CN109596824A - 一种快速诊断莱姆病的检测试纸及其制备方法 - Google Patents

一种快速诊断莱姆病的检测试纸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速诊断莱姆病的检测试纸及其制备方法。ELISA检测莱姆病方法的检测时间较长，不适合基层检测。本发明一种快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸，包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。所述的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次排列相连，且均设置在底板上。硝酸纤维素膜上设置有第一检测线、第二检测线和质控线。第一检测线处设置有鼠抗人IgM单克隆抗体。第二检测线处设置有鼠抗人IgG单克隆抗体。质控线处设置有羊抗鼠IgG多克隆抗体。所述的金标垫上设置有莱姆病重组抗原‑胶体金偶联物。本发明检测时间短，检测准确率高、特异性强，操作简便，不需要借助其他设备仪器。

Description

一种快速诊断莱姆病的检测试纸及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸及其制备方法。
背景技术
莱姆病是一种以蜱为媒介的螺旋体感染性疾病，是由伯氏疏螺旋体所致的自然疫源性疾病。我国于1985年首次在黑龙江省林区发现本病病例，以神经系统损害为该病最主要的临床表现。其神经系统损害以脑膜炎、脑炎、颅神经炎、运动和感觉神经炎最为常见。其中一期莱姆病仅用抗生素即可奏效，至二期、三期用抗生素无济于事，特别是神经系统损害更乏特效疗法。早期以皮肤慢性游走性红斑为特点，以后出现神经、心脏或关节病变，通常在夏季和早秋发病，可发生于任何年龄，男性略多于女性。发病以青壮年居多，与职业相关密切。以野外工作者、林业工人感染率较高。
目前，针对莱姆病的血清学检测方法主要包括间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白免疫印迹试验(WB)。间接免疫荧光实验(IFA)是将菌体固定于载体上，加上病人的血清，在用萤光二抗来显色，其灵敏度低，人为干扰因素比较多；蛋白免疫印迹试验(WB)操作比较复杂，一般实验室不易做到，不易推广；酶联免疫吸附试验(ELISA)主要对莱姆病特异抗体进行检测，传统ELISA检测方法，存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易误诊；这些方法都是适用于实验室研究，检测时间较长，不适合基层检测，因此，迫切需要研发一种更简便、更快速的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸及其制备方法。采用该试纸具有操作简便、快速，结果显示直观、准确，灵敏度高、特异性好，且能区分早期感染(IgM)和后期感染(IgG)，同时由于投资和检测成本低，应用范围广等特点，也能广泛应用于基层样品检测。
本发明一种快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸，包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。所述的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次排列相连，且均设置在底板上。硝酸纤维素膜上设置有第一检测线、第二检测线和质控线。第一检测线处设置有鼠抗人IgM单克隆抗体。第二检测线处设置有鼠抗人IgG单克隆抗体。质控线处设置有羊抗鼠IgG多克隆抗体。所述的金标垫上设置有莱姆病重组抗原-胶体金偶联物。
进一步地，所述的第二检测线位于第一检测线与质控线之间。所述的第一检测线位于金标垫与第二检测线之间。所述的质控线位于吸水垫与第二检测线之间。所述第一检测线、第二检测线的间距以及第二检测线、质控线的间距均为0.3cm。
进一步地，所述莱姆病重组抗原-胶体金偶联物内胶体金的直径为30～70nm。
进一步地，所述底板的材质为聚苯乙烯。
该快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体步骤如下：
步骤1：检测线、质控线的添加：用点膜仪将鼠抗人IgM单克隆抗体溶液、鼠抗人IgG单克隆抗体溶液、羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液按照1ul/cm的速度分别包被在硝酸纤维素膜上，鼠抗人IgM单克隆抗体溶液形成第一检测线3，鼠抗人IgG单克隆抗体溶液形成第二检测线4，羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液形成质控线5。之后将硝酸纤维素膜放置于37℃温度下烘干。
步骤2：金标垫的制备：用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液。用0.2mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.5。将莱姆病重组抗原按照1:1的体积比加入到胶体金溶液中。标记20min后，向胶体金溶液中添加10％的BSA水溶液，至BSA的终浓度为1％；搅拌30min后，向胶体金溶液中添加10％的PEG20000，至PEG20000的终浓度为0.2％；搅拌10min后，4℃、10000rpm离心30min，得到纯化的莱姆病重组抗原-胶体金偶联物；将莱姆病重组抗原-胶体金偶联物稀释后包被于玻纤上，并进行冷冻干燥处理，得到金标垫。
步骤3：将硝酸纤维素膜固定到底板的中部。将金标垫粘接到底板上，使得金标垫与硝酸纤维素膜连接。将样品垫、吸水垫粘贴在底板上，使得样品垫与金标垫远离硝酸纤维素膜的那端连接，吸水垫与硝酸纤维素膜远离金标垫的那端连接。
进一步地，步骤1中，所述第一检测线包被的鼠抗人IgM单克隆抗体的使用浓度为0.3～1.0mg/ml。所述第二检测线包抗的鼠抗人IgG单克隆抗体的使用浓度为0.3～1.0mg/ml。所述质控线包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体的使用浓度为1.0～3.0mg/ml。
进一步地，步骤2中，包被上玻纤的莱姆病重组抗原-胶体金偶联物的浓度稀释为OD1-OD4。
进一步地，步骤2中用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤如下：在沸腾的0.01％质量浓度的氯金酸水溶液中加入的1％质量浓度的柠檬酸三钠水溶液。柠檬酸三钠水溶液与氯金酸水溶液的体积比为5:1。
进一步地，步骤3执行后，将底板裁剪至宽度等于3.75mm。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明检测时间短，仅需10-20min，能够满足现场检测的需要。
2、本发明检测准确率高、特异性强，操作简便，不需要借助其他设备仪器。
3、本发明检测结果显示直观，肉眼就可判断，适合个人使用。
4、本发明检测试纸可在常温下保存，无需特殊的设备仪器，只需保持试纸条干燥即可，保存期可达2年。
附图说明
图1为本发明的整体结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
如图1所示，实施例1：莱姆病重组抗原的制备
(1)含有莱姆病重组抗原的表达
在NCBI中寻找含有莱姆主要抗原表位蛋白群，BmpA(NCBI Reference Sequence:WP_002656850.1),OspC(NCBI Reference Sequence:WP_010890595.1)和VlsE(GenBank:ACC99642.1)分析上述三种蛋白的抗原表位，选取了其中最优势的抗原表位进行基因重组表达，由于目的重组蛋白需要在大肠杆菌进行外源基因重组表达，所以在选取优势抗原表位后对密码子进行优化，以确保目的蛋白顺利进行高产量高可溶性表达。
将密码子优化后基因重组序列用BamHI和SalI限制性内切酶(购自NEB公司，即NewEngland Biolabs)进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)中将构建成功且测序验证正确的的莱姆病重组表达载体质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含50ug/ml卡那霉素(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：K0408)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的卡那霉素的300ml LB培养基37℃培养至OD600达0.6～0.8左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h。诱导之后，将培养液4℃，转速7000rpm，离心10min，收集菌体。
(2)含有莱姆病重组抗原的纯化及复性
在50ml上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)中加入50ml步骤(1)所得菌体；然后超声破碎，条件为功率400W，单次超声时长3s，间隔6s，共90次；然后12000rpm，30min，4℃离心收集上清，目的蛋白在上清中。进行Ni2+柱一步纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mM Tris，0.2M Nacl，0.5M Imidazole，pH8.0)在Ni+柱上洗脱目的蛋白。将纯化后的目的蛋白用透析缓冲液(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)透析，每隔12h换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0.22um滤器过滤后，用BCA法测定浓度后，于-20℃保存备用。
实施例2：莱姆病重组抗原-胶体金偶联物的制备
(1)胶体金的制备
用超纯水将1％的氯金酸稀释成0.01％(质量百分含量)，加入到100ml的锥形瓶中，用加热磁力搅拌器加热煮沸。而后准确吸取1％的柠檬酸三钠2.0ml缓慢加入到锥形瓶中，搅拌均匀后，继续加热直到溶液由黑色变为灰色后变为红色，加入适量的0.02％的NaN3搅拌均匀后，得到胶体金溶液，放置于4℃保存。新制的合格的胶体金溶液应该是外观纯净、稳定、透亮、无沉淀物和漂浮物的溶液。制备好后，置于电镜下观察，选择适宜直径的胶体金颗粒。
(2)标记物的制备
在磁力搅拌器的避光搅拌下，用0.2mol/L的K2CO3溶液调整胶体金溶液的pH值到8.5；将莱姆病重组抗原按照1:1的体积比加入到胶体金溶液中，加入时应缓慢遂滴加入，速度不宜过快，防止标记不均匀。避光搅拌20min后，加入10％牛血清白蛋白(BSA)，使牛血清白蛋白的溶液终浓度达到1％。继续搅拌30min后，加入10％PEG20000，使PEG20000的溶液终浓度达到0.2％，继续搅拌10min后，以10000r/min 4℃离心30min，弃去上清，放置于4℃保存，并利用紫外分光光度计测得OD值。
实施例3：快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸的制备
如图1所示，一种快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸，包括底板8、样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜6和吸水垫7。样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜6、吸水垫7依次排列粘接相连，且均设置在底板8上。硝酸纤维素膜6上设置有第一检测线3、第二检测线4和质控线5。第一检测线3处设置有鼠抗人IgM单克隆抗体。第二检测线4处设置有鼠抗人IgG单克隆抗体。质控线5处设置有羊抗鼠IgG多克隆抗体。金标垫2上设置有实施例2中制得的莱姆病重组抗原-胶体金偶联物。第二检测线4位于第一检测线3与质控线5之间。第一检测线3位于金标垫与第二检测线4之间。质控线5位于吸水垫与第二检测线4之间。第一检测线3、第二检测线4的间距以及第二检测线4、质控线5的间距均为0.3cm。莱姆病重组抗原-胶体金偶联物的胶体金直径为30～70nm，莱姆病重组抗原浓度为1mg/ml。莱姆病重组抗原-胶体金偶联物的使用浓度为OD1-OD4。
该快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸的具体制备方法如下：
(1)硝酸纤维素膜的处理
将硝酸纤维素膜粘于底板的中部，备用。用含有1％(质量浓度)蔗糖溶液的PBS溶液分别将鼠抗人IgM单克隆抗体、鼠抗人IgG单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释，分别得到浓度为0.3～1.0mg/ml的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液、浓度为0.3～1.0mg/ml的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液、浓度为1.0～3.0mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液。用点膜仪将配制好的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液、鼠抗人IgG单克隆抗体溶液、羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液按照1ul/cm的速度间距0.3cm分别包被在硝酸纤维素膜上，鼠抗人IgM单克隆抗体溶液形成第一检测线3，鼠抗人IgG单克隆抗体溶液形成第二检测线4，羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液形成质控线5。将制备好后的硝酸纤维素膜放置于37℃烘干干燥12～24小时，加干燥剂用铝箔袋封好备用。
(2)金标垫的制备
金标垫的制备采用低温冷冻干燥的方法：按每张玻纤的尺寸计算好所需要的金标溶液的体积，将实施例2中制得的莱姆病重组抗原-胶体金偶联物按OD1～OD4的浓度(此处为用吸光度表达浓度)稀释后，均匀涂抹在玻纤上。然后将玻纤放置到不锈钢网架上。将放有玻纤的不锈钢网架放入冷冻干燥机中，-50℃冷冻抽真空处理12～24小时，得到金标垫，加干燥剂用铝箔袋封好备用。
(3)快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸的组装
将金标垫粘接到底板8上，使得金标垫与硝酸纤维素膜连接。将样品垫、吸水垫粘贴在底板8上，使得样品垫与金标垫远离硝酸纤维素膜的那端连接，吸水垫与硝酸纤维素膜远离金标垫的那端连接。将底板8裁剪成宽度为3.75mm试纸条后，即得到完整的快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸。检测试纸加干燥剂密封保存。
利用上述的快速诊断莱姆病的胶体金免疫层析检测试纸，可以检测含有莱姆病抗体的样本。在样品垫滴加样品后，若第一检测线及质控线均出现红色条带，则说明样本对应的患者为莱姆病的感染早期或感染中期；若第二检测线及质控线均出现红色条带，且第一检测线未出现红色条带，说明样本曾对应的患者曾经感染过莱姆病，或感染莱姆病时间较久；若仅质控线出现红色条带，说明样本对应的患者未感染莱姆病；若质控线没有出现红色条带，则说明该检测试纸已失效。
试验例：
灵敏度试验
将含有莱姆病IgG抗体样本分别按照1:10、1:50、1:100的比例稀释，含有莱姆病IgM抗体样本分别按照1:5、1:20、1:60的比例稀释，以及阴性样品分别用5ul的加样量分别滴加到七条检测试纸的吸水垫上，并同时滴加3滴缓冲液进行检测，滴加莱姆病IgG抗体的三个浓度的样品后，检测试纸第二检测线显色，滴加莱姆病IgM抗体的三个浓度的样品后，检测试纸第一检测线显色，滴加阴性样品后，检测试纸两根检测线均不显色。每个浓度设定重复三次，检测结果完全一致，证明本发明检测试纸检测结果稳定可靠。
稳定性试验
采用加速稳定性试验，将同一批次的检测试纸分别置于45℃和55℃烘箱，并以下表的时间段分别对莱姆病标准品进行检测。结果表明，阳性样本(即莱姆IgG抗体和莱姆IgM抗体的三种滴度的样本)使得检测线和质控线均能显色，且结果保持一致，阴性样本仅使得质控线显色，说明本发明的试剂条在室温下至少可以保存24个月，具有较长的保存时间和较好的稳定性。
表1加速稳定性试验的时间线
临床样本验证
收集50例莱姆IgM抗体阳性的感染莱姆病病毒的样本，利用本发明制备的检测试纸进行检测，检测结果显示，50例莱姆IgM抗体阳性的样本均显示IgM阳性，与ELISA方法检测结果完全一致；
收集50例莱姆IgG抗体阳性的感染莱姆病病毒的样本，利用本发明制备的检测试纸进行检测，检测结果显示，50例莱姆IgG抗体阳性的样本均显示IgG阳性，与ELISA方法检测结果完全一致。证明本发明的检测试纸结果可靠，特异性强，操作简便、快速，而且可以不用借助任何设备就能进行临床样本的检测，检测结果显示直观、准确。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种快速诊断莱姆病的检测试纸，包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其特征在于：所述的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次排列相连，且均设置在底板上；硝酸纤维素膜上设置有第一检测线、第二检测线和质控线；第一检测线处设置有鼠抗人IgM单克隆抗体；第二检测线处设置有鼠抗人IgG单克隆抗体；质控线处设置有羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述的金标垫上设置有莱姆病重组抗原-胶体金偶联物。
2.根据权利要求1所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸，其特征在于：所述的第二检测线位于第一检测线与质控线之间；所述的第一检测线位于金标垫与第二检测线之间；所述的质控线位于吸水垫与第二检测线之间；所述第一检测线、第二检测线的间距以及第二检测线、质控线的间距均为0.3cm。
3.根据权利要求1所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸，其特征在于：所述莱姆病重组抗原-胶体金偶联物内胶体金的直径为30～70nm。
4.根据权利要求1所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸，其特征在于：所述底板的材质为聚苯乙烯。
5.如权利要求1所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤1：检测线、质控线的添加：用点膜仪将鼠抗人IgM单克隆抗体溶液、鼠抗人IgG单克隆抗体溶液、羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液按照1ul/cm的速度分别包被在硝酸纤维素膜上，鼠抗人IgM单克隆抗体溶液形成第一检测线3，鼠抗人IgG单克隆抗体溶液形成第二检测线4，羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液形成质控线5；之后将硝酸纤维素膜放置于37℃温度下烘干；
步骤2：金标垫的制备：用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液；用0.2mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.5；将莱姆病重组抗原按照1:1的体积比加入到胶体金溶液中；标记20min后，向胶体金溶液中添加10％的BSA水溶液，至BSA的终浓度为1％；搅拌30min后，向胶体金溶液中添加10％的PEG20000，至PEG20000的终浓度为0.2％；搅拌10min后，4℃、10000rpm离心30min，得到纯化的莱姆病重组抗原-胶体金偶联物；将莱姆病重组抗原-胶体金偶联物稀释后包被于玻纤上，并进行冷冻干燥处理，得到金标垫；
步骤3：将硝酸纤维素膜固定到底板的中部；将金标垫粘接到底板上，使得金标垫与硝酸纤维素膜连接；将样品垫、吸水垫粘贴在底板上，使得样品垫与金标垫远离硝酸纤维素膜的那端连接，吸水垫与硝酸纤维素膜远离金标垫的那端连接。
6.根据权利要求5所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述第一检测线包被的鼠抗人IgM单克隆抗体的使用浓度为0.3～1.0mg/ml；所述第二检测线包抗的鼠抗人IgG单克隆抗体的使用浓度为0.3～1.0mg/ml；所述质控线包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体的使用浓度为1.0～3.0mg/ml。
7.根据权利要求5所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤2中，包被上玻纤的莱姆病重组抗原-胶体金偶联物的浓度稀释为OD1-OD4。
8.根据权利要求5所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤2中用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤如下：在沸腾的0.01％质量浓度的氯金酸水溶液中加入的1％质量浓度的柠檬酸三钠水溶液；柠檬酸三钠水溶液与氯金酸水溶液的体积比为5:1。
9.根据权利要求5所述的一种快速诊断莱姆病的检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤3执行后，将底板裁剪至宽度等于3.75mm。
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