CN111239411B - 肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 - Google Patents

肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒，其包括，荧光免疫层析试纸条、微球溶液、样品稀释液；述荧光免疫层析试纸条，包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板，所述层析膜上设置检测线和质控线，所述检测线上涂有MP抗原；所述微球溶液中，其微球为偶联有抗人IgG抗体的微球。本发明通过采用免疫层析试纸条提高了检测速率。通过采用荧光物质实现定量检测。通过在现有试纸条基础上改变了试纸条的构造，去除结合垫；并采用了不同的检测步骤，从而显著提高了特异荧光信号的强度和灵敏度，增大了测量范围和准确性，降低了检测本底噪声。

Description

肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用 方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法。
背景技术
肺炎支原体(MP)是一种无细胞壁的原核细胞，能与宿主呼吸道粘膜上皮细胞的甘露糖胺丙酮酸受体结合并产生毒素，导致肺炎。经血清流行病学研究显示：在中国20.7～38.9％的社区获得性肺炎患者由MP引起，居成人社区获得性肺炎病原体的首位。MP除导致呼吸道症状外，20～25％的病例可出现脑膜炎、心肌炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜等肺外表现。及时有效的诊断可有效控制MP感染病情的加重，降低死亡率。因此，MP的准确诊断具有重要的临床意义。
肺炎支原体的诊断方法主要依靠血清学检测，已报道的酶联免疫分析法(ELISA)和化学发光法(CLA)均可以检测特异性的IgM、IgG等抗体，而这些亚型与感染的病程相关。MP～IgM阳性可作为早期或急性感染的诊断指标，一般在感染约7天后可被检测到，10～30天后达到峰值，76.5％的患者2周后降低至无法检测到的程度。MP-IgG常发病2周后出现，是MP感染最可靠的指标。双份血清4倍以上滴度上升提示近期感染，否则为既往感染。虽然单次测定MP-IgM阳性即可判定为MP新近感染，但阴性却不能排除感染。因此临床强调配对同时检测MP-IgM和-IgG对评价MP感染状况更有意义，同时也强调对更加准确可靠的诊断技术的研制需求。
现用的ELISA和CLA操作简便，可定量检测MP-IgG，但耗时长，整个反应时间都需要1个小时以上，且ELISA无法满足随到随检需求，因此若能保证试剂灵敏、定量技术要求的同时，若能提供一种快速、单人份检测试剂，则有利于临床医生快速诊断，缩短患者等候时间。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒，其包括，
荧光免疫层析试纸条、微球溶液、样品稀释液；
所述荧光免疫层析试纸条，包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板，所述层析膜上设置检测线和质控线，所述检测线上涂有MP抗原；
所述微球溶液中，其微球为偶联有抗人IgG抗体的微球，微球的浓度为5～50μg/mL；抗人IgG抗体与微球偶联反应时的质量比为1：10～100。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的一种优选方案：所述样品稀释液中含有蛋白质和表面活性剂。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的一种优选方案：所述样品稀释液包括含有0.1～1.0％BSA和0.1～2.0％S9的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的一种优选方案：所述荧光微球，其为聚苯乙烯材质；所述微球，其直径为100～500nm。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的一种优选方案：所述荧光微球，其荧光物质包括异硫氰酸荧光素或镧系元素；所述层析膜包括硝酸纤维素膜。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒，其中：所述检测线，其MP抗原的含量为5～150ng/mm2。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的方法的一种优选方案：包括制备微球溶液，所述制备微球溶液的制备方法为：
活化微球：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入微球进行活化；
偶联：加入2-(N-吗啉)乙磺酸溶液清洗后，再加入抗人IgG抗体，按抗体与微球的质量比为1：10～100进行偶联；
封闭：加入封闭液进行封闭；
洗涤：去除未反应物，获得偶联微球；
稀释：将偶联得到的微球稀释至10～50μg/mL。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的方法的一种优选方案：所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，其pH为4.5；所述活化液，含有碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；所述封闭液，含有10％牛血清白蛋白；所述洗涤，其洗涤液为含有Tween-20的Tris-HCl缓冲液。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的使用方法，其将样品滴加在样品垫中孵育5～30min；
向样品垫加入微球溶液，孵育5～30min；
进行荧光检测。
作为本发明所述的肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒的使用方法的一种优选方案：所述样品，其在滴加到样品垫之前先进行稀释，稀释倍数为50～1000倍。
本发明的有益效果：本发明通过采用免疫层析试纸条提高了检测速率。通过采用荧光物质实现定量检测。通过在现有试纸条基础上改变了试纸条的构造，去除结合垫；并采用了不同的检测步骤，即：两步法反应，第一步加入样本孵育，第二步加入示踪物(微球抗体偶联物)，从而显著提高了特异荧光信号的强度和灵敏度，降低了检测本底干扰和非特异结合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为MP-IgG免疫层析试纸条剖面图(a.样品垫b.检测线c.质控线d.吸水纸e.层析膜f.底板)。
图2为本发明测定人血液MP-IgG的荧光免疫层析试剂的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
检测MP-IgG的试纸条，包括底板，以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于所述底板上的吸水纸、NC膜以及样品垫；其中，NC膜e粘覆于所述底板f的中间部位；吸水纸d、NC膜e以及所述样品垫a之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；NC膜上设有相间隔的喷涂有MP抗原的T线b，以及喷涂有二抗的C线c；其中，T线b靠近所述样品垫a设置，C线c靠近吸水纸d设置。
高分子纳米微球含有铕离子，含有铕离子的高分子纳米微球的设置减少了稀土离子在样品溶液的猝灭，提高了稀土离子发出的荧光强度，因此不仅提高了检测的精确度，而且便于检测结果的显示和操作者的观察。高分子纳米微球的直径为200nm。
试纸条的制备方法为：
(1)NC膜的制备：使用含1％蔗糖的pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，分别将MP抗原(购自深圳菲鹏公司)和质控二抗(本实施例以羊抗鼠IgG为例，购自武汉华美公司)稀释，使用定量喷膜仪以100ng/mm2的量将两者喷于硝酸纤维素膜上，37℃烘干1h，加入干燥剂封存备用。
(2)试纸条的组装：在底板中间先铺设NC膜，然后在与C线相临近的一端铺吸水纸，使吸水纸与NC膜部分重叠；在与T线相临近的一端铺样品垫。用斩切机切按0.4cm宽度斩切后，在湿度低于30％RH的环境下装入塑料卡壳中。
MP-IgG检测微球溶液的制备：
材料：
①进口微球(phosphorex公司)、抗人IgG的抗体(本实施例以鼠抗人IgG的抗体为例，抗体购自Abcam公司，ab200699)；
②溶液：
MES溶液pH4.5
活化液：用超纯水将EDC、NHS稀释至10mg/ml
封闭液：10％BSA+pH7.4 Tris-HCl
清洗液：0.05M Tris-HCl pH7.4+Tween-20
MP-IgG检测微球溶液制备步骤：
A.活化：取50μl微球加入500μl MES，再加入50μl活化液。室温混匀活化0.5h。
B.偶联：活化后离心，500μl MES继续清洗，再加入抗人IgG抗体，使抗体：微球质量比＝1：50，25℃混匀2h。
C.封闭：加入50μl封闭液，25℃混匀封闭0.5h。
D.封闭结束后离心，加入500μl清洗液清洗三次，最后一次加入稀释液复溶至20μg/mL待用。
使用本发明试纸条对MP-IgG定量检测的方法：以MP-IgG标准品作为样品，取6个不同的浓度，分别为0、1.5、5、15、50、150U/mL，每个浓度做2个平行样，进行检测。
准备：打开仪器电源开关，预热；试纸条、微球溶液、样品稀释液、样品等室温平衡；
检测：取50μl已稀释的样品(按照1：500稀释)滴加在所述的试纸条的样品垫中，孵育15min；向样品垫加入已稀释的微球溶液，孵育5min；荧光扫描所述T线和C线。若所述C线区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效。
数值分析与整理：检测结果(见表1)以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，建立双对数方程并拟合标准曲线(图2)。
表1 MP-IgG标准品的检测结果
偏差的计算方法为：T/C的标准差除以均值。图1为MP-IgG免疫层析试纸条剖面图(a.样品垫b.T线c.C线d.吸水纸e.NC膜f.底板)。图2为本发明测定人血液MP-IgG的荧光免疫层析试剂的标准曲线。
测得采用本发明试剂盒检测特异性达到94％，本发明对MP-IgG最低检测限为0.4U/ml。
本发明将抗原与荧光微球偶联，并采用先滴加样品孵育，然后再滴加偶联了抗原的微球溶液的两步法，意外的发现该方法能够显著降低背景噪声，显著提升了MP-IgG检测灵敏度、特异性结合率和测量范围，解决了MP-IgG检测假阳性的技术难题。此外，本发明研究发现，检测试剂的选择及浓度、抗体与微球的比例均显著影响检测荧光信号值，对MP-IgG检测灵敏度造成影响。
对照例1：
采用传统一步法检测：
采用一步法同样检测实施例1中6个标准品，向试纸条样品垫中央加入50μl样品和微球溶液，孵育20min，检测结果见表2。可见一步法检测限显著低于本发明，且特异性结合率低。
表2 MP-IgG试纸条一步法检测结果
浓度 C线荧光 T线荧光 T/C 偏差
0 45179 10273 0.227 12.5％
1.5 37108 12291 0.331 21.6％
5 29075 13839 0.476 10.7％
15 30640 15329 0.500 15.2％
50 30840 19734 0.640 19.5％
150 31250 27734 0.887 8.3％
对照例1与实施例1方法检测MP-IgM高值样本的扫描曲线结果显示，采用对照例1方法容易产生高背景，微球在NC膜(尤其是样品垫与T线之间)上存在非特异性滞留，且特异性荧光信号和T/C显著低于实施例1，表明实施例1方法显著优于对照例1。实施例1检测方法显著降低了检测本底，提高了特异性结合和荧光信号，增加了检测范围和检测准确性。
对照例2：
将实施例1的样品稀释液替换为不含蛋白质、不含表面活性剂的缓冲液，其余制备方法均与实施例1相同。
检测结果如下：
浓度 C线荧光 T线荧光 T/C 偏差
0 964610 17089 0.018 16.2％
1.5 901315 41290 0.046 11.9％
5 830294 79215 0.095 8.4％
15 712436 155721 0.219 2.7％
50 636930 353875 0.556 10.2％
150 593913 561219 0.945 6.3％
说明采用不含蛋白质和表面活性剂的样品稀释液，造成了本底高、特异性结合率低，不利于反应的充分进行。
对照例3：
将实施例1中抗体：微球质量比改为1：8，其余制备方法均与实施例1相同。
检测结果如下：
以上实验结果表明质量比过高，造成本底偏高，高浓度样本的检测线荧光值和T/C降低，因此不推荐此偶联方案。
对照例4：
将实施例1中抗体：微球质量比改为1：150，其余制备方法均与实施例相同。
检测结果如下：
浓度 C线荧光 T线荧光 T/C 偏差
0 685932 1076 0.002 11.3％
1.5 602417 17305 0.029 8.2％
5 552312 43672 0.079 5.9％
15 403877 100263 0.248 10.4％
50 395265 257626 0.612 7.1％
150 303480 308857 1.008 9.2％
以上实验结果表明质量比过低，会造成检测线荧光值和T/C明显降低，显著低于实施例1结果，因此不推荐此偶联方案。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种荧光免疫层析试纸条在制备肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒中的应用，其特征在于：采用肺炎支原体抗体IgG的免疫检测试剂盒，所述免疫检测试剂盒包括荧光免疫层析试纸条、微球溶液、样品稀释液；
所述荧光免疫层析试纸条，包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板，所述层析膜上设置检测线和质控线，所述检测线上涂有MP抗原；
所述微球溶液中，其微球为偶联有抗人IgG抗体的微球，微球的浓度为5～50μg/mL；抗人IgG抗体与微球偶联反应时的质量比为1：10～100；
所述样品稀释液含有0.1～1.0％BSA和0.1～2.0％S9；
所述微球，其为聚苯乙烯材质；所述微球，其直径为100～500nm；
所述检测线，其MP抗原的含量为5～150ng/mm2；
将样品滴加在样品垫中孵育15min；向样品垫加入微球溶液，孵育5min；进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述微球，其荧光物质包括异硫氰酸荧光素或镧系元素；所述层析膜包括硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述免疫检测试剂盒，其制备方法包括制备微球溶液，所述制备微球溶液的制备方法为：
活化微球：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入微球进行活化；
偶联：加入2-(N-吗啉)乙磺酸溶液清洗后，再加入抗人IgG抗体，按抗体与微球的质量比为1：10～100进行偶联；
封闭：加入封闭液进行封闭；
洗涤：去除未反应物，获得偶联微球；
稀释：将偶联得到的微球稀释至10～50μg/mL。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，其pH为4.5；所述活化，其活化液含有碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；所述封闭液，含有10％牛血清白蛋白；所述洗涤，其洗涤液为含有Tween-20的Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述样品，其在滴加到样品垫之前先进行稀释，稀释倍数为50～1000倍。
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