CN111426844A - 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgG-IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条 - Google Patents

一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgG-IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2 IgG‑IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，结合垫上包被有SARS‑CoV‑2结构蛋白‑标记物和羊抗兔IgG‑标记物，硝酸纤维素膜上设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2和包被兔IgG的质控线C。利用该试纸条定量检测SARS‑CoV‑2 IgG和IgM抗体，检测灵敏度高，特异性好，可达96％；批次批间差异小，具有良好的重复性；常温可保存半年且灵敏度不降低，具有良好的稳定性；操作简单，成本低廉，可快速定量检测人体内SARS‑CoV‑2 IgG和IgM抗体水平，辅助核酸检测手段，为疫情提供有力支持。

Description

一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgG-IgM抗体联检的荧光免疫 层析试纸条
技术领域
本发明属于人类医学卫生领域，具体涉及一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgG-IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumoina)是由2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的一种急性呼吸道传染病。自2019年底在武汉爆发，截至2月25日，累计确诊人数7.7万多人，在医疗等各行业人员的共同努力以及国外的友好援助下，疫情已逐步得到控制。而新型冠状病毒的检测诊断是有效控制疫情的重要环节，高效的病毒检测技术也已成为研发的热点。
国家卫健委发布的新冠肺炎诊疗方案试行第五版提出以电子计算机断层扫描(CT)的影像学特征和核酸检测的病原学特征作为主要诊断标准。CT检测新型肺炎检出率高，结果较为可靠稳定，筛查快速及时，同时可以判断肺炎病程，但耗费巨大，不适合大范围推广，同时无法鉴别病毒类型，对早期病症无法排查；核酸检测相较于CT检测具有更高的灵敏度、成本相对较低，但是由于取样方式、污染常导致假阳性或假阴性，而且步骤复杂、耗时较长(2-4h)。
免疫学检测方法是抗原抗体的结合，通过凝集反应、显色反应即可快速、灵敏鉴定，无需进行样品的纯化、提取。人感染病毒后1-2周左右即可出现IgM抗体，IgM抗体反映急性感染，出现最早、消失最快，IgG抗体随后产生，并维持较高的浓度，在机体免疫中发挥主要作用为。因此为缩短诊断时间，提高检测准确性，推动疫情筛查、隔离、治疗，可以通过检测特异性的IgM、IgG抗体，鉴定新冠病毒并测定病毒滴度，为临床诊断提供血清学的证据。该技术适合较大规模的筛查，对实验室要求低，可有效排除核酸检测的假阴性。
目前已建立的用于检测SARS-CoV-2抗体的血清学方法主要有酶联免疫法(ELISA)和免疫胶体金法等。ELISA需要昂贵的设备，精通复杂操作的专业人员，并且消耗时间长；而免疫胶体金法虽然具有检测快速、成本低、操作方便等优点，但仍存在一些缺陷，如无法定量检测、检测灵敏度低、基质效应明显背景干扰大等。因此，本发明专利的目的就是克服以上几种方法的缺点，建立一种操作简便、灵敏度高、特异性好的SARS-CoV-2 IgG-IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条，为疫情提供有力支持。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种检测灵敏度高，特异性好，可检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的荧光免疫层析试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述的结合垫上包被有SARS-CoV-2结构蛋白-标记物和羊抗兔IgG-标记物，所述的硝酸纤维素膜上依次设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2和包被兔IgG的质控线C。
作为一种优选技术方案：所述底板的材料为PVC或硬质不吸水的材料；所述样品垫的材料为玻璃纤维、棉纤维、滤纸纤维或聚脂纤维；所述结合垫的材料为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫的材料为吸水滤纸。
作为一种优选技术方案：所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次以2-4mm的间距交互层叠首尾粘贴在底板上。
作为一种优选技术方案：所述的SARS-CoV-2结构蛋白为核蛋白(N)或者糖蛋白(S)。
作为一种优选技术方案：所述的标记物为量子点微球、时间分辨荧光微球或者上转换荧光微球；进一步优选的所述量子点微球的粒径范围为50-200nm。
作为一种优选技术方案：所述的检测线T1上鼠抗人IgG单克隆抗体的用量为0.3-1.4μg/cm；所述的检测线T2上鼠抗人IgM单克隆抗体的用量为0.8-1.6μg/cm；所述的质控线C上兔IgG的用量为0.5-1.5μg/cm；稀释液为含3％-5％蔗糖的PBS缓冲液。
上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)SARS-CoV-2结构蛋白的表达与纯化；
(2)制备SARS-CoV-2结构蛋白-标记物和羊抗兔IgG-标记物，喷涂在所述的结合垫上，干燥备用；
(3)制备依次设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2和包被兔IgG的质控线C的硝酸纤维素膜，干燥备用；
(4)制备样品垫：预先用含有0.5％-3％BSA，0.2％-2％Tween-20的PBS缓冲液处理，干燥备用；
(5)将制备好的结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫与吸水垫、底板组装成试纸。
作为一种优选技术方案：以所述的SARS-CoV-2N蛋白-量子点微球和羊抗兔IgG-量子点微球标记物为例，其制备的过程为：取量子点微球预先超声1～3min，用0.01-0.1M pH4～6的MES缓冲液调节浓度至0.05～1mg/mL；加入终浓度为1～100mM的EDC和NHS进行微球表面的羧基活化；加入终浓度为5～100μg/mL的待标记蛋白进行偶联；最终分散于含有0.01％-0.1％NaN3和0.1％-1％BSA的0.01-0.1M pH 6.0～9.0的PBS缓冲液中，分散后的体积为初始加入微球体积的1～10倍，于4℃保存备用；
所述的结合垫喷涂SARS-CoV-2N蛋白-量子点微球和羊抗兔IgG-量子点微球标记物前需要先用含有0.5％-3％BSA，0.2％-2％Tween-20，5％-20％蔗糖的PBS缓冲液浸泡处理，干燥备用。
一种利用所述的试纸条检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的方法，包括以下步骤：
(1)将标准样品滴加到上述试纸条的样品垫上，进行层析，然后利用荧光检测仪测得样品相应的荧光强度值，记为T1值、T2值和C值；
(2)分别以标准样品中IgG、IgM抗体的浓度为横坐标，T1/C、T2/C为纵坐标，绘制标准曲线S1和S2；
(3)取待检样品溶液，加入试纸条层析10-15min；
(4)将试纸条插入荧光检测仪的检测窗口，得到相应的荧光强度值，根据步骤(2)所得的标准曲线，即可计算出样本中IgG、IgM抗体的含量。
本发明所述的室温为25±5℃。
本发明的有益效果在于：可以实现快速定量检测、具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和好的重复性；结合荧光检测仪，操作简单，只需要加样检测，即可得到检测结果，自动记录结果，上传云端；更易于推广使用，不需要专业操作人员和昂贵仪器设备，按说明书即可完成操作，适用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的早期诊断和康复检查。
附图说明
图1为定量检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的荧光免疫层析试纸条组装结构图。
其中：1—样品垫；2—结合垫；3—检测线T1；4—检测线T2；5—质控线C；6—硝酸纤维素膜；7—吸水纸；8—底板。
具体实施方式
本发明的具体实施方式结合下面的实施例进行详细说明。
实施例1
如图1所示，一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的量子点微球免疫层析试纸条，该试纸条包括底板8、样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜6和吸水垫7，所述的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜6和吸水垫7依次首尾衔接粘贴在底板8上，各自重合2mm。所述的结合垫2上包被有SARS-CoV-2N蛋白-量子点微球和羊抗兔IgG-量子点微球标记物，所述的硝酸纤维素膜6上依次设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1 3、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2 4和包被兔IgG的质控线C 5。
所述底板8的材料为PVC或硬质不吸水的材料；所述样品垫1的材料为玻璃纤维、棉纤维、滤纸纤维或聚脂纤维；所述结合垫2的材料为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫7的材料为吸水滤纸。
用于定量检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的量子点微球免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1.SARS-CoV-2N蛋白的表达与纯化
(1)SARS-CoV-2N蛋白部分基因序列选择：氨基酸序列：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQALEHHHHHH
(2)表达与纯化：直接基因合成，连接到载体pET28a(+)上，37℃活化菌种12h后，按照1:1000的比例扩大培养2～3h后，加入1mmol/L的IPTG诱导表达，16℃、140rpm/min诱导过夜后收菌。每100mL菌液用10mL PBS重悬，超声(超3s，停5s，功率40％)后离心，收集上清，过镍柱纯化。
(3)SDS-PAGE和Western blot检测：使用SDS-PAGE检测纯化效果，经考马斯亮蓝染色后发现与目的蛋白大小相符且western blot结果也在该位置显示特异性条带，证明已成功表达目的蛋白。
2.制备SARS-CoV-2N蛋白-量子点微球和羊抗兔IgG-量子点微球标记物
(1)取量子点微球(上海昆道生物生物科技有限公司，粒径80-100nm)超声1分钟，用MES缓冲液(0.01M，pH 6.0)调节微球浓度(终浓度为0.5mg/mL)，然后加入对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC和NHS粉末均用MES缓冲液溶解，EDC和NHS终浓度为10mM)，置于37℃反应0.5h，将微球表面的羧基活化；
(3)将羧基活化后的量子点微球用PB缓冲液洗涤两次后，分为两管，分别加入终浓度为30μg/mL的SARS-CoV-2N蛋白和16μg/mL羊抗兔IgG抗体，室温下反应3h；
(4)反应完成后，将偶联了蛋白和抗体的量子点微球洗涤3次除去未反应的蛋白和抗体分子，再加入10％BSA封闭多余位点，离心弃上清；
(5)最后分散于PBS缓冲液(0.01M pH 8.0，其中含有0.01％(g/100ml)的NaN3和0.5％(g/100ml)的BSA)中(分散后的体积为初始加入微球体积的10倍)，置于4℃保存备用。
3.结合垫的制备
(1)将结合垫用含有BSA(0.5％，g/100ml)，Tween-20(0.4％，v/v)，蔗糖(10％，g/100ml)的PBS缓冲液浸泡2h，37℃下烘干备用；
(2)取上述SARS-CoV-2N蛋白-量子点微球和羊抗兔IgG-量子点微球标记物按照一定摩尔比例(可以为1：1，1:2或2:1，本实施例选择1:1)喷涂在结合垫上，37℃真空干燥箱中干燥24h，密封包装置于4℃备用。
4.免疫硝酸纤维素膜的制备
(1)将鼠抗人IgG单抗用PBS缓冲液(含有3％蔗糖，g/100ml)稀释为1mg/ml，制得检测线T1溶液；
(2)将鼠抗人IgM单抗用PBS缓冲液(含有3％蔗糖)稀释为1.2mg/ml，制得检测线T2溶液；
(3)将兔IgG用PBS缓冲液(含有3％蔗糖)稀释为1mg/ml，制得质控线C溶液；
(4)用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每1cm长硝酸纤维素膜分别包被有1ul的C线和T线溶液，检测线T1、检测线T2和质控线C的间距为4-6mm；
(5)37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用。
5.样品垫的制备：将样品垫用含有BSA(1％，g/100ml)，Tween-20(0.4％，v/v)的PBS缓冲液浸泡2h，37℃下烘干备用。
6.试纸的组装：将处理过的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜6以及吸水垫7按照位置组装好后用切刀裁切成4×80mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存。
实施例2利用实施例1制备的试纸条检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体
(1)将待测样本进行不同倍数的稀释，加到胶体金试纸条层析10-15min，目视法进行结果判定，确定检测极限(最大稀释倍数，15倍)；
(2)将同样稀释倍数的待测样本，加到上述试纸条的样品垫上层析10-15min，然后利用荧光检测仪测得样品相应的荧光强度值进行结果判定，确定检测极限(最大稀释倍数，200倍)；
(3)结果表明上述试纸条较胶体金试纸条灵敏一个数量级；
(4)且累计对60份其它非新型冠状病毒肺炎的患者血清样本进行检测，结果显示IgG/IgM试剂盒的特异性达96％以上。本发明试纸条的检测对象是抗体，不是病毒抗原。该实施例的检测特异性的比对是和非新冠患者体内的抗体进行对比的(都是IgG和IgM)，能够证明本发明试纸条的显著特异性。
(5)以上结果表明该试纸条高灵敏度、高特异性。
以上所述仅为本发明的部分实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgG-IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala
20 25 30
Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln
35 40 45
Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly
50 55 60
Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly
65 70 75 80
Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr
85 90 95
Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg
100 105 110
Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp
115 120 125
Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly
130 135 140
Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn
145 150 155 160
Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala
165 170 175
Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr
180 185 190
Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly
210 215 220
Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala
225 230 235 240
Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly
245 250 255
Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala
260 265 270
Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr
275 280 285
Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly
290 295 300
Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
305 310 315 320
Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly
325 330 335
Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr
340 345 350
Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp
355 360 365
Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro
370 375 380
Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln
385 390 395 400
Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro
405 410 415
Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
420 425 430
Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala Leu Glu His His His His His His
435 440 445

Claims (9)

1.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述的结合垫上包被有SARS-CoV-2结构蛋白-标记物和羊抗兔IgG-标记物，所述的硝酸纤维素膜上依次设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2和包被兔IgG的质控线C。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述底板的材料为PVC或硬质不吸水的材料；所述样品垫的材料为玻璃纤维、棉纤维、滤纸纤维或聚脂纤维；所述结合垫的材料为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫的材料为吸水滤纸。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次以2-4mm的间距交互层叠首尾粘贴在底板上。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的SARS-CoV-2结构蛋白为核蛋白(N)或糖蛋白(S)。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的标记物为量子点微球、时间分辨荧光微球或者上转换荧光微球；优选的所述量子点微球的粒径范围为50-200nm。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的检测线T1上鼠抗人IgG单克隆抗体的用量为0.3-1.4μg/cm；所述的检测线T2上鼠抗人IgM单克隆抗体的用量为0.8-1.6μg/cm；所述的质控线C上兔IgG的用量为0.5-1.5μg/cm。
7.权利要求1～6中任意一项所述试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)SARS-CoV-2结构蛋白的表达与纯化；
(2)制备SARS-CoV-2结构蛋白-标记物和羊抗兔IgG-标记物，喷涂在所述的结合垫上，干燥备用；
(3)制备依次设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2和包被兔IgG的质控线C的硝酸纤维素膜，干燥备用；
(4)制备样品垫：预先用含有0.5％-3％BSA，0.2％-2％Tween-20的PBS缓冲液处理，干燥备用；
(5)将制备好的结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫与吸水垫、底板组装成试纸。
8.根据权利要求7所述试纸条的制备方法，其特征在于：以所述的SARS-CoV-2N蛋白-量子点微球和羊抗兔IgG-量子点微球标记物为例，其制备的过程为：取量子点微球预先超声1～3min，用0.01-0.1M pH 4～6的MES缓冲液调节浓度至0.05～1mg/mL；加入终浓度为1～100mM的EDC和NHS进行微球表面的羧基活化；加入终浓度为5～100μg/mL的待标记蛋白进行偶联；最终分散于含有0.01％-0.1％NaN3和0.1％-1％BSA的0.01-0.1M pH 6.0～9.0的PBS缓冲液中，分散后的体积为初始加入微球体积的1～10倍，于4℃保存备用；
所述的结合垫喷涂SARS-CoV-2N蛋白-量子点微球和羊抗兔IgG-量子点微球标记物前需要先用含有0.5％-3％BSA，0.2％-2％Tween-20，5％-20％蔗糖的PBS缓冲液浸泡处理，干燥备用。
9.一种利用权利要求1所述的试纸条检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将标准样品滴加到上述试纸条的样品垫上，进行层析，然后利用荧光检测仪测得样品相应的荧光强度值，记为T1值、T2值和C值；
(2)分别以标准样品中IgG、IgM抗体的浓度为横坐标，T1/C、T2/C为纵坐标，绘制标准曲线S1和S2；
(3)取待检样品溶液，加入试纸条层析10-15min；
(4)将试纸条插入荧光检测仪的检测窗口，得到相应的荧光强度值，根据步骤(2)所得的标准曲线，即可计算出样本中IgG、IgM抗体的含量。
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