CN111812335A - 保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法以及在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用 - Google Patents

保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法以及在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了保持抗原‑荧光微球偶联物中抗原活性的方法以及在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，解决了现有的抗原的偶联中，抗原偶联至微球表面后也可能由于空间位阻的原因，使得蛋白构象无法伸展导致抗原活性下降，抗原结构中具备免疫活性的部分极有可能参与偶联化学反应导致抗原活性下降，从而导致抗体检测试剂的灵敏度较低的问题，本发明包括将荧光微球与抗原偶联得到抗原‑荧光微球偶联物，然后再次偶联抗原，得到抗原‑抗原‑荧光微球偶联物。本发明具有新冠病毒抗原活性高，检测灵敏，准确度高等优点。

Description

保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法以及在新冠病 毒抗体层析检测试剂中的应用
技术领域
本发明涉及免疫层析技术领域，具体涉及保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法以及在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用。
背景技术
目前针对新型冠状病毒的检测方式主要分为两类，一类是对病毒的直接检测，如病原学“金标准”核酸检测，是检测病毒基因中某些特定的核酸序列；另一类为间接检测，如新冠病毒特异性血清抗体检测，当病毒入侵人体后，人体免疫系统会产生大量免疫球蛋白，其中最常见的就是IgG和IgM，它们是机体对于病毒免疫应答的关键组成部分，因此通过对新冠病毒疑似案例的血清检测也可以很准确的检测出患者是否感染了新冠病毒。通常病毒入侵人体后最早产生的是IgM抗体，多在发病3-5天后开始出现阳性反应，然后产生IgM的B细胞进一步成熟，大量产生IgG，IgG持续时间较长。因此，往往IgM抗体阳性表示近期感染，IgG抗体阳性表示感染时间较长或既往感染。
核酸检测虽然作为检测病毒感染的病原学“金标准”，但这种检测方式对环境、运输、操作要求较高，呈现出特异性较强，灵敏度偏弱的特点。而抗体检测可以作为对核酸检测很好的补充，具有成本低、快速、可大规模操作的特点。
用于抗体检测的免疫诊断技术主要有免疫层析、化学发光、免疫比浊等。
其中免疫层析技术作为POCT(Point of care testing，即时检测)的重要分支始于20世纪80年代，以胶体金标记作为代表大量应用于各种体外诊断场景，但是与酶联免疫/化学发光这些方法学比较其也有相应的短板，主要表现在精密度差，灵敏度不足；因此在而二十世纪初各厂家为改善层析产品性能将胶体金更换为荧光物质，性能大幅提升。早期层析使用荧光素，后来逐渐转变为荧光微球，因为荧光微球含有更多的荧光物质，可有效放大荧光信号，提高检测灵敏度。
当前的抗原-荧光微球偶联一般采用化学偶联，先将微球表面基团(一般为羧基)使用化学物质(一般为EDC/NHS)活化，加入抗原，抗原的氨基与活化后的羧基结合，因此抗原固定至微球表面。
一般的抗体偶联中，由抗体的Fc端的氨基去结合微球上的羧基，而具有免疫活性的Fab端一般不参与偶联反应，因此抗体的活性得以很好的保持；而抗原的偶联中，抗原结构中具备免疫活性的部分极有可能参与偶联化学反应导致抗原活性下降；此外抗原偶联至微球表面后也可能由于空间位阻的原因，使得蛋白构象无法伸展导致抗原活性下降，从而造成抗体检测试剂的灵敏度较低。因此需要开发一种新的抗原-荧光微球偶联技术来解决抗原活性下降的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：现有的抗原的偶联中，抗原偶联至微球表面后也可能由于空间位阻的原因，使得蛋白构象无法伸展导致抗原活性下降，抗原结构中具备免疫活性的部分极有可能参与偶联化学反应导致抗原活性下降，从而导致抗体检测试剂的灵敏度较低。
本发明通过下述技术方案实现：
保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法，包括将荧光微球与抗原偶联得到抗原-荧光微球偶联物，然后再次偶联抗原，得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
本发明考虑抗原偶联中，抗原偶联至微球表面后，由于抗原活性部分距离微球表面近，导致抗原所在区域空间小，抗原分布比较密集，抗原的蛋白构想伸展会受阻，导致抗原活性下降，另外，抗原结构中具备免疫活性的部分极有可能在密集的空间下对偶联剂更多地包裹和参与偶联化学反应导致抗原活性下降，因此，为了增大抗原活性部分的伸展空间，对抗原-荧光微球偶联物再次偶联抗原，得到舒展开的抗原-抗原-荧光微球偶联物，即双重抗原-荧光微球偶联物。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法，通过EDC/NHS将荧光微球上的羧基进行活化，偶联抗原，得到抗原-荧光微球偶联物，之后再采用EDC/NHS对抗原-荧光微球偶联物中抗原的羧基再次进行活化，再次偶联抗原，得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，包括如下步骤：
步骤1：将荧光微球与新冠病毒的抗原偶联得到抗原-荧光微球偶联物；
步骤2：将步骤1中得到的抗原-荧光微球偶联物与新冠病毒的抗原再次偶联得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，所述步骤1中的具体方法为：通过EDC/NHS将荧光微球上的羧基进行活化，偶联新冠抗原得到抗原-荧光微球偶联物。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，所述步骤2中的具体方法为：通过EDC/NHS再对抗原-荧光微球偶联物中抗原的羧基再次进行活化，再次偶联新冠抗原得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，所述步骤1中抗原-荧光微球偶联物的具体制备方法包括如下步骤：
步骤11：离心处理荧光微球得到微球沉淀1；
步骤12：向步骤11中的微球沉淀1中加入偶联缓冲液，再加入偶联剂并孵育，离心得到微球沉淀2；
步骤13：向微球沉淀2中加入偶联缓冲液，混匀后，加入新冠病毒抗原并孵育，最后离心得微球沉淀3，即抗原-荧光微球偶联物。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，所述步骤2中抗原-抗原-荧光微球偶联物的具体制备方法包括如下步骤：
步骤21：向抗原-荧光微球偶联物中加入偶联缓冲液，再加入偶联剂并孵育，离心得到微球沉淀4；
步骤22：向微球沉淀4中加入偶联缓冲液，混匀后，加入新冠病毒抗原并孵育，再加入封闭液，再次孵育，最后离心得到微球沉淀5；
步骤23：向微球沉淀5中加入保存液混匀，得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，新冠病毒抗体层析检测用到新冠病毒抗体层析检测试纸条，所述新冠病毒抗体层析检测试纸条包括PVC底板、吸水纸、玻纤垫和硝酸纤维素膜，所述吸水纸、玻纤垫和硝酸纤维素膜均连接在底板上，所述玻纤垫上附着有抗原-抗原-荧光微球偶联物。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，所述玻纤垫的制备方法为：将处理液喷涂于玻纤一侧，将所述抗原-抗原-荧光微球偶联物喷涂于玻纤另一侧，所述处理液包括阻断剂10％，蔗糖2％，吐温200.5％，抗红细胞抗体1％和50mM PBS ph 7.2。
本发明优选的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，所述硝酸纤维素膜的制备方法为：将鼠抗人IgM单克隆抗体，使用稀释液稀释至1mg/mL，划线于纤维素膜上一侧作为IgM抗体检测线；将鼠抗人IgG单克隆抗体使用稀释液稀释至0.5mg/mL，划线于纤维素膜上作为IgG抗体检测线；划膜量为1ul/cm，烘干，所述稀释液包括2％蔗糖和50mMPBS ph7.2。
本发明具有如下的优点和有益效果：
1、本发明的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法，通过在抗原-荧光微球偶联物中再偶联一个抗原，使得带活性部位的抗原能在空间舒展开，大大提高了抗原活性，有效提高了检测试剂的灵敏度。
2、本发明的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，通过在抗原-荧光微球偶联物中再偶联一个抗原得到的抗原-抗原-荧光微球偶联物并应用于新冠病毒抗体层析检测中，由于抗原活性增强，检测试剂的灵敏度大大提高。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明的抗原-抗原-荧光微球偶联物的结构示意图。
图2为传统的抗原-荧光微球偶联与本发明的抗原-抗原-荧光微球偶联物在阳性临床样本中检测IgM抗体的对比图。
图3为本发明的传统的抗原-荧光微球偶联与抗原-抗原-荧光微球偶联物在阳性临床样本中检测IgG抗体的对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
1、抗原-抗原-荧光微球偶联物的制备
(1)取出500ul荧光微球(1％浓度W/V，绿色荧光-激发475nm-发射525nM)放入离心管中。
(2)离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
(3)加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀。
(4)加入20ul EDC溶液(200mM)，20ul sulfo-NHS溶液(200mM)，混匀，并在转盘混匀器上孵育30min。
(5)离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
(6)加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀后加入0.1mg新冠抗原，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
(7)离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm
转速)10min，使微球沉降，去除上清。
(8)加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀。
(9)加入20ul EDC溶液(200mM)，20ul sulfo-NHS溶液(200mM)，混匀，并在转盘混匀器上孵育30min。
(10)离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
(11)加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀后加入0.1mg新冠抗原，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
(12)加入封闭液(1％BSA水溶液)，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
(13)离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
14.加入500ul保存液(0.5％BSA，2％蔗糖，Tirs-HCl ph 8.0)，混匀。
采用以上方法得到的抗原-抗原-荧光微球偶联物的结构如图1所示，其中Ag(nCoV)为新冠抗原，-C＝N-为偶联化学键。
2、新型冠状病毒荧光层析检测试纸条的结构及其制备
新冠病毒抗体层析检测试纸条包括PVC底板、吸水纸、玻纤垫和硝酸纤维素膜，所述吸水纸、玻纤垫和硝酸纤维素膜均粘接在底板上，粘贴部分相互重合2mm，组装并斩切后成为4mm宽的试纸条，装入卡壳，封装在铝箔袋中。
具体制备步骤如下：
(A)玻纤垫的制备：将玻纤裁切为3*3cm的规格，使用喷金仪将处理液(阻断剂10％，蔗糖2％，吐温20 0.5％，抗红细胞抗体1％，50mM PBS ph 7.2)喷涂于玻纤一侧，喷量为4ul/cm。
将前述抗原-抗原-荧光微球偶联物喷涂于玻纤另一侧，45℃烘干16h。
(B)硝酸纤维素膜的制备：将鼠抗人IgM单克隆抗体，使用稀释液(2％蔗糖，50mMPBS ph7.2)稀释至1mg/mL，划线于纤维素膜上一侧作为IgM抗体检测线；将鼠抗人IgG单克隆抗体使用稀释液(2％蔗糖，50mM PBS ph7.2)稀释至0.5mg/mL，划线于纤维素膜上作为IgG抗体检测线；划膜量1ul/cm，45℃烘干16h。
(C)将PVC底板上贴好吸水纸、制备好的玻纤垫，硝酸纤维素膜，斩切为4mm宽的试纸条，装入卡壳，封装至铝箔袋。
3、测试
将新冠抗体阳性样本和检测试剂恢复至室温，取5ul样本加入至400ul稀释液(50mM PBS ph7.2)中，混匀，取75ul加入至试纸条中，8min后使用荧光检测仪读取结果。
对比例
为了对比采用抗原-荧光微球偶联物和抗原-抗原-荧光微球偶联物对新冠病毒的检测效果，采用抗原-荧光微球偶联物制作新型冠状病毒荧光层析检测试纸条，其中传统的抗原-荧光微球偶联物的制备方法与本发明的抗原-抗原-荧光微球偶联物的制备相比，区别点在于：不包括步骤(7)-(11)，即不进行第二次抗原的偶联。
将对比例与实施例1的结果进行对比，共计采取10个阳性临床样本和10个阴性临床样本，然后对比测试，结果如下表1、图2和图3所示，所述传统偶联表示抗原-荧光微球偶联，所述双重偶联表示抗原-抗原-荧光微球偶联。
表1传统偶联和本发明偶联检测的新冠病毒的IgM和IgG
Figure BDA0002596159600000061
Figure BDA0002596159600000071
从图2和图3可以看出，采用抗原-抗原-荧光微球偶联物检测的IgM量和IgG量均明显大于采用抗原-荧光微球偶联物检测的，对检测的准确性进行统计，在10个阳性临床样本中，通过传统偶联检测的近期感染新冠病毒的数量(IgM>1.3)仅仅为3个，检测准确率只有30％，而采用双重偶联检测的近期感染新冠病毒的数量(IgM>1.3)为10个，检测准确率100％。
从以上结果证明新冠病毒抗原的活性得到保持，检测信号得到了明显增强，检测准确率得到明显提高。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法，其特征在于，包括将荧光微球与抗原偶联得到抗原-荧光微球偶联物，然后再次偶联抗原，得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
2.根据权利要求1所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法，其特征在于，通过EDC/NHS将荧光微球上的羧基进行活化，偶联抗原，得到抗原-荧光微球偶联物，之后再采用EDC/NHS对抗原-荧光微球偶联物中抗原的羧基再次进行活化，再次偶联抗原，得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
3.保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将荧光微球与新冠病毒的抗原偶联得到抗原-荧光微球偶联物；
步骤2：将步骤1中得到的抗原-荧光微球偶联物与新冠病毒的抗原再次偶联得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
4.根据权利要求3所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，所述步骤1中的具体方法为：通过EDC/NHS将荧光微球上的羧基进行活化，偶联新冠抗原得到抗原-荧光微球偶联物。
5.根据权利要求3所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，所述步骤2中的具体方法为：通过EDC/NHS再对抗原-荧光微球偶联物中抗原的羧基再次进行活化，再次偶联新冠抗原得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
6.根据权利要求3所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，所述步骤1中抗原-荧光微球偶联物的具体制备方法包括如下步骤：
步骤11：离心处理荧光微球得到微球沉淀1；
步骤12：向步骤11中的微球沉淀1中加入偶联缓冲液，再加入偶联剂并孵育，离心得到微球沉淀2；
步骤13：向微球沉淀2中加入偶联缓冲液，混匀后，加入新冠病毒抗原并孵育，最后离心得微球沉淀3，即抗原-荧光微球偶联物。
7.根据权利要求3所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，所述步骤2中抗原-抗原-荧光微球偶联物的具体制备方法包括如下步骤：
步骤21：向抗原-荧光微球偶联物中加入偶联缓冲液，再加入偶联剂并孵育，离心得到微球沉淀4；
步骤22：向微球沉淀4中加入偶联缓冲液，混匀后，加入新冠病毒抗原并孵育，再加入封闭液，再次孵育，最后离心得到微球沉淀5；
步骤23：向微球沉淀5中加入保存液混匀，得到抗原-抗原-荧光微球偶联物。
8.根据权利要求3-7任一项所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，新冠病毒抗体层析检测用到新冠病毒抗体层析检测试纸条，所述新冠病毒抗体层析检测试纸条包括PVC底板、吸水纸、玻纤垫和硝酸纤维素膜，所述吸水纸、玻纤垫和硝酸纤维素膜均连接在底板上，所述玻纤垫上附着有抗原-抗原-荧光微球偶联物。
9.根据权利要求8所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，所述玻纤垫的制备方法为：将处理液喷涂于玻纤一侧，将所述抗原-抗原-荧光微球偶联物喷涂于玻纤另一侧，所述处理液包括阻断剂10％，蔗糖2％，吐温20 0.5％，抗红细胞抗体1％和50mM PBS ph 7.2。
10.根据权利要求8所述的保持抗原-荧光微球偶联物中抗原活性的方法在新冠病毒抗体层析检测试剂中的应用，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的制备方法为：将鼠抗人IgM单克隆抗体，使用稀释液稀释至1mg/mL，划线于纤维素膜上一侧作为IgM抗体检测线；将鼠抗人IgG单克隆抗体使用稀释液稀释至0.5mg/mL，划线于纤维素膜上作为IgG抗体检测线；划膜量为1ul/cm，烘干，所述稀释液包括2％蔗糖和50mM PBS ph7.2。
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