CN111208292B - 肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 - Google Patents

肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法,其包括,荧光免疫层析试纸条、微球溶液、样品稀释液;所述荧光免疫层析试纸条,包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板,所述层析膜上设置检测线和质控线,所述检测线上涂有抗人IgM抗体;所述微球溶液中,含有偶联着MP抗原的微球。本发明通过采用免疫层析试纸条提高了检测速率。通过采用荧光物质实现定量检测。通过在现有试纸条基础上改变了试纸条的构造,去除结合垫;并采用了不同的检测步骤,从而显著提高了特异荧光信号的强度和灵敏度,降低了检测背景干扰和非特异结合。

Description

肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用 方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域,具体涉及肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法。
背景技术
肺炎支原体(MP)是一种无细胞壁的原核细胞,能与宿主呼吸道粘膜上皮细胞的甘露糖胺丙酮酸受体结合并产生毒素,导致肺炎。经血清流行病学研究显示:在中国20.7-38.9%的社区获得性肺炎患者由MP引起,居成人社区获得性肺炎病原体的首位。MP除导致呼吸道症状外,20-25%的病例可出现脑膜炎、心肌炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜等肺外表现。及时有效的诊断可有效控制MP感染病情的加重,降低死亡率。因此,MP的准确诊断具有重要的临床意义。
肺炎支原体的诊断方法主要依靠血清学检测,已报道的酶联免疫分析法(ELISA)和化学发光法(CLA)均可以检测特异性的IgG、IgM等抗体,而这些亚型与感染的病程相关。MP-IgM阳性可作为早期或急性感染的诊断指标,一般在感染约7天后可被检测到,10-30天后达到峰值,76.5%的患者2周后降低至无法检测到的程度。单次测定MP-IgM阳性即可判定为MP新近感染。因此临床强调对更加准确可靠的诊断技术的研制需求。
现用的ELISA和CLA操作简便,可定量检测MP-IgM,但耗时长,整个反应时间需要1个小时以上,且ELISA无法满足随到随检需求,因此若能保证试剂符合灵敏、定量技术要求的同时,提供一种快速、单人份检测试剂,则有利于临床医生快速诊断,缩短患者等候时间。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面,本发明提供一种肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒。
为解决上述技术问题,本发明提供了如下技术方案:一种肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒,其包括:
荧光免疫层析试纸条、微球溶液、样品稀释液;
所述荧光免疫层析试纸条,包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板,所述层析膜上设置检测线和质控线,所述检测线上涂有抗人IgM抗体;
所述微球溶液中,含有偶联MP抗原的微球,微球的浓度为5~50μg/mL;所述MP抗原与微球偶联反应的质量比为1:10~100。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的一种优选方案:所述样品稀释液中含有蛋白质和表面活性剂。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的一种优选方案:所述样品稀释液包括含有0.1~1.0%BSA和0.1~2.0%S9的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的一种优选方案:所述荧光微球,其为聚苯乙烯材质;所述微球,其直径为100~500nm。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的一种优选方案:所述荧光微球,其荧光物质包括异硫氰酸荧光素或镧系元素;所述层析膜包括硝酸纤维素膜。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的一种优选方案:所述检测线,其抗人IgM抗体的含量为20~250ng/mm2
作为本发明的另一个方面,本发明提供制备所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的方法,其包括,制备微球溶液,所述制备微球溶液的制备方法为:
活化微球:将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入微球进行活化;
偶联:加入2-(N-吗啉)乙磺酸溶液清洗后,再加入MP抗原或抗人IgG抗体,按抗原与微球的质量比为1:10~100进行偶联;
封闭:加入封闭液进行封闭;
洗涤:去除未反应物,获得偶联微球;
稀释:将偶联得到的微球稀释至10~50μg/mL。
作为本发明所述肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的方法的一种优选方案:所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液,其pH为4.5;所述活化液,含有碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺;所述封闭液,含有10%牛血清白蛋白;所述洗涤,其洗涤液为含有Tween-20的Tris-HCl缓冲液。
作为本发明的另一个方面,本发明提供所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的使用方法:将样品滴加在样品垫中孵育5~30min;
向样品垫加入微球溶液,孵育5~30min;
进行荧光检测,获得样本值。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒的使用方法的一种优选方案:所述血液样品,其在滴加到样品垫之前先进行稀释,稀释倍数为50~1000倍。
本发明的有益效果:本发明通过采用免疫层析试纸条提高了检测速率。通过采用荧光物质实现定量检测。通过在现有试纸条基础上改变了试纸条的构造,去除结合垫;并采用了不同的检测步骤,即:两步法反应,第一步加入样本孵育,第二步加入示踪物(微球抗原偶联物),从而显著提高了特异荧光信号的强度和灵敏度,降低了检测背景干扰和非特异结合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为MP-IgM免疫层析试纸条剖面图(a.样品垫b.检测线c.质控线d.吸水纸e.层析膜f.底板)。
图2为本发明测定人血液MP-IgM的荧光免疫层析试剂的标准曲线。
图3为实施例1与对照例1检测MP-IgM高值样本的扫描曲线,其中,实线为实施例1方法扫描曲线,虚线为对照例1方法曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1:
检测MP-IgM的试纸条,包括底板,以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于所述底板上的吸水纸、NC膜以及样品垫;其中,NC膜e粘覆于所述底板f的中间部位;吸水纸d、NC膜e以及所述样品垫a之间,依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠;NC膜上设有相间隔的喷涂有抗人IgM的T线b,以及喷涂有质控二抗的C线c;其中,T线b靠近所述样品垫a设置,C线c靠近吸水纸d设置。
高分子纳米微球含有铕离子,含有铕离子的高分子纳米微球的设置减少了稀土离子在样品溶液的猝灭,提高了稀土离子发出的荧光强度,因此不仅提高了检测的精确度,而且便于检测结果的显示和操作者的观察。高分子纳米微球的平均直径为200nm。
试纸条的制备方法为:
(1)NC膜的制备:使用含1%蔗糖的pH 7.4的Tris-HCl缓冲液,分别将羊抗人IgM和羊抗兔二抗稀释,使用定量喷膜仪以100ng/mm2的量将两者分别喷于硝酸纤维素膜的T线(检测线)和C线(质控线)上,37℃烘干1h,加入干燥剂封存备用。
(2)试纸条的组装:在底板中间先铺设NC膜,然后在与C线相临近的一端铺吸水纸,使吸水纸与NC膜部分重叠;在与T线相临近的一端铺样品垫。用斩切机切按0.4cm宽度斩切后,在湿度低于30%RH的环境下装入塑料卡壳中。
检测微球溶液的制备:含有20μg/mL的MP-IgM微球和1μg/mL的兔IgG微球混合物。
MP-IgM微球的制备:
材料:
①进口微球(phosphorex公司)、MP抗原(菲鹏公司);
②溶液:
MES溶液pH4.5
活化液:用超纯水将EDC、NHS稀释至10mg/ml
封闭液:10%BSA+pH7.4 Tris-HCl
清洗液:0.05M Tris-HCl pH7.4+Tween-20
MP-IgM检测微球溶液制备步骤:
A.活化:取50μl微球加入500μl MES,再加入50μl活化液。室温混匀活化0.5h。
B.偶联:活化后离心,500μl MES继续清洗,再加入MP抗原,使MP抗原:微球质量比=1:60。25℃混匀2h。
C.封闭:加入50μl封闭液,25℃混匀封闭0.5h。
D.封闭结束后离心,加入500μl清洗液清洗三次。
兔IgG微球的制备:
方法同于MP-IgM微球的制备,仅抗体微球偶联反应时质量比不同,此时兔IgG:微球质量比=1:40。
使用本发明试纸条对MP-IgM定量检测的方法:以MP-IgM标准品作为样品,取6个不同的浓度,分别为0、1.5、5、15、50、150U/mL,每个浓度做2个平行样,进行检测。
准备:打开仪器电源开关,预热;试纸条、微球溶液、样品稀释液、样品等室温平衡;
检测:取50μl已稀释的样品(按照1:500稀释)滴加在所述的试纸条的样品垫中,孵育15min;向样品垫加入已稀释的微球溶液,孵育5min;荧光扫描所述T线和C线。若所述C线区域出现荧光发射峰,则表明该试纸条有效,反之则无效。
数值分析与整理:检测结果(见表1)以荧光信号值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,建立双对数方程并拟合标准曲线(图2)。
表1 MP-IgM标准品的检测结果
偏差的计算方法为:T/C的标准差除以均值。
图1为MP-IgM免疫层析试纸条剖面图(a.样品垫b.T线c.C线d.吸水纸e.NC膜f.底板)。图2为本发明测定人血液MP-IgM的荧光免疫层析试剂的标准曲线。
测得采用本发明试剂盒检测特异度达到96%。本发明对MP-IgM最低检测限为0.11U/mL。
本发明将抗原与荧光微球偶联,并采用先滴加样品孵育,然后再滴加偶联了抗原的微球溶液的两步法,意外的发现该方法能够显著降低背景噪声,显著提升了MP-IgM检测灵敏度,解决了MP-IgM检测易出现假阴性的技术难题。此外,本发明研究发现,检测试剂的选择及浓度、抗体与微球的比例均显著影响检测荧光信号值,对MP-IgM检测灵敏度(检测限)造成影响。
对照例1:
采用传统一步法检测:采用一步法同样检测实施例1中6个标准品,向试纸条样品垫中央加入50μl样品,孵育20min,检测结果见表2。可见一步法灵敏度显著低于本发明,且本底偏高。
表2 MP-IgM试纸条一步法检测结果
浓度 C线荧光 T线荧光 T/C 偏差
0 50751 37687 0.742586 15.2%
1.5 45786 54845 1.197855 21.2%
5 46781 62126 1.328018 10.6%
15 52109 177130 3.399221 8.2%
50 42888 390038 9.094339 3.6%
150 40185 775312 19.29357 5.1%
由图3可知,现有技术一步法检测容易产生高背景,微球在NC膜(尤其是样品垫与T线之间)上存在非特异性滞留。
图3为对照例1一步法与实施例1两步法检测MP-IgM高值样本的扫描图谱(实线为两步法曲线,虚线为一步法曲线)
对照例2:
将样品稀释液替换为不含蛋白质、不含表面活性剂的缓冲液,其余制备方法均与实施例1相同。
检测结果如下:
浓度 C线荧光 T线荧光 T/C 偏差
0 65182 17112 0.263 11.70%
1.5 59729 20200 0.338 14.90%
5 57221 25162 0.440 6.36%
15 60428 80521 1.333 7.41%
50 56994 191036 3.352 2.29%
150 55727 481255 8.636 3.28%
说明采用不含蛋白质和表面活性剂的样品稀释液,造成了本底高、特异性结合率低,不利于反应的充分进行。
对照例3:
将实施例1中MP抗原:微球质量比改为1:8,其余制备方法均与实施例1相同。
检测结果如下:
说明质量比过高造成了本底增加,T和T/C并未同步增长,反而较实施例1降低,因此不推荐此偶联方案。
对照例4:
将实施例1中MP抗原:微球质量比改为1:150,其余制备方法均与实施例相同。
检测结果如下:
浓度 C线荧光 T线荧光 T/C 偏差
0 47152 0 0.000 7.65%
1.5 50175 8215 0.164 3.43%
5 49628 20592 0.415 8.25%
15 43227 58186 1.346 11.67%
50 48185 157022 3.259 5.13%
150 51296 398629 7.771 2.85%
说明质量比过低,造成T和T/C明显降低,显著低于实施例结果,因此不推荐此偶联方案。
对照例5:
将实施例1方法改为:以MP抗原喷涂于检测线(T线),抗人IgM标记微球,作为对照,其余制备条件与实施例1相同,检测结果如下:
浓度 C线荧光 T线荧光 T/C 偏差
0 52158 52171 1.000 23.10%
1.5 46425 49526 1.067 12.32%
5 47113 77242 1.640 26.27%
15 50829 80521 1.584 10.24%
50 45128 102329 2.268 18.29%
150 46172 117879 2.553 6.28%
以上实验结果表明该对照方案本底高,特异性结合率低,无法准确、有效检测MP-IgM。实施例1方法在MP-IgM检测中具有灵敏、定量优势。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种荧光免疫层析试纸条在制备肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒中的应用,其特征在于:采用肺炎支原体抗体IgM的免疫检测试剂盒,所述免疫检测试剂盒包括荧光免疫层析试纸条、微球溶液、样品稀释液;
所述荧光免疫层析试纸条,包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板,所述层析膜上设置检测线和质控线,所述检测线上涂有抗人IgM抗体;
所述微球溶液中,含偶联有MP抗原的微球,微球的浓度为5~50μg/mL;所述MP抗原与微球偶联反应的质量比为1:10~100;
所述微球,其为聚苯乙烯材质;所述微球,其直径为100~500nm;
所述层析膜为硝酸纤维素膜;
所述检测线,其抗人IgM抗体的含量为20~250ng/mm2
将样品滴加在样品垫中孵育15min;向样品垫加入微球溶液,孵育5min;进行荧光检测,获得样本值;
所述样品稀释液包括0.1~1.0%BSA和0.1~2.0%S9。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述微球,其荧光物质包括异硫氰酸荧光素或镧系元素。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述免疫检测试剂盒,其制备方法包括制备含有偶联着MP抗原的微球,所述微球的制备方法为:
活化微球:将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入微球进行活化;
偶联:加入2-(N-吗啉)乙磺酸溶液清洗后,再加入MP抗原,按抗体与微球的质量比为1:10~100进行偶联;
封闭:加入封闭液进行封闭;
洗涤:去除未反应物,获得偶联微球;
稀释:将偶联得到的微球稀释至10~50μg/mL。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液,其pH为4.5;所述活化,其活化液含有碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺;所述封闭液,含有10%牛血清白蛋白;所述洗涤,其洗涤液为含有Tween-20的Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述样品,其在滴加到样品垫之前先进行稀释,稀释倍数为50~1000倍。
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