CN114062668A - 一种快速检测新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条及制备方法，该试纸条的底板上沿层析方向依次固定有样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的SARS‑CoV‑2的包被抗体；所述的反应膜上沿层析方向依次设置检测线和质控线，其中检测线中包被有SARS‑CoV‑2的捕获抗体，质控线中包被有羊抗鼠IgG抗体；该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。所测样本为待测者咽拭子分泌物及其稀释液、胃肠道分泌物及其稀释液、粪便及其稀释液。本发明所涉及的这种量子点免疫层析试纸条与常规胶体金免疫层析法制备的试纸条相比，具有稳定性好、特异性高、灵敏度高等多重优点，能够快速对无症状的新型冠状病毒肺炎密切接触者进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术，特别是涉及一种快速检测新型检测冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条及制备方法。
技术背景
新冠病毒SARS-CoV-2的检测可分为核酸扩增检测和病毒抗原蛋白直接检测两种方法。其中核酸检测具有特异性强、灵敏度高的特点，是当下新冠病毒检测的标准方法。但是核酸检测要求条件苛刻，成本较高，耗时较长，不利于新冠病毒潜在感染者的及时确诊。
新冠病毒除了其特有的核酸序列，其病毒组成也含有其特定的蛋白质，例如膜蛋白或者刺突蛋白。这些蛋白质可以视作抗原，利用抗原-抗体之间的特异性识别作用，采用POCT技术直接检测新冠病毒是否存在。由于POCT检测技术具有操作方便、结果显示迅速、短时间内可反复操作特点，在新冠病毒检测方面占有一定的优势。然而，现有的POCT技术有一个明显的缺点，就是灵敏度一般会远低于PCR技术，这是因为PCR技术可以对特异核酸序列进行链式扩增，实现特异核酸序列数量级的倍增，因此RT-qPCR技术的最低检测拷贝数可低至300个拷贝。但是POCT检测依据的是双抗夹心法，利用抗体和抗原的特异性结合后是否显色，以及显色强度来确定样本中是否存在抗原，以及抗原数量的多少。由于该方法不增加样本的抗原数量，其信号显示的灵敏度完全依靠POCT试纸条中所采用发光基团的发光灵敏度。因此，利用POCT 技术直接快速、简便、高效地检测新冠病毒SARS-CoV-2，就必须提高其中光学诊断试剂的灵敏度。
现在已经用于新冠病毒IgM/IgG检测的胶体金免疫层析试纸条，在POCT检测中属于第一代检测诊断标记试剂，其检测灵敏度较低，在ng/ml～pg/ml水平。荧光素作为第二代诊断标记试剂，比胶体金略有提高。而量子点作为第三代检测标记试剂，与胶体金或者化学荧光染料相比，具有更高的荧光强度和抗光漂白能力，可以使将抗原的诊断灵敏度提高到fg/ml的水平，是胶体金方法的1000倍。因此，结合抗原检测的高特异性和POCT技术简便即时的特点，本发明将量子点技术用于新冠病毒SARS-CoV-2的高灵敏免疫层析检测，为在人群中的新冠病毒SARS-CoV-2大规模筛查提供有力的工具。
发明内容
本发明的目的是针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)提供一种快速检测新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析快速检测试纸条，其特征在于所述试纸条在支撑底板上面依次固定有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫；所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体；所述的反应膜上依次检测线和质控线；所述的反应膜为结合聚合物的硝酸纤维素膜，所述的支撑底板为PVC底板，所述的该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区；所测样本为待测者咽拭子分泌物及其稀释液、胃肠道分泌物及其稀释液、粪便及其稀释液。
进一步地：
所述的包被抗体偶联的量子点为油溶性量子点，其发射波长在500nm～1100nm，粒径在2nm～10nm，荧光产率较高，经改性后可水溶，改性后粒径在10nm～50nm之间，改性后荧光产率是改性前的80％～100％，改性后的水溶性量子点表面修饰以羧基或者氨基。
所述的与包被抗体偶联的量子点为油溶性量子点，经改性后可水溶，表面修饰以羧基或者氨基，通过 EDC/NHS反应，与SARS-CoV-2的包被抗体偶联，得到上述包被抗体的量子点偶连体，偶连体的粒径为40～ 100nm。
所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体，所述的量子点偶联标记的 SARS-CoV-2的包被抗体的终浓度为0.2～1mg/ml。
所述的反应膜上的检测线和质控线分别依次包被新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG 抗体，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度分别为1～1.5mg/ml和0.5～ 1.0mg/ml，在所述反应膜上的包被量为1～5ml/cm。
所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析快速检测试纸条，其特征在于所述样本垫与结合垫重合，重合部分长度约0.2～0.4cm；所述结合垫与反应膜有部分重合，重合部分长度约0.2～0.4cm；所述反应膜与吸水垫有部分重合，重合部分长度约0.2～0.4cm；所述底板的宽度是0.3～0.5cm。
所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于所述的反应膜为结合聚合物的硝酸纤维素膜，所述的支撑底板为PVC底板，所述的该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。
所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于包括下列步骤：
1)在反应膜上分别固定识别新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测区和质控区；
2)制备被量子点偶联标记的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的包被抗体，并喷涂在结合垫上，并烘干备用；
3)在底板上依次固定有样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫，得到所述快速检测新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条。
所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于所述试纸条的检出率不低于现有核酸检测方法检出率的80％。
本发明专利的技术方案相比现有技术具有以下优点：
1)相比较于PCR技术，该技术方案可大幅度缩短检测时间。
2)相比于核酸检测，成本低廉，检测过程简单。
3)利用量子点标记，该技术方案可以大幅度提高检测的精度，尤其对新冠病毒无症状感染者或者症状轻微者，即可实现较为准确的诊断。
附图说明
图1和图2为本发明实施例的一种快速检测新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条结构示意图。其中，
图1为本发明实施例中的量子点荧光免疫层析快速试纸条的结构示意图。
图2为本发明实施例中的试剂条的顶部结构示意图。
图标：样品垫(1)；量子点颗粒垫(2)；硝酸纤维膜(3)；新型冠状病毒检测线(4)；质控线(5)；吸水垫(6)；支撑板(7)；检测结果区(8)；样本孔(9)。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例如图1所示，本实施例公开了一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点免疫层析检测试纸条，所述试纸条包括支撑底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素反应膜、检测区和质控线以及吸水纸组成。所述试纸条在支撑底板上面依次固定有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫。所述结合垫的一端紧密压接着硝酸纤维素膜，上面固定有被量子点偶联标记的新型冠状病毒的包被抗体。所述的反应膜上依次检测线和质控线；所述的反应膜为结合聚合物的硝酸纤维素膜，所述的支撑底板为PVC底板，所述的该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。
实施例1
本发明试纸条的制备方法为：
1、量子点偶联标记的(SARS-CoV-2)的包被抗体制备
其中量子点为油溶性的CdSe/ZnS，粒径在4.5nm，激发波长在375nm，发射波长在610nm。所述的 CdSe/ZnS被水溶性改性后，水溶改性产物的粒径在40nm，表面被修饰上大量羧基，激发波长为375nm，发射波长为610nm，改性后荧光产率是改性前的88％。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的包被抗体与上述水溶改性量子点偶联。所有偶联体的粒径在63nm左右。所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体，所述的量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体的终浓度为0.2～1mg/ml。
2、硝酸纤维素膜检测线和质控线制备
所述的反应膜上的检测线和质控线分别依次包被新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG 抗体，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度分别为1mg/ml和0.8mg/ml，在所述反应膜上的包被量为2.5ml/cm。
3、试纸条组装
将吸水纸、样品垫按图1中顺序粘贴在贴有硝酸纤维素膜的PVC底板上，相邻部位连接处重合部分长度0.3cm，便于免疫层析反应的进行，组装好的试纸条用切条机切割成0.4cm，最后在PVC底板的基础上，如图2所示，该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。
利用试纸条的对样本进行检测：
1、标准品的测定
用去离子水稀释抗体标品，浓度分别为0ng/ml、0.125ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、 5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml每个浓度测定3个平行重复。
15分钟后用置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线。
2、检验结果
用数学模型进行拟合曲线作图。结果表明，其线性相关系数荧光强度与浓度呈现很好的线性关系，相关系数为0.994。根据实验数据可得：其最低检测限为0.1ng/ml，最低定量限为0.3ng/ml，批内与批间重复性、稳定性良好，相关系数R2＞0.99，灵敏度很高，可以用于新型冠状病毒抗原的测定及定量检测。
实施例2
一、本发明试纸条的制备方法为：
1、量子点偶联标记的(SARS-CoV-2)的包被抗体制备
其中量子点为油溶性的CdSe/CdS，粒径在3nm，激发波长在400nm，发射波长在580nm。所述的CdSe/CdS 被水溶性改性后，水溶改性产物的粒径在30nm，表面被修饰上大量氨基，激发波长为400nm，发射波长为580nm，改性后荧光产率是改性前的86％。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的包被抗体与上述水溶改性量子点偶联。所有偶联体的粒径在51nm左右。所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体，所述的量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体的终浓度为0.2～1mg/ml。
2、硝酸纤维素膜检测线和质控线制备
所述的反应膜上的检测线和质控线分别依次包被新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG 抗体，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度分别为0.9mg/ml和0.8mg/ml，在所述反应膜上的包被量为2.3ml/cm。
3、试纸条组装
将吸水纸、样品垫按图1中顺序粘贴在贴有硝酸纤维素膜的PVC底板上，相邻部位连接处重合部分长度0.28cm，便于免疫层析反应的进行，组装好的试纸条用切条机切割成0.4cm，最后在PVC底板的基础上，如图2所示，该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。
二、利用试纸条的对样本进行检测：
1、样品1测定
测试前保持所有试剂为室温，测试应在室温下进行。在离心管内垂直加入300ml样本提取液。将采样后的咽拭子(样品1)插入样本提取管的溶液内，紧靠离心管内壁旋转约10次，使标本完全溶解在提取溶液中。沿离心管内壁挤压咽拭子的棉签头，使液体尽可能留在管内，棉签头取出弃之。用漩涡混合器处理30s使得样品混匀分散。向本发明中的试纸条的样本孔中加入100ml处理后的标本提取物，15分钟后置于荧光定量仪内获取荧光信号强度。
2、检验结果
结果质控线有荧光条带，检测线无荧光条带，则判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原阴性，证明被检测人很大概率不是新型冠状病毒携带者，可以通过再次检测排除可能性。
实施例3
一、本发明试纸条的制备方法为：
1、量子点偶联标记的(SARS-CoV-2)的包被抗体制备
其中量子点为油溶性的InP/ZnSe/ZnS，粒径在7.5nm，激发波长在380nm，发射波长在640nm。所述的CdSe/ZnS被水溶性改性后，水溶改性产物的粒径在34nm，表面被修饰上大量氨基，激发波长为380 nm，发射波长为640nm，改性后荧光产率是改性前的90％。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的包被抗体与上述水溶改性量子点偶联。所有偶联体的粒径在53nm左右。所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的 SARS-CoV-2的包被抗体，所述的量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体的终浓度为0.2～1mg/ml。
2、硝酸纤维素膜检测线和质控线制备
所述的反应膜上的检测线和质控线分别依次包被新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG 抗体，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度分别为1mg/ml和0.9mg/ml，在所述反应膜上的包被量为2.8ml/cm。
3、试纸条组装
将吸水纸、样品垫按图1中顺序粘贴在贴有硝酸纤维素膜的PVC底板上，相邻部位连接处重合部分长度0.25cm，便于免疫层析反应的进行，组装好的试纸条用切条机切割成0.4cm，最后在PVC底板的基础上，如图2所示，该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。
二、利用试纸条的对样本进行检测：
1、样品2测定
测试前保持所有试剂为室温，测试应在室温下进行。在离心管内垂直加入300ml样本提取液。将采样后的咽拭子(样品2)插入样本提取管的溶液内，紧靠离心管内壁旋转约10次，使标本完全溶解在提取溶液中。沿离心管内壁挤压咽拭子的棉签头，使液体尽可能留在管内，棉签头取出弃之。用漩涡混合器处理30s使得样品混匀分散。向本发明中的试纸条的样本孔中加入100ml处理后的标本提取物，15分钟后置于荧光定量仪内获取荧光信号强度。
2、检验结果
结果检测线和质控线具有荧光条带，则判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原阴性，证明被检测人是新型冠状病毒携带者，通过样品2测定的荧光强度值进行定量分析。
实施例4
新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条诊断方法与荧光PCR方法结果对比。
筛选新型冠状病毒(SARS-CoV-2)确诊者30人，分别采集患者的唾液标本、鼻拭子标本和咽拭子标本共计90份，分别用新型冠状病毒抗原的量子点免疫层析试纸条诊断方法与病毒荧光PCR方法进行测试，结果如表1所示：
表1：新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条诊断方法
与荧光PCR方法比较结果
| 咽拭子 | 唾液 | 鼻拭子 | 荧光PCR方法 | |
| 阳性 | 27 | 26 | 25 | 28 |
| 阴性 | 3 | 4 | 5 | 2 |
| 总计 | 30 | 30 | 30 | 30 |
由此可见，本发明新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条诊断方法，通过不同取样方式与与荧光PCR方法结果相比阳性率超过80％，可以符合临床检测的条件。
Claims (9)
1.一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析快速检测试纸条，其特征在于所述试纸条在支撑底板上面依次固定有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫；所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体；所述的反应膜上依次检测线和质控线；所述的反应膜为结合聚合物的硝酸纤维素膜，所述的支撑底板为PVC底板，所述的该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区；所测样本为待测者咽拭子分泌物及其稀释液、胃肠道分泌物及其稀释液、粪便及其稀释液。
2.根据权利要求1所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的新型冠状病毒的包被抗体，其与包被抗体偶联的量子点为油溶性量子点，其发射波长在500nm～1100nm，粒径在2nm～10nm，荧光产率较高，经改性后可水溶，改性后粒径在10nm～50nm之间，改性后荧光产率是改性前的80％～100％，改性后的水溶性量子点表面修饰以羧基或者氨基。
3.根据权利要求2所述的与包被抗体偶联的量子点为油溶性量子点，经改性后可水溶，表面修饰以羧基或者氨基，通过EDC/NHS反应，与SARS-CoV-2的包被抗体偶联，得到上述包被抗体的量子点偶连体，偶连体的粒径为40～100nm。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于所述的结合垫上固定有被量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体，所述的量子点偶联标记的SARS-CoV-2的包被抗体的终浓度为0.2～1mg/ml。
5.根据权利要求1所述的反应膜上的检测线和质控线分别依次包被新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，其中新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体的终浓度分别为1～1.5mg/ml和0.5～1.0mg/ml，在所述反应膜上的包被量为1～5ml/cm。
6.根据权利要求1所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析快速检测试纸条，其特征在于所述样本垫与结合垫重合，重合部分长度约0.2～0.4cm；所述结合垫与反应膜有部分重合，重合部分长度约0.2～0.4cm；所述反应膜与吸水垫有部分重合，重合部分长度约0.2～0.4cm；所述底板的宽度是0.3～0.5cm。
7.根据权利要求1所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于所述的反应膜为结合聚合物的硝酸纤维素膜，所述的支撑底板为PVC底板，所述的该试纸条的外壳上有样本孔和检测结果区。
8.根据权利要求1所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于包括下列步骤：
(1)在反应膜上分别固定识别新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的捕获抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测区和质控区；
(2)制备被量子点偶联标记的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的包被抗体，并喷涂在结合垫上，并烘干备用；
(3)在底板上依次固定有样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫，得到所述快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条。
9.根据权利要求1所述的一种快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于所述试纸条的检出率不低于现有核酸检测方法检出率的80％。
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