CN111426829A - 一种检测SARS-CoV-2 IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条 - Google Patents
一种检测SARS-CoV-2 IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种检测新型冠状病毒IgM‑IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，结合垫上包被有N蛋白‑标记物和S蛋白‑标记物，硝酸纤维膜上设有包被N蛋白和S蛋白混合物的检测线和包被N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物的质控线。利用该试纸条定量检测新型冠状病毒抗体总量，检测灵敏度高，准确性好，具有良好的重复性和稳定性；操作简单，成本低廉，可快速定量检测人体内SARS‑CoV‑2 IgM‑IgG抗体总量水平，为疫情提供有力支持。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断制品的生产和技术领域，具体涉及一种检测SARS-CoV-2IgM- IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条。
背景技术
2019年出现了由一种尚未发现的冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。这种病毒被世界卫生组织(WHO)命名为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)，这种病毒引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)已经造成了全国80303人感染，2947例死亡(截止至2020.03.04)。
新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径为60-140nm，通过对新型冠状病毒与2003年非典，即严重急性呼吸综合征(SARS)的冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)进行全基因组比对发现新病毒与后两者平均分别达到70％和40％的序列相似性。其中不同冠状病毒与宿主细胞作用的关键spike基因(编码S-蛋白)，有更大的差异性，并且其核蛋白(N protein)产生抗体水平高且在体内持续时间较长。
由于没有有效的治疗药物或疫苗，最好的措施是控制传染源，早期诊断，及时隔离患者，目前有许多科研团队研究早期诊断方法，但其主要方法为逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)。RT-PCR需要对疑似患者采样 (通常为咽拭子上呼吸道采样)采样，但是咽拭子标本核酸检出率偏低，灵敏度不高，容易造成假阴性结果且RT-PCR的操作需要专业的实验人员，昂贵的设备和安全的实验环境。面对全国突发的疫情，利用RT-PCR核酸检测显然无法满足大规模的及时，准确的早期诊断。不能满足现场检测的要求，故急需开发操作简便、可即时、高准确度的快速检测产品。
本发明设计的量子点微球免疫层析试纸条，是以量子点微球作为标记物建立的一种免疫层析方法。本发明利用一对新冠状病毒的N蛋白和S蛋白来检测疑似患者体内抗体含量。量子点激发光谱宽而发射波长窄，荧光效率高，生物兼容性好，量子点微球是一种通过高聚物载体上吸附或包埋量子点而形成的一种标记物，单体量子点微球包裹有数百或者数千的量子点颗粒，因此相较于量子点，具有更高的发光强度，可有效提高检测灵敏度和稳定性。结合荧光检测仪，可实现快速定量检测，具有良好的临床应用前景和意义。
发明内容
本发明的目的在于克服目前缺少快速检测是否患有新型冠状病毒肺炎的产品问题，本发明设计的SARS-CoV-2的IgM-IgG抗体总量检测试纸条应用简便，结果准确，为下一步准确治疗由SARS-CoV-2引起的疾病提供了依据，适于大规模推广应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种检测新型冠状病毒IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述的结合垫上包被有新型冠状病毒N蛋白-标记物和 S蛋白-标记物，所述的硝酸纤维膜上依次设有包被新型冠状病毒N蛋白和S蛋白混合物的检测线和包被新型冠状病毒N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物的质控线。
优选的：所述底板的材料为PVC或硬质不吸水的材料；
优选的：所述样品垫的材料为玻璃纤维、棉纤维、滤纸纤维或聚脂纤维；
优选的：所述结合垫的材料为玻璃纤维或聚酯纤维；
优选的：所述吸水垫的材料为吸水滤纸。
作为一种优选技术方案：所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次以2-4 mm的间距交互层叠首尾粘贴在底板上。
作为一种优选技术方案：所述的标记物为量子点微球、时间分辨荧光微球或者上转换荧光微球，但不限于此；进一步优选的所述量子点微球的粒径范围为50-200nm。
作为一种优选技术方案：所述的检测线上N蛋白和S蛋白混合物的浓度为0.4-1mg/mL；所述的质控线上N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物的浓度为0.3-1.5mg/mL；用于稀释N蛋白和S蛋白混合物溶液或N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物溶液的稀释液为含3％-5％蔗糖的PBS缓冲液。
上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备N蛋白-标记物和S蛋白-标记物，喷涂在所述的结合垫上，干燥备用；
(2)制备设有包被N蛋白和S蛋白混合物检测线和包被N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物质控线的硝酸纤维素膜，干燥备用；
(3)制备样品垫：预先用含有0.5％-5％BSA，0.2％-2％Tween-20的缓冲液处理，干燥备用；
(4)将制备好的结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫与吸水垫、底板组装成试纸。
作为一种优选技术方案，以量子点微球为标记物，上述N蛋白-标记物和S蛋白-标记物的制备过程包括以下步骤：
a)量子点微球的活化：将量子点微球加入缓冲液中；加入EDC和NHS；在37℃摇床中恒温孵育；再至离心机中离心，弃上清，加入缓冲液重悬；
b)量子点微球的偶联：将步骤a)得到的量子点微球缓冲液，分为2管，分别加入新型冠状病毒N蛋白和S蛋白，在37℃摇床中恒温孵育；
c)量子点微球的封闭：将步骤b)得到的完成偶联的量子点微球缓冲液中加入封闭液，在37℃摇床中恒温孵育，弃上清，加入缓冲液重悬。
一种利用上述的试纸条检测新冠状病毒抗体的方法，包括以下步骤：
(1)将标准样品(即新冠病毒的N和S蛋白的抗体)滴加到上述试纸条的样品垫上，进行层析，然后利用荧光检测仪测得样品相应的荧光强度值，记为T值和C值；
(2)以抗体的对数为横坐标，T/C为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)取待检样品溶液，加入试纸条层析10-15min；
(4)肉眼或/和荧光检测仪判定结果：
判定结果(肉眼)：在做好防护措施下，配合紫外激光发射器，在紫外光的照射下，试纸条的C线显色，T线显色时，结果判定为结果为阳性，T线的颜色越深，则阳性越强。
判定结果(荧光检测仪)：将试纸条插入荧光检测仪的试纸条插入槽口中，得到荧光强度的数值，带入标准曲线后可定量判断样品的阳性有无及强弱水平。
所述的荧光检测仪为手持或台式荧光检测仪或其他荧光读取仪器，适合于快速定量检测新冠状病毒抗体。
本发明所述的室温为25±5℃。
与现有技术相比，本发明的优点及积极效果在于：
(1)本发明提供的新冠状病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条，量子点微球具有均一度高，单分散性好，稳定性强等优点，使用量子点微球作为标记物制作的试纸条批次间差异较小。
(2)操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种医院、家庭等环境下的检测。且结合荧光检测仪，可以对结果进行定量，通过读取检测线和质控线的荧光强度，定量测定抗体浓度。
(3)特异性强，灵敏度高，稳定且具有重复性。
(4)本发明提供的新冠状病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条的制备方法，操作易上手，所需原料简单，可在较短时间内掌握，有广阔的临床应用前景和较大的社会意义。
附图说明
图1为实施例1定量检测新型冠状病毒IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条的结构示意图。
其中：1—样品垫；2—结合垫；3—检测线；4—质控线；5—硝酸纤维素膜；6—吸水纸；7—底板。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的优选实施方式进行详细说明。此外需要理解的是，以下的实施例仅是为了对本发明作进一步说明，帮助理解。而不是用于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围不受任何实施例形式上的限制。
下述实施例中所使用的的实验方法如无特殊说明，皆为常规方法。
下述实施例中的各种设备与试剂，若无特殊说明，皆可通过商业途径得到。
实施例1检测新型冠状病毒IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条
如图1所示，一种定量检测新型冠状病毒IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条，该试纸条包括底板7、样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜5和吸水垫6，所述的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜5和吸水垫6依次首尾衔接粘贴在底板7上，各自重合2mm，所述的结合垫2上包被有新型冠状病毒N蛋白-量子点微球和S蛋白-量子点微球，所述的硝酸纤维膜5上依次设有包被新型冠状病毒N蛋白和S蛋白混合物的检测线3和包被新型冠状病毒N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物的质控线4。
所述底板的材料为PVC或硬质不吸水的材料；所述样品垫的材料为玻璃纤维、棉纤维、滤纸纤维或聚脂纤维；所述结合垫的材料为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫的材料为吸水滤纸。
实施例2量子点微球标记的N蛋白和S蛋白(N蛋白-量子点微球和S蛋白-量子点微球) 的制备
(1)取量子点微球(上海昆道生物生物科技有限公司，粒径80-100nm)超声1分钟，用MES缓冲液(0.01M，pH 6.0)调节微球浓度(终浓度为0.5mg/mL)，然后加入对乙基- N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC和NHS粉末均用MES缓冲液溶解，EDC和NHS终浓度为10mM)，置于37℃摇床中恒温孵育0.5h，将微球表面的羧基活化；再至离心机中离心，弃上清，加入MES缓冲液(0.01M，pH 6.0)重悬；
(2)将羧基活化后的量子点微球缓冲液分为2管，分别加入终浓度为20μg/mL的N蛋白(购自广东伟迪公司)和12μg/mL的S蛋白(购自广东伟迪公司)，在37℃摇床中恒温孵育3h；
(3)反应完成后，将偶联了蛋白的量子点微球洗涤3次除去未反应的蛋白分子，再加入BSA用于封闭多余位点，在37℃摇床中恒温孵育，离心弃上清。
(4)最后分散于PBS缓冲液(0.01M pH 8.0，其中含有0.01％(g/100ml)的NaN3和0.5％(g/100ml)的BSA)中(分散后的体积为初始加入微球体积的10倍)，置于4℃保存备用。
实施例3样品垫的制备
用0.5％BSA(g/100ml)，0.4％Tween-20(v/v)的缓冲液浸泡30分钟处理，干燥备用。
实施例4结合垫的制备
(1)将结合垫用含有BSA(1％，g/100ml)，Tween-20(0.5％，v/v)，蔗糖(10％， g/100mL)的PBS缓冲液浸泡2h，37℃下烘干备用；
(2)用三维平面点膜喷金仪器将实施例2制备的N蛋白-量子点微球和S蛋白-量子点微球标记物喷涂在结合垫上，37℃真空干燥箱中干燥24h，密封包装置于4℃备用。
实施例5硝酸纤维素膜的制备
(1)将N蛋白单克隆抗体和S蛋白多克隆抗体(购自北京义翘神州生物技术有限公司)用PBS缓冲液(含有3％蔗糖，g/100ml)稀释为0.5mg/mL，制得质控线(C线)工作液，2-8℃保存备用；
(2)将N蛋白和S蛋白用PBS缓冲液(含有3％蔗糖)稀释为1mg/mL，制得检测线 (T线)工作液，2-8℃保存备用；
(3)用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每1cm长硝酸纤维素膜分别包被有1uL的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为4-6mm；
(4)37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用。
实施例6试纸的组装
组装试纸条，将免疫结合垫贴于划膜的硝酸纤维素膜下方，与膜接触2mm；样品垫贴在免疫结合垫下方，与免疫结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在硝酸纤维素膜的上方，与膜接触2mm。接通裁条机电源，设定切割宽度为4mm；将试纸条合格品平放入切割机平台轨道中，正面朝上，按操作面板上“开始”键，开始切割；每放一片试纸条合格品，按操作面板上“开始”键一次，直至切割完所有试纸条合格品。切割完成后，将试纸条装入塑料外壳，压卡机压紧，即得到新型冠状病毒抗体检测试纸条。
实施例7检测新型冠状病毒抗体的量子点微球免疫层析试纸条的使用方法及结果判定
(1)样本为血清或经过抗凝处理的血浆(推荐使用EDTA、肝素钠、柠檬酸钠抗凝剂)，注：样本中含有大量的脂质、溶血或浑浊，请勿使用，以免影响结果判断；
(2)撕开试纸条的铝箔袋，取出试纸条，将其放于洁净操作台上；
(3)用一次性塑料吸管吸取样本，滴加1滴(约20μL)至加样孔中，再滴加4滴(约 80μL)的样本稀释液(0.01M PBST溶液，pH为7.2，0.2％Tween-20)。
(4)滴加完成后，等待10-15min，判定结果。
(5)判定结果(肉眼)：在做好防护措施下，可配合紫外激光发射器，在紫外光的照射下，试纸条的C线显色，T线显色时，结果判定为结果为阳性，T线的颜色越深，则阳性越强。无论样本是否含有待检测的抗体，N蛋白-量子点微球和S蛋白-量子点微球标记物都会被C线处的N蛋白单抗和S蛋白多抗捕获，显示红色的质控线。如此线不出现，表示试纸条失效，检测结果无效。
(6)判定结果(荧光检测仪)：将试纸条插入手持或台式荧光检测仪的试纸条插入槽口中，得到荧光强度的数值。带入标准曲线后可定量判断样品的阳性有无及强弱水平。
标准曲线的绘制过程为：
将已知浓度的新冠病毒的N和S蛋白的抗体进行不同倍比稀释滴加到权利要求1所述试纸条的样品垫上，进行层析，然后利用荧光检测仪测得样品相应的荧光强度值，记为T值和C值；
以抗体的对数为横坐标，T/C为纵坐标，绘制标准曲线，并确定检测极限(最大稀释倍数，4800倍)。
(7)将同样稀释倍数的已知浓度的新冠病毒的N和S蛋白的抗体，加到胶体金试纸条的样品垫上层析10-15min，然后目视法进行结果判定，确定检测极限(最大稀释倍数，400倍)；
(8)结果表明上述试纸条较胶体金试纸条灵敏一个数量级；
(9)且累计对60份其它非新型冠状病毒肺炎的患者血清样本进行检测，结果显示IgG/IgM试剂盒的特异性达97％以上。本发明试纸条的检测对象是抗体，不是病毒抗原。该实施例的检测特异性的比对是和非新冠患者体内的抗体进行对比的(都是IgG和IgM)，能够证明本发明试纸条的显著特异性。
(10)以上结果表明该发明试纸条具有高灵敏度和高特异性。
以上所述仅为本发明的优选实施例，但并不局限于此，所属本技术领域的人员在本说明的基础上还可做出其他不同形式的变化或替换。但只要不偏离发明的构思或超越本权利要求书所定义的范围，皆属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种检测新型冠状病毒IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述的结合垫上包被有新型冠状病毒N蛋白-标记物和S蛋白-标记物，所述的硝酸纤维膜上依次设有包被新型冠状病毒N蛋白和S蛋白混合物的检测线和包被新型冠状病毒N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物的质控线。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述底板的材料为PVC或硬质不吸水的材料；所述样品垫的材料为玻璃纤维、棉纤维、滤纸纤维或聚脂纤维；所述结合垫的材料为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫的材料为吸水滤纸。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次以2-4mm的间距交互层叠首尾粘贴在底板上。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的标记物为量子点微球、时间分辨荧光微球或者上转换荧光微球；优选的所述量子点微球的粒径范围为50-200nm。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述的检测线上N蛋白和S蛋白混合物的浓度为0.4-1mg/mL；所述的质控线上N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物的浓度为0.3-1.5mg/mL；用于稀释N蛋白和S蛋白混合物溶液或N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物溶液的稀释液为含3％-5％蔗糖的PBS缓冲液。
6.权利要求1～5中任意一项所述试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备N蛋白-标记物和S蛋白-标记物，喷涂在所述的结合垫上，干燥备用；
(2)制备设有包被N蛋白和S蛋白混合物检测线和包被N蛋白抗体和S蛋白抗体混合物质控线的硝酸纤维素膜，干燥备用；
(3)制备样品垫：预先用含有0.5％-5％BSA，0.2％-2％Tween-20的缓冲液处理，干燥备用；
(4)将制备好的结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫与吸水垫、底板组装成试纸。
7.根据权利要求6所述试纸条的制备方法，其特征在于，以量子点微球为标记物，所述N蛋白-标记物和S蛋白-标记物的制备过程包括以下步骤：
a)量子点微球的活化：将量子点微球加入缓冲液中；加入EDC和NHS；在37℃摇床中恒温孵育；再至离心机中离心，弃上清，加入缓冲液重悬；
b)量子点微球的偶联：将步骤a)得到的量子点微球缓冲液，分为2管，分别加入新型冠状病毒N蛋白和S蛋白，在37℃摇床中恒温孵育；
c)量子点微球的封闭：将步骤b)得到的完成偶联的量子点微球缓冲液中加入封闭液，在37℃摇床中恒温孵育，弃上清，加入缓冲液重悬。
8.一种利用权利要求1所述的试纸条检测新冠状病毒抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将新冠病毒的N和S蛋白的抗体滴加到权利要求1所述试纸条的样品垫上，进行层析，然后利用荧光检测仪测得样品相应的荧光强度值，记为T值和C值；
(2)以抗体的对数为横坐标，T/C为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)取待检样品溶液，加入试纸条层析10-15min；
(4)肉眼或/和荧光检测仪判定结果：
判定结果(肉眼)：在做好防护措施下，配合紫外激光发射器，在紫外光的照射下，试纸条的C线显色，T线显色时，结果判定为结果为阳性，T线的颜色越深，则阳性越强。
判定结果(荧光检测仪)：将试纸条插入荧光检测仪的试纸条插入槽口中，得到荧光强度的数值，带入标准曲线后可定量判断样品的阳性有无及强弱水平。
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