗体检测卡检测后颜色＞中和抗体效价为1:64显色条带，表示新型冠状病毒中和抗体高表达。
本发明还涉及一种用于检测接种新冠状病毒疫苗后新冠状病毒中和抗体的方法，采用上述试剂盒进行检测，判定方法同上。
实施例1重组S-RBD-C抗原制备
采用商品化293T细胞系转染、表达氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的重组S-RBD-C-hFc抗原，并在细胞培养箱内培养48h～96h后，收集细胞培养上清，分离纯化，SDS-PAGE检测蛋白纯度≥90％，蛋白浓度≥1mg/mL，抗原效价≥1:10000。
采用同样的方法转染、表达氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，未增加半胱氨酸的重组S-RBD-hFc抗原。
SEQ ID No.6所示：
MDFGLSLVFLVLILKGVQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEASEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKZGS。
取20μg上述表达后的重组抗原，采用通用SDS-PAGE电泳步骤检测重组S-RBD-C-hFc抗原和重组S-RBD-hFc抗原，如图1所示，重组S-RBD-C-hFc抗原基本无明显二聚体表达，而重组S-RBD-hFc抗原存在明显二聚体表达导致蛋白纯度较低。
采用Fortebio Octet全自动检测技术平台，利用BLI生物膜干涉技术分别检测重组S-RBD-C-hFc抗原、重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力，结果如图2、图3所示：
重组S-RBD-C-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测指标的平衡解离常数KD＝6.52×10-9M(图2)；
重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测指标的平衡解离常数KD＝1.36×10-8M(图3)；
平衡解离常数KD越小，说明两者解离越少，代表两者的亲和力越强。
依据平衡解离常数KD数值分析，重组S-RBD-C-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力超过重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力10倍。
实施例2竞争法新型冠状病毒中和性抗体检测卡制备
1)包被硝酸纤维素膜制备：
包被缓冲液：0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.0～7.5；T线包被商品化的人源重组可溶性ACE2，购自于SinoBiological，包被浓度为1.0mg/ml；C线包被商品化的羊抗鼠IgG多抗(购自于Invitrogen)，包被浓度为1.0mg/mL。采用全自动三维划膜仪在硝酸纤维素膜上包被质控线和检测线，18～25℃干燥30～60min，使用含2％BSA浓度的0.01mol/L的PBST缓冲溶液浸泡封闭硝酸纤维素膜30～60min，37℃干燥30～60min，室温干燥保存备用。
2)金标结合物垫制备：
加热煮沸0.01％的氯金酸溶液，并加入1％浓度的柠檬酸三钠溶液，每100mL氯金酸溶液加入3～4mL柠檬酸三钠溶液，继续加热至溶液为亮红色或紫色，停止加热恢复至室温，调节pH为7.0～7.2，加入重组新型冠状病毒S-RBD-C抗原，重组S-RBD-C抗原终浓度为10μg/mL，混匀，室温静置30min，15000rpm离心30min，去掉上清液，用于氯金酸溶液等体积的标记清洗液清洗沉淀3次，用等体积胶体金保存液重悬标记后胶体金颗粒，2～8℃保存备用。
取玻璃纤维，放在托盘上备用，用标记后的胶体金颗粒溶液均匀铺浇在玻璃纤维上，每mL胶体金溶液约铺浇10cm2玻璃纤维，放入超低温冰箱进行预冷冻，再放入真空冷冻干燥机中冻干，冻干时间6h以上，冻干后胶体金结合物垫室温干燥保存备用。
3)检测卡制备
将胶体金结合物垫裁切成约0.5cm宽度长条，将裁切后的胶体金结合物垫、包被后的硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维按顺序贴在底板上，组装成胶体金检测卡大板，按照3～4mm宽度裁切，装入卡壳，与干燥剂一起装入铝箔袋密封，制备成检测卡。
实施例3双抗原夹心法新型冠状病毒中和性抗体检测卡制备
1)包被硝酸纤维素膜制备：
包被缓冲液：0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH7.0～7.5；T线包被抗原为重组新型冠状病毒S-RBD-C抗原，包被浓度为1.0mg/mL；C线为商品化的羊抗鼠IgG多抗(购自于Invitrogen)，包被浓度为1.0mg/ml。采用全自动三维划膜仪在硝酸纤维素膜上包被质控线和检测线，18～25℃干燥30～60min，使用含2％BSA浓度的0.01mol/L的PBST缓冲溶液浸泡封闭硝酸纤维素膜30～60min，37℃干燥30～60min，室温干燥保存备用。
2)金标结合物垫制备：
加热煮沸0.01％的氯金酸溶液，并加入1％浓度的柠檬酸三钠溶液，每100mL氯金酸溶液加入3～4mL柠檬酸三钠溶液，继续加热至溶液为亮红色或紫色，停止加热恢复至室温，调节pH为7.0～7.2，加入新型冠状病毒标记抗原(重组S1抗原，购自于SinoBiological)，重组S1抗原终浓度为10μg/mL，混匀，室温静置30min，15000rpm离心30min，去掉上清液，用于氯金酸溶液等体积的标记清洗液清洗沉淀3次，用等体积胶体金保存液重悬标记后胶体金颗粒，2～8℃保存备用。
取玻璃纤维，放在托盘上备用，用标记后的胶体金颗粒溶液均匀铺浇在玻璃纤维上，每mL胶体金溶液约铺浇10cm2玻璃纤维，放入超低温冰箱进行预冷冻，再放入真空冷冻干燥机中冻干，冻干时间6h以上，冻干后胶体金结合物垫室温干燥保存备用。
3)检测卡制备
将胶体金结合物垫裁切成约0.5cm宽度长条，将裁切后的胶体金结合物垫、包被后的硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维按顺序贴在底板上，组装成胶体金检测卡大板，按照3～4mm宽度裁切，装入卡壳，与干燥剂一起装入铝箔袋密封，制备成检测卡。
在本实施例的双抗原夹心法新型冠状病毒中和性抗体检测卡制备中包被用重组S-RBD抗原、标记用重组S1抗原可以相互替换为包被抗原为重组S1抗原，标记抗原为重组S-RBD抗原，对结果实现无实质影响。
实施例4样本稀释液和半定量检测的比色卡制备
1、样本稀释液为pH 7.4的PBS-T缓冲液，配方如下：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g/L；
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g/L；
氯化钠(NaCl)：8g/L；
氯化钾(KCl)：0.2g/L；
吐温-20：0.05％。
2、半定量检测的比色卡
采用常规中和抗体滴度试验方法确定对标标准样本抗体效价，包括1:8、1:64两种效价浓度，采用实施案例2、3中的新型冠状病毒中和性抗体检测卡和本实施案例中的样品稀释液分别检测1:8、1:64两种稀释度的标准样本20次，根据1:8、1:64两种稀释度样本检测20次的颜色，确定每种稀释度的颜色浓度，并印刷制成包含图4或图5内容的比色卡，即为半定量检测的比色卡。其中：基于竞争法原理的中和性抗体半定量检测的比色卡如图4所示；基于双抗原夹心法原理的中和性抗体半定量检测的比色卡如图5所示。
实施例5
按照本发明实施例的方法分别检测20例正常人血液样本，20例流感、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒等呼吸道感染或肺炎患者样本，20例新型冠状病毒肺炎确诊患者样本和新型冠状病毒无症状感染者样本，检测结果如下：
1)竞争法原理的新型冠状病毒中和性抗体半定量检测结果
20例正常人血液样本，20例流感、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒等呼吸道感染或肺炎患者样本的共计40例样本检测中，T线颜色均＞1:8显色条带，均检测为阴性，试剂特异性良好。
20例新型冠状病毒肺炎确诊患者样本和新型冠状病毒无症状感染者样本中：13例中和抗体检测效价＞1:64，6例中和抗体检测效价在1:8-1:64之间，1例中和抗体检测效价＜1:8，检测结果如表1所示。
2)双抗原夹心法原理的新型冠状病毒中和性抗体半定量检测结果
20例正常人血液样本，20例流感、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒等呼吸道感染或肺炎患者样本的共计40例样本检测中，T线均未显色，40例样本均检测为阴性，试剂特异性良好。
20例新型冠状病毒肺炎确诊患者样本和新型冠状病毒无症状感染者样本中：13例中和抗体检测效价＞1:64，6例中和抗体检测效价在1:8-1:64之间，1例中和抗体检测效价＜1:8，检测结果如表1所示。
表1竞争法和双抗原夹心法中和抗体检测结果对比
Figure BDA0002839838800000151
综上，基于本发明的竞争法和双抗原夹心法检测中抗体，并对其进行半定量评价，两种原理的检测结果一致，均能达到相同的效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 北京热景生物技术股份有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 2019-nCoV
<400> 1
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys
195 200 205
Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu
210 215 220
Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala
225 230 235 240
Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp
245 250 255
Ile Thr Pro Cys Ser
260
<210> 2
<211> 253
<212> PRT
<213> 2019-nCoV
<400> 2
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys
195 200 205
Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu
210 215 220
Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala
225 230 235 240
Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu
245 250
<210> 3
<211> 529
<212> PRT
<213> 2019-nCoV
<400> 3
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn
20 25 30
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
35 40 45
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
50 55 60
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
65 70 75 80
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
85 90 95
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
100 105 110
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
115 120 125
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
130 135 140
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
145 150 155 160
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
165 170 175
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
180 185 190
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
210 215 220
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val
225 230 235 240
Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser
245 250 255
Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp
260 265 270
Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile
275 280 285
Thr Pro Cys Ser Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
290 295 300
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
305 310 315 320
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
325 330 335
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
340 345 350
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
355 360 365
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
370 375 380
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
385 390 395 400
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
405 410 415
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
420 425 430
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
435 440 445
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
450 455 460
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
465 470 475 480
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
485 490 495
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
500 505 510
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glx Gly
515 520 525
Ser
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro
20 25 30
<210> 5
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
35 40 45
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
50 55 60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
85 90 95
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
100 105 110
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
115 120 125
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
130 135 140
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
165 170 175
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
195 200 205
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glx Gly Ser
225 230 235

Claims (6)

1.一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的竞争法半定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：中和性抗体竞争法检测卡、样品稀释液、用于半定量检测的比色卡；
所述中和性抗体竞争法检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，所述冻干试剂垫上标记有胶体金示踪颗粒标记的重组S-RBD-C抗原；
所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列为如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被有人源重组可溶性ACE2，所述包被的浓度为0.5~1.0mg/mL；所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体，所述包被的浓度为0.5~1.0 mg/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液的组成为磷酸二氢钾0.2 ~ 0.3g/L、磷酸氢二钠1.4 ~ 1.5g/L、氯化钠7 ~ 9 g/L、氯化钾0.1 ~ 0.3 g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.08 ~ 0.16 %。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为磷酸二氢钾0.24 g/L、磷酸氢二钠1.44 g/L、氯化钠8 g/L、氯化钾0.2 g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.1%。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于半定量检测的比色卡包括中和抗体效价为1:8显色条带、中和抗体效价为1:64显色条带。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为接种新型冠状病毒疫苗后的人体血液样本和/或感染新型冠状病毒后的人体血液样本。
6.一种用于检测接种新型冠状病毒疫苗后新型冠状病毒中和抗体的方法，其特征在于，采用权利要求1~5任一项所述的试剂盒进行检测；
判定方法包括：
中和性抗体竞争法检测卡检测后颜色＞用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带，则新型冠状病毒中和抗体低表达或未表达；
所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带≤所述中和性抗体竞争法检测卡检测后颜色≤所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:8显色条带，表示新型冠状病毒中和抗体正常表达；
所述中和性抗体竞争法检测卡检测后颜色＜所述用于半定量检测的比色卡上中和抗体效价为1:64显色条带、或未显色，表示新型冠状病毒中和抗体高表达。
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