CN113567666A - 一种荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用，所述的检测试纸条含有使用荧光微球标记的免疫层析法检测新型冠状病毒的试剂；所述的检测新型冠状病毒的试剂包括：免疫荧光微球，所述的免疫荧光微球是偶联抗原的荧光微球，所述的抗原是新型冠状病毒的一种蛋白；识别抗新型冠状病毒抗原的物质。本发明还提供了荧光微球标记的免疫层析法检测新冠病毒抗体的方法及相关的试剂、试纸条。结果显示，本发明的试纸条的检测准确率90%以上，5‑10分钟内就可以判断结果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
随着新型冠状病毒病（COVID-19) 的暴发和在全球的迅速蔓延，病毒（SARS-CoV-2）核酸反转录聚合酶链式扩增（RT-PCR）检测已成为诊断SARS-CoV-2感染的标准方法，但这些实时PCR检测试纸条有很多局限性，假阴性率过高，迫切需要一种准确、快速的检测方法，快速发现大量感染患者和无症状携带者，防止病毒传播，确保患者得到及时治疗。目前从分子层面上诊断SARS-COV-2包括有核酸的检测方法和抗原/抗体的免疫检测方法，基于核酸的检测方法包括病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序。目前已批准在临床上使用的核酸检测试纸条，存在操作繁琐、耗时长、需要集中送检和专业设备和人员等限制，有很高的技术门槛，大大的限制了核酸检测方法的使用和便捷性，同时目前临床上发现假阴性率偏高。荧光微球是一种处于纳米级（100-300 nm）的荧光发光材料，其所具有的表面效应、量子效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等特性赋予了他们独特的光学、热学、力学及化学活性。荧光微球可用于产生不同类型的检测信号、放大检测信号的强度及简化检测过程等，因此基于纳米材料的体外诊断技术具有广阔的应用前景。目前荧光微球由于其良好的生物相容性、生物可降解性等，在生物医学领域得到了广泛的研究。
发明内容
本发明目的在于：提供一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条，以便准确、快速的检测、发现新冠病毒的抗体。
本发明的再一目的在于：提供一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条的制备方法。
本发明的又一目的在于：提供一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条在检测检测新冠病毒抗体中的应用。
本发明目的通过下述方案实现：一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，使用含有荧光微球标记的免疫层析法检测新型冠状病毒。
免疫荧光微球，使用蛋白标记荧光微球，所述的免疫荧光微球中，抗体与荧光微球的质量比例为（1-10）：40。所述的试纸包括上样垫、结合垫、吸收垫、反应膜；所述的上样垫，作为待测样品加入的部位，与结合垫以及反应膜连通；所述的结合垫，与免疫荧光微球结合；所述的反应膜，连接新冠病毒抗原，所述的新冠病毒抗原识别新冠病毒抗体；所述的吸收垫，吸收未与结合垫或者反应膜结合而留存的液体所含物质。本发明提供一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）荧光微球偶联物的制备：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球200 – 400 μg，加入0.05 mL偶联液溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC ) 100 μg和0.05mL偶联液溶解的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05 mL pH 8.0 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）重悬；
b. 偶联：向荧光微球加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗（CR2 ）10 μg于37℃反应0.5h后至于4℃冰箱过夜；
c. 封闭：将荧光微球从4℃冰箱取出，加入封闭液0.3 mL，加入5% 吐温20（Tween-20） 0.1 mL，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50μL保存液保存；
（2）荧光微球偶联物固定的操作步骤：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:50 - 1:100稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存；
（3）包被膜的制备步骤：
a. 稀释：根据所需要的抗原和抗体浓度，将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜；
（4）将NC膜、样品垫、结合垫、吸水纸按照图1的结构组装在一起后切成4 mm的细条，放入外壳中，即为所制备的试纸条。
本发明提供一种荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条在检测检测新冠病毒抗体中的应用。
使用上述试纸条在紫外光下检测新型冠状病毒抗体的方法。
性能分析：
样品来源：阳性标准品P1-P5，阴性 标准品N1-N2（购自中国食品药品检定研究院国家药品标准物质）。将标准品稀释成不同浓度后对试纸条进行标准品测试，紫外灯照射下测试结果如图3，条带从上到下依次为N1、N2、P1、P2、P3、P4、P5的测试结果，准确率为100%。
为了达到上述目的，本发明研究了可以使用的检测手段。除了检测病毒的核酸外，还有病毒病原检测法和抗体检测法。抗体检测方法主要是针对抗体IgG和IgM快速诊断试纸条，以新型冠状病毒的S蛋白作为包被抗原和标记抗原，利用双抗原夹心原理，检测临床样本中针对病毒核蛋白的特异性抗体，该方法可以在15分钟内定性检测结果，同时无需复杂设备，适合初级医院的初筛，该方法适合定性筛查，可以在短期内大规模的筛查人群。基于病毒抗原的检测是制备特异性抗体，检测样本中特异性的病毒抗原，该方法既可以开发成应用于一线的快速定性检测方法，也可以开发成定量检测的检测方法。
本发明技术方案带来的有益效果：本发明利用荧光微球具有独特的光、电、热性能，可用于产生不同类型的检测信号、放大检测信号的强度及简化检测过程，将荧光微球与特异性抗原进行偶联，利用双抗原夹心原理，将新型冠状病毒的S蛋白作为包被抗原来捕获针对新冠的特异性抗体，检测临床样本中针对病毒核蛋白的特异性抗体，开发出了一套简易通过紫外光照射下颜色变化就可以判断结果的的试纸条检测方法。该方法可以在15分钟内定性的检测结果，与传统方法相比，荧光微球的检测试纸条显色速度快，灵敏度高。
附图说明
图1是试纸条结构图；
图2是试纸条不同结果示意图；
图3是检测结果示例；
图中标号说明：
1——样品垫；
2——结合垫；
3——NC膜；
4——吸水垫。
具体实施例
本发明中：
偶联液：50 mM MES溶液，pH 6.0；20 mM PB溶液，pH 8.0
封闭液：20 mM PB溶液，pH 7.4，2% BSA，0.1% Proclin300
保存液：10 mM PBS溶液，pH 7.4，0.5% BSA，0.05% Tween-20，0.5%蔗糖，0.1%Proclin300
实施例一
一种荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条，包括使用蛋白标记荧光微球的免疫荧光微球，使用含有荧光微球标记的免疫层析法检测新型冠状病毒，按以下步骤制备：
（1）制备免疫荧光微球：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球200 μg，加入0.05 mL偶联液溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC ) 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05 mLpH 8.0 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；
b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg，于37℃反应0.5h后至于4℃冰箱过夜；
c. 封闭：取出4℃的步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 0.1 mL的Tween-20，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50μL保存液保存；
（2）荧光微球偶联物的固定：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:50稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合了免疫荧光微球的结合垫；
（3）反应膜的制备：
a. 稀释：根据所需要的抗原和抗体浓度，将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、NC膜、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；
（4）从左到右依序将样品垫1、结合垫2、NC膜3、吸水垫4组装在一起后切成4 mm的细条，产品如图1所示，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。
本实施例中，所述的样品垫，作为待测样品加入的部位，与结合垫以及反应膜NC膜连通；所述的结合垫，结合了免疫荧光微球；NC膜，连接新冠病毒抗原，所述的新冠病毒抗原识别新冠病毒抗体；所述的吸收垫，吸收未与结合垫或者反应膜结合而留存的液体所含物质。
如图2所示，图2A中检测样中不含病毒SARS-CoV-2，测试结果为阴性，T线消失；图2B中，检测样中含有病毒SARS-CoV-2，测试结果为阳性，T线和C线都呈现。
实施例二
一种荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条，与实施例一步骤相近，按以下步骤制备：
（1）制备免疫荧光微球：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球300 μg，加入0.05 mL偶联液溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC ) 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05 mLpH 8.0 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；
b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg，于37℃反应0.5h后至于4℃冰箱过夜；
c. 封闭：取出4℃的步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 0.1 mL的Tween-20，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50μL保存液保存；
（2）荧光微球偶联物的固定：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:80稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合了免疫荧光微球的结合垫；
（3）反应膜的制备：
a. 稀释：根据所需要的抗原和抗体浓度，将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、NC膜、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；
（4）从左到右依序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫组装在一起后切成4 mm的细条，产品结构与实施例一相同，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。
实施例三
一种荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条，与实施例一步骤相近，按以下步骤制备：
（1）制备免疫荧光微球：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球400 μg，加入0.05 mL偶联液溶解的EDC 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的NHS 100 μg，于37℃反应0.5h，10000rpm离心后用0.05 mL pH 8.0 磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；
b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg，于37℃反应0.5h后至于4℃冰箱过夜；
c. 封闭：取出4℃步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 0.1 mL的Tween-20，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50μL保存液保存，得高浓度的荧光微球偶联物；
（2）荧光微球偶联物的固定：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:100稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将步骤c得到的玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合了免疫荧光微球的结合垫；
（3）反应膜的制备：
a. 稀释：将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4 mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、NC膜、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；
（4）从左到右依序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫组装在一起后切成4 mm的细条，产品结构与实施例一相同，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。
性能分析：
样品来源：阳性标准品P1-P5和阴性标准品N1-N2购自中国食品药品检定研究院国家药品标准物质。将标准品稀释成不同浓度后对试纸条进行标准品测试，紫外灯照射下测试结果如图3，条带从上到下依次为N1、N2、P1、P2、P3、P4、P5的测试结果，样品N1、N2的测试结果为T线消失，P1、P2、P3、P4、P5的测试结果为T线和C线均清晰显示，准确率为100%。
Claims (10)
1.一种荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，包括使用蛋白标记荧光微球的免疫荧光微球，所述的免疫荧光微球中，抗体与荧光微球的质量比例为（1-10）：40，抗体选用新型冠状病毒RBD蛋白和新型冠状病毒蛋白二抗CR2，使用含有荧光微球标记的免疫层析法检测新型冠状病毒。
2.根据权利要求1所述的荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，检测试纸条包括样品垫、结合垫、吸收垫、反应膜；所述的样品垫，作为待测样品加入的部位，与结合垫以及反应膜连通；所述的结合垫，与免疫荧光微球结合；所述的反应膜，连接新冠病毒抗原，所述的新冠病毒抗原识别新冠病毒抗体；所述的吸收垫，吸收未与结合垫或者反应膜结合而留存的液体所含物质。
3.一种根据权利要求1或2所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备免疫荧光微球：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球200 – 400 μg，加入0.05mL偶联液溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC ) 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05mL pH 8.0 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；
b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg于37℃反应0.5h后至于4℃过夜；
c. 封闭：取出4℃的步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 吐温20（Tween-20）0.1 mL，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50 μL保存液保存；
（2）荧光微球偶联物的固定：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:（50 -100）稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合垫；
（3）反应膜的制备：
a. 稀释：根据所需要的抗原和抗体浓度，将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4 mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；
（4）依序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫组装在一起后切成4 mm的细条，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。
4.根据权利要求3所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的偶联液：50 mM MES溶液，pH 6.0；20 mM PB溶液，pH 8.0。
5.根据权利要求3所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的封闭液：20 mM PB溶液，pH 7.4，2% BSA，0.1% Proclin300。
6.根据权利要求3所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的保存液：10 mM PBS溶液，pH 7.4，0.5% BSA，0.05% Tween-20，0.5%蔗糖，0.1% Proclin300。
7.根据权利要求3至6所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：
（1）制备免疫荧光微球：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球200 μg，加入0.05 mL偶联液溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC ) 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05 mL pH8.0 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；
b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg，于37℃反应0.5h后至于4℃冰箱过夜；
c. 封闭：取出4℃的步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 0.1 mL的Tween-20，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50 μL保存液保存；
（2）荧光微球偶联物的固定：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:50稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合了免疫荧光微球的结合垫；
（3）反应膜的制备：
a. 稀释：根据所需要的抗原和抗体浓度，将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4 mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、NC膜、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；
（4）从左到右依序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫组装在一起后切成4 mm的细条，产品如图1所示，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。
8.根据权利要求3至6所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：（1）制备免疫荧光微球：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球300 μg，加入0.05 mL偶联液溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC ) 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05 mL pH8.0 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；
b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg，于37℃反应0.5h后至于4℃冰箱过夜；
c. 封闭：取出4℃的步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 0.1 mL的Tween-20，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50 μL保存液保存；
（2）荧光微球偶联物的固定：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:80稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合了免疫荧光微球的结合垫；
（3）反应膜的制备：
a. 稀释：根据所需要的抗原和抗体浓度，将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4 mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、NC膜、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；
（4）从左到右依序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫组装在一起后切成4 mm的细条，产品结构与实施例一相同，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。
9.根据权利要求3至6所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：（1）制备免疫荧光微球：
a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球400 μg，加入0.05 mL偶联液溶解的EDC 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的NHS 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05 mL pH 8.0 磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；
b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg，于37℃反应0.5h后至于4℃冰箱过夜；
c. 封闭：取出4℃步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 0.1 mL的Tween-20，于37℃反应0.5h；
d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50 μL保存液保存，得高浓度的荧光微球偶联物；
（2）荧光微球偶联物的固定：
a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；
b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:100稀释到工作浓度，混匀；
c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；
d. 干燥：将步骤c得到的玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合了免疫荧光微球的结合垫；
（3）反应膜的制备：
a. 稀释：将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4 mg/mL；C线：1 mg/mL；
b. 贴膜：取底板、NC膜、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；
c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；
d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；
（4）从左到右依序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫组装在一起后切成4 mm的细条，产品结构与实施例一相同，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。
10.一种根据权利要求1或2所述荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条在检测检测新冠病毒抗体中的应用。
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