CN112684177A

CN112684177A - 一种乳品多因子快速检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN112684177A
Application number: CN202011491701.1A
Authority: CN
Inventors: 邢维维; 张桂亮; 刘薇; 聂靖东; 杨柳; 覃丹凤; 金兴; 富新文; 王晨霞
Original assignee: Beijing Wdwk Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Wdwk Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2040-12-17
Also published as: CN112684177B

Abstract

本发明涉及一种乳制品多因子检测试剂盒，包括：多因子反应板孔，多因子的单克隆抗体稀释液，酶标二抗稀释液；其特征在于，多因子的单克隆抗体稀释液是由多因子的单克隆抗体用稀释剂A稀释得到，所述稀释剂A为含有S9表面活性剂、聚乙二醇、酪蛋白中的至少一种的PBS缓冲溶液。本发明还提供了利用乳制品多因子检测试剂盒进行检测的方法，样本分析时可同时检测13种抗生素残留，且检测药物可根据需求不同、政策改变而进行药物更替。通过对单克隆抗体稀释液中稀释剂的选择，使各因子的结合率基本较低水平，检测乳品中多因子时，各因子的存在不会彼此干扰造成假阳性或者假阴性的检测结果。本发明方法快速，准确，可靠，高灵敏度，低成本。

Description

一种乳品多因子快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于食品安全快速检测领域，具体涉及一种乳制品多因子快速检测试剂盒及其用途。

背景技术

乳业是关系国计民生的重要产业，近年来我国乳业发展迅速，生鲜乳综合生产能力进一步提升，但牛奶的质量安全一直受抗生素、霉菌毒素、非法添加物等多种危害因子的威胁。这些乳品安全危害因子，不仅严重危害人体健康，并且由此带来的食品安全问题给消费者造成很大的心理恐慌，成为社会不安定因素，还给社会造成了巨大的经济损失，不但会重创我国奶业，还大大影响我国在国际上的形象和地位。

目前国内外现有的牛奶中危害因子的检测方法中，主要为仪器分析方法，如高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法，但仪器方法价格昂贵、操作繁琐、对操作人员的要求高、耗时长，因此仪器分析方法不适于现场快速大批量检测。

基于抗原抗体反应的免疫检测方法前处理简单、检测时间短、适合大批量样本的筛查，目前以酶联吸附免疫分析法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)为代表的产品已经广泛应用于乳品安全检测中。ELISA具备特异性高、基质干扰小的优点，但检测时间长、检测品种单一，检测效率较低，不适用与现场快速筛查；GICA虽然操作简单、反应时间短、适用于现场检测，但由于胶体金检测信号的局限性，限制了其方法学的灵敏度。

现有技术中有采用ELISA的检测乳品中有害物质的方法，CN102086228A公开了一种利用三聚氰胺单克隆抗体，能有有效快速检测乳品中的三聚氰胺。CN202033368U公开了一种检测乳品中黄曲霉素的方法；CN101408544A公开了一种3，5-二硝基水杨酸肼酶联免疫检测试剂盒；CN107192814A公开了一种用于检测乳品中氯霉素含量的方法，CN109307761A 公开了一种检测糠氨酸的间接竞争ELISA方法。以上现有技术都利用了免疫酶联的原理对乳品中的有害物质进行检测，但是现代食品的检测往往不是对单一因子进行，因为食品在生产，运输，销售，贮存过程中可能因为多种复杂的原因而含有多种危害因子，如果要一一进行检测，费时费力，而且成本高昂。因此亟需一种可以针对乳品多因子快速检测的试剂盒及其检测方法。但是由于多因子的检测，彼此之间可能产生互相之间干扰，产生假阳性或者假阴性的情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳制品多因子快速检测试剂盒，具有多指标同时检测，方便、快速、灵敏等特点，适用于乳制品中多种危害因子的同时快速检测。

本发明的一个目的为提供一种乳制品多因子检测试剂盒，包括：多因子反应板孔，多因子的单克隆抗体稀释液，酶标二抗稀释液；其特征在于，多因子的单克隆抗体稀释液是由多因子的单克隆抗体用稀释剂A稀释得到，所述稀释剂A为含有S9表面活性剂、聚乙二醇、酪蛋白中的至少一种的PBS缓冲溶液。

本发明提供的检测试剂盒是对乳品中多种危害因子进行同时检测，所述多因子包括但不限于β-内酰胺类，磺胺，四环素，链霉素，地塞米松，玉米赤霉醇，氟苯尼考，三聚氰胺，黄曲霉毒素M，卡那霉素，林可霉素，庆大霉素，红霉素、螺旋霉素、替米考星、喹诺酮类中的至少一种。

所述聚乙二醇的分子量为PEG600-PEG800。

所述稀释剂A中S9表面活性剂、聚乙二醇和酪蛋白的质量浓度独立地为0.01-0.5％；优选为0.05-0.2％；更优选地，S9表面活性剂和/或聚乙二醇的质量浓度为0.1-0.2％，和/ 或酪蛋白的质量浓度为0.05-0.1％。

各多因子的单克隆抗体稀释倍数为：β-内酰胺类抗生素单克隆抗体用稀释液稀释1200-1500倍，磺胺单克隆抗体用稀释液稀释70000-90000倍，四环素单克隆抗体用稀释液稀释56000-72000倍，链霉素单克隆抗体用稀释液稀释12000-18000倍，地塞米松单克隆抗体用稀释液稀释30000-50000倍，玉米赤霉烯醇单克隆抗体用稀释液稀释2000-3600 倍，氟苯尼考单克隆抗体用稀释液稀释3500-5000倍，三聚氰胺单克隆抗体用稀释液稀释 10000-15000倍，黄曲霉毒素M1单克隆抗体用稀释液稀释3000-5000倍，卡那霉素单克隆抗体用稀释液稀释150000-250000倍，林可霉素单克隆抗体用稀释液稀释85000-110000 倍，庆大霉素单克隆抗体用稀释液稀释80000-140000倍，红霉素单克隆抗体用稀释液稀释20000-30000倍。以上稀释倍数的选择目的是使各个药物阴性对照检测值控制在0.9-1.2 范围内。

在进行食品中对人体造成危害的多因子检测时，难以做到多因子同时检测的一大技术困难是各因子的结合率差异较大，即使采用不同的稀释倍数，仍难以避免某一种或者某几种因子结合率过高的情况，这样就容易导致在进行食品中多因子检测时的假阳性或者假阴性问题出现，而且当检测的因子种类越多，彼此性质差异越大时，这种现象越明显。特别是四环素类、地塞米松、玉米赤霉醇、氟苯尼考、黄曲霉毒素M1结合率过高，在样本检测过程中，增加假阳性的几率。

发明人预料不到地发现，采用上述含有S9表面活性剂、聚乙二醇和酪蛋白中至少一种的稀释剂去稀释各个因子单克隆抗体时，能够使各因子的结合率保持在较低水平，避免了假阳性或者假阴性结果的出现。

具体而言，稀释剂中含有S9表面活性剂可以降低地塞米松、氟苯尼考、黄曲霉毒素M1的结合率，同时对其他项目的结合率基本没有影响；聚乙二醇的加入可以使多因子中的四环素类、玉米赤霉醇结合率有所下降；S9表面活性剂和酪蛋白的共同作用可以使地塞米松、氟苯尼考的结合率下降。

所述稀释剂A的其他成分以及含量是本领域所熟知的，比如0.04-0.07M的EDTA，0.010-0.015M的PBS，0.05-0.5wt％的环糊精，0.2-0.4wt％的BSA，0.1-0.2wt％的吐温，0.01-0.05的防腐剂。所述吐温为20，所述防腐剂选自proclin300。

所述多因子反应板孔是各药物抗原包被的板孔，所述包被的过程是本领域所熟知的，在本发明中一个具体技术方案中，所述包被是用包被缓冲液将各药物抗原稀释成10.-15μg/mL，每孔加入包被原100-150μL，36-39℃温育2-4h，倾去包被液，用稀释的洗涤液洗涤，拍干，然后每孔加入150-300μL封闭液，36-39℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后获得包被有包被原的反应板孔，用铝膜真空密封保存。用于制备所述反应板孔的固相材料，包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔或其他本领域技术人员可以预见的形状。

本发明涉及到的抗原和包被原是本领域所熟知的，比如可以分别通过如下方法制备得到：

β-内酰胺类抗生素

1.半抗原的结构

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备:

1、将60.18mg氨苄西林半抗原和50mgBSA用20ml 10*pbs溶解，200rp搅拌10min。

2、将179ulEDE溶液加入到上述溶液中，反应过夜。

3、将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

2.2包被原制备:

1、将60.18mg氨苄西林半抗原和33.6mgOVA用20ml 10*pbs溶解，200rp搅拌10min。

2、将179ulEDE溶液加入到上述溶液中，反应过夜。

磺胺

1.半抗原的结构改造

将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子。称取氢氧化钠500mg，用6ml水在冰浴下溶解，搅拌，全部溶解，称取氨基苯甲酸600mg，加入其中，搅拌，分批加入乙酰苯胺磺酰氯700mg，点板监测反应，3h应完全。

反应完后将PH调至2左右，有粘稠物析出，用乙醇溶解，70％的乙醇重结晶，冷却析晶过夜，过滤，得到中间体580mg。

用8ml甲醇溶解580mg中间体，加入盐酸5ml，进行反应，点板监测反应，反应完全后，加入氢氧化钠溶液调节PH到7，萃取，旋干收集到的溶液得到产物430mg。

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

2.1.1将5.55mg磺胺半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入HCl0.98mg,NaNO2 4.5mg溶解，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.1.2称取BTG 20mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

2.1.3将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，,2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 1.5ml/管分装，-20℃保存备用。

2.2包被原制备

2.2.1将20.6mg磺胺半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入HCl3.65mg,NaNO2 16.8mg溶解，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.2.2称取OVA50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

2.2.3将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，,2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 1.5ml/管分装，-20℃保存备用。

四环素类(TC-4AS-EDC-载体)

1.半抗原的结构改造

将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子。称取四环素500mg，用5ml乙醇溶解，冰浴搅拌，加入150微升醋酸，反应，加入30微升甲醛， 2h后加入140mg4-氨基丁酸。

通过TLC发现反应完全，处理，加入乙醇35ml，离心取上清旋蒸，加入乙酸乙酯洗两次，旋干，有固体析出，即为产物。

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备(KLH)

1、将10.23mg四环素半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC15.46mg， NHS9.28mg，室温搅拌(500rpm)3h。

2、称取KLH40mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm搅拌反应。

3、将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，,2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

2.2包被原制备(BSA)

2、称取BSA50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm搅拌反应。

链霉素

半抗原的结构

2免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

2.1.1将26.09mg链霉素原料用4ml纯水溶解，200rpm搅拌10min。

2.1.2称取KLH 20mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm搅拌反应,加入戊二醛89.5ul，反应24h。加入硼氢化钠2.04mg，反应3h。

2.2包被原制备

2.2.1将95.1mg链霉素原料用4ml纯水溶解，200rpm搅拌10min。用500ulDMF溶解17.39mgEDE，加入到上述溶液中。

2.2.2称取OVA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

2.2.3将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，,2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 1.5ml/管分装-20℃保存备用。

地塞米松

1.半抗原的结构改造

1.1半抗原结构一

合成路线与具体操作：

10ml三口瓶中，加入500mg地塞米松(1.27mmol)溶解于5ml吡啶中，加入CMO195mg，室温反应，TLC反应完全，旋蒸除去吡啶，残余物用2mlDMF溶解，缓慢滴加到50ml纯水中，析出白色固体，过滤干燥即得半抗原355.8mg。

1.2半抗原结构二

合成路线与具体操作：

10ml三口瓶中，加入500mg地塞米松(1.27mmol)溶解于5ml吡啶中，加入HS172mg，室温反应，TLC反应完全，旋蒸除去吡啶，残余物用2mlDMF溶解，缓慢滴加到50ml纯水中，析出白色固体，过滤干燥即得半抗原370.8mg。

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原的合成

2.1.1将8.33mg地塞米松半抗原一用1ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC6.86mg溶解后再加入NHS 4.1mg，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.2.2称取KLH 20mg溶于5ml 0.01MPBS溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm搅拌反应24h.

2.2.3将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 0.5ml/管分装，-20℃保存备用。

2.2包被原的合成

2.2.1将1.56mg地塞米松半抗原二用0.4ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC1.28mg溶解后再加入NHS 1mg，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.2.2称取BSA 15mg溶于1.5ml 0.01MPBS溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm搅拌反应24h.

玉米赤霉醇

1.半抗原的结构改造

取50mg’玉米赤霉烯醇，溶解于5ml必定溶液中，加入12mg活泼酸酐，80℃反应过夜，氮气吹干吡啶溶剂，残余物柱层析纯化，拌样硅胶500mg，柱层硅胶30g，洗脱机二氯甲烷：甲醇＝10:1，收集与玉米赤霉烯醇荧光相近的点即为产物，旋干溶剂得45mg残余物为产物。

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

1、将5mg玉米赤霉烯醇半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC9.03mg，NHS5.42mg溶解,室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2、称取BSA 17.51mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

3、将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。

2.2包被原制备

1、将5mg玉米赤霉烯醇半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC9.03mg，NHS5.42mg溶解，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2、称取OVA 11.78mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

氟苯尼考

1.半抗原的结构改造

将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子。称取氟苯尼考原药500mg，加入6ml吡啶，搅拌至全部溶解后留样，加入HS153mg，加热到60 度，点板监测反应。(展开剂：二氯甲醇＝8:1)，通过TLC发现反应没有变化时，处理，旋干吡啶，用甲醇溶解，加入硅胶进行拌样，旋干样品进行柱层析，(洗脱剂：二氯甲醇＝20:1)收集所需要的溶液，旋干，得产物450.2mg。

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

2、将17.08mg氟苯尼考半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC25.75mg，NHS15.46mg溶解,室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2、称取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm搅拌反应24h.

2.2包被原制备

1、将17.08mg氟苯尼考半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC25.75mg，NHS15.46mg溶解，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2、称取OVA 33.6mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

三聚氰胺

1.半抗原的结构改造

制备方法：

2-氯-4,6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；130mg 4-氨基苯甲酸钠溶于10ml0.1mol/L 碳酸氢钠溶液后，缓慢加入上述溶液，混匀，70℃搅拌反应24h；0.1mol/L盐酸调pH为6，过滤，固体少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。

2.免疫原与包被原的合成

2.1 40mg三聚氰胺半抗原溶于5ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴中加入三正丁胺38μl，搅拌反应10min，加入氯甲酸异丁酯22μl，室温反应1h；

2.2BSA100mg溶于10ml 0.1mol/L碳酸钠溶液，将活化三聚氰胺半抗原溶液逐滴加入，室温搅拌过夜，PBS(pH7.4)4℃透析72h，期间换透析液6次；

2.3将透析产物在无菌条件下通过0.2μm的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

黄曲霉毒素M1

1.半抗原的结构改造

将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子。称取原料5mg，用3ml吡啶溶解，搅拌，全部溶解后留样，称取羧甲基羟胺2.24mg，加入其中，搅拌，点板监测反应，反应完全，吹干吡啶的半抗原。

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

2.1.1将1.197mg黄曲霉素M1半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC1.71mg，NHS1.03mg溶解,室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.1.2称取KLH20mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

2.1.3将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 1.5ml/管分装，-20℃保存备用。

2.2包被原制备

2.2.1将1.64mg黄曲霉素M1半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC2.36mg，NHS1.42mg溶解，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.2.2称取BSA50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应24h.

2.2.3将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋(10cm)，2L0.01M PBS，4℃搅拌(100rpm) 透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min， 1.5ml/管分装，-20℃保存备用。

卡那霉素

1.半抗原的结构

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

1、将18.06mg卡那霉素半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC21.5mg 溶解后再加入NHS 13mg，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.2包被原制备

林可霉素

1.半抗原的结构

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

2.1.1将7.91mg林可霉素原料加入到烧瓶中，用0.1M碳酸氢钠溶液溶解，200rpm搅拌 10min，加入乙二胺1.5mg，高碘酸钠4mg，室温搅拌(500rpm)活化1h，加入硼氢化钠6.28mg，反应3h。

2.1.2称取KLH 20mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应，加入戊二醛197ul，反应过夜。加入硼氢化钠6.28mg，反应3h。

2.2包被原制备

2.2.1将29.47林可霉素原料加入到烧瓶中，用0.1M碳酸氢钠溶液溶解，200rpm搅拌 10min，加入乙二胺5.6mg，高碘酸钠13.5mg，室温搅拌(500rpm)活化1h，加入硼氢化钠15.26mg，反应3h。

2.2.2称取OVA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm 搅拌反应，加入戊二醛197ul，反应过夜。加入硼氢化钠15.26mg，反应3h。

庆大霉素

1.半抗原的结构

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

1、将20.13mg庆大霉素半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC25.75mg，NHS15.46mg溶解,室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.2包被原制备

1、将20.13mg庆大霉素半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC25.75mg，NHS15.46mg溶解，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

红霉素

1.半抗原的结构改造

将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，用锡箔纸将其包住，防止见光，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子。称取红霉素50mg，5ml吡啶溶解，搅拌，加入8mg羧甲基羟胺盐酸盐反应，加热到40度，TLC检测，产物在紫外下有蓝色荧光，反应完全后用氮气吹干吡啶，即得半抗原。

2.免疫原与包被原的合成

2.1免疫原制备

1、将36.2mg红霉素半抗原用2.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 25.75mg溶解后再加入NHS 15.5mg，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2.2包被原制备

1、将53.8mg红霉素半抗原用2.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 38.3mg溶解后再加入NHS 23.1mg，室温搅拌(500rpm)活化2-3h。

2、称取OVA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入(1ml/min)，500rpm搅拌反应24h.

所述酶标二抗稀释液是酶标二抗用稀释剂B稀释100-150倍的酶标记物工作液。所述稀释剂B为含有海藻糖和丙三醇的PBS缓冲液。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶，所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也可以通过过碘酸钠法或戊二醛法将辣根过氧化物酶与二抗偶联制得。在本发明的一个优选实施方案中，所述酶标二抗为羊抗鼠IgG。

发明人还发现，在对酶标二抗的稀释剂中含有一定量的海藻糖和丙三醇，可以有效改善酶标记物工作液的稳定性，使其在37℃保存30天也能保持稳定。

优选地，在稀释剂B中，海藻糖质量浓度为0.01-0.1％，丙三醇的质量浓度为1-10％。

更优选地，在稀释剂B中，海藻糖质量浓度为0.05-0.1％，丙三醇的质量浓度为1-5％。

稀释剂B中还包括2-5wt％的小牛血清，0.03-0.05wt％的防腐剂，0.007-0.01M的PBS。

为方便现场检测和大量样本筛查，本发明所述乳制品多因子检测试剂盒还可以进一步包括阴性对照液，显色剂、洗涤液、停止剂。

所述阴性对照液为含10％脱脂奶粉的0.010-0.015M的PBS缓冲液。

所述显色剂使用酶联免疫检测法中常用的显色剂即可，没有特别的限定。在本发明一个具体实施方式中，显色剂为显色剂A和显色剂B按照体积比1-2：1-2组成，显色剂A中含有过氧化氢或者过氧化脲，显色剂B中含有邻苯二胺或四甲基联苯胺。

所述洗涤液为含有2-5wt％吐温20和0.05-0.1wt％Proclin 300的0.01-0.015MpH 7.4 PBS缓冲液。使用时洗涤液用去离子水稀释10-20倍使用。

所述停止剂为0.05-0.1％硫酸、0.2-0.5％十二烷基硫酸钠的混合水溶液。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述乳制品多因子检测试剂盒检测乳品中危害因子的方法，包括如下步骤：

向包有各药物抗原的反应板孔中加入多因子的单克隆抗体稀释液、酶标二抗稀释液、阴性对照液或者样品液，反应，洗涤，拍干，加入显色剂反应，之后加入停止剂，读取酶标板的吸光度进行判断样品中是否含有多因子。

在本发明一个优选技术方案中，所述判断样品中是否含有多因子的判断标准是，设立一临界值(cut off)，样品吸光度大于临界值时，判定为阴性；样品吸光度小于或者等于临界值时，判定为阳性。

所述临界值是通过以下公式计算得到：

临界值＝阴性对照OD值×各项目结合率，其中项目结合率＝样品平均结合率+3倍标准差，样品平均结合率是取多份同一样品在相同条件下进行结合率的测试所取的平均值。每个样品的结合率＝样本吸光度值/阴性对照吸光度值×100％。样品的取样数量，能够满足一定的样本量，保证检测结果准确可信即可，一般20份以上的样品量可以满足要求。

进一步地，多因子的单克隆抗体稀释液、酶标二抗稀释液、阴性对照液或者样品液的加入量按照体积比为4-6：2-3：8-10，加入后在室温下反应5-10min。更进一步地，所述多因子的单克隆抗体稀释液、酶标二抗稀释液、阴性对照液或者样品液的加入是在带有深孔板的预混板上进行，具体是在预混板的每孔中按照一定体积比例加入单克隆抗体稀释液、酶标二抗稀释液、阴性对照液或者样品液，室温下预反应5-10min再转移至反应板孔。

加入上述液体后，所述反应是轻轻震荡反应板，0-5℃下避光反应5-10min，加入显色剂反应是按照体积比1-2：1-2加入显色剂A和显色剂B，避光反应5-10min。

所述单克隆抗体稀释液、酶标二抗稀释液、阴性对照液或者样品液，洗涤液，显色剂，停止剂的加入量是本领域所熟知的，比如对于一般常用的96孔而言，每孔中，多因子的单克隆抗体稀释液，酶标二抗稀释液，阴性对照液或者样品液的总加入量为80-100μL，稀释后的洗涤液加入量为200-300μL，显色剂A和B的加入量总计100-150μL，停止剂的加入量为50-70μL。

优选地，所述测试吸光度是测试450±50nm(OD₄₅₀)和630±50nm处的吸光度(OD₆₃₀)，以OD₄₅₀-OD₆₃₀的数值作为吸光度。扣除在吸光度在630nm处的背景，能够使检测结果更加准确。

本试剂盒可同时对乳品中β-内酰胺类抗生素、磺胺、四环素、链霉素、地塞米松、玉米赤霉醇、氟苯尼考、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1、卡那霉素、林可霉素、红霉素、庆大霉素13类/种药物进行检测，能够有效地解决ELISA反应时间相对较长以及胶体金灵敏度不高等问题，有益效果为：

(1)多靶标，样本分析时可同时检测13种抗生素残留，且检测药物可根据需求不同、政策改变而进行药物更替。通过对单克隆抗体稀释液中稀释剂的选择，使各因子的结合率基本保持一致，检测乳品中多因子时，各因子的存在不会彼此干扰造成假阳性或者假阴性的检测结果。

(2)高通量，一个乳制品多因子快速检测产品最多可同时检测7个样本，且可轮流上板进行检测，满足现场需求。

(3)高灵敏度，充分满足检测限需求。

(5)便捷性，操作简单，节省时间，人力。采用本发明方法检测多种乳品中危险的多因子时检测时间很短，比如对于13种以上的多因子，全部检测用时只需要30min以内，而一般方法检测单种药物所需时间就为60min以上。

(6)低成本，与传统ELISA产品相比可节省成本一半以上。

本发明中术语“项目”、“多因子”、“危害因子”、“药物”表达的含义是待测样品中待检测的物质，其表达的技术含义是相同一致的。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1配制多因子的单克隆抗体稀释液的稀释剂A

以常规稀释剂的配方1，即0.01M的PBS缓冲溶液，其中还含有0.05M EDTA，0.10％环糊精，0.20％BSA，0.10％吐温，0.05％防腐剂-300，对多因子各项目的结合率进行测试，结合率＝样本吸光度值/阴性对照吸光度值×100％。结果如下表1所示，为方便筛选，此处结合率均以5％的整数倍取整：

表1

表1数据表明，多因子中的四环素类、地塞米松、玉米赤霉醇、氟苯尼考、黄曲霉毒素M1结合率过高，在样本检测过程中，增加假阳性的几率。

在配方1的基础上添加不同浓度的S9表面活性剂，对多因子各项目的结合率进行测试，结果如下表2所示：

表2

数据表明，当加入不同比例的S9表面活性剂时，多因子中β-内酰胺类抗生素、磺胺类、链霉素、三聚氰胺、卡那霉素、林可霉素、庆大霉素、红霉素这8个项目的结合率并没有受到影响，玉米赤霉醇项目结合率没有下降趋势，四环素类项目结合率虽有下降但不明显，地塞米松、氟苯尼考、黄曲霉毒素M1结合率下降较好。

最终选择S9表面活性剂质量浓度为0.10％，形成配方2：即0.01M的PBS缓冲溶液，其中还含有0.05M EDTA，0.10％环糊精，0.20％BSA，0.10％吐温，0.05％防腐剂-300，0.10％S9表面活性剂。

在配方2基础上加入不同浓度聚乙二醇，各因子的结合率如下表3所示：

表3

数据表明，当加入不同比例的聚乙二醇时，多因子中β-内酰胺类抗生素、磺胺类、链霉素、三聚氰胺、卡那霉素、林可霉素、庆大霉素、红霉素、地塞米松、氟苯尼考、黄曲霉毒素M1这11个项目结合率并没有受到影响，但多因子中的四环素类、玉米赤霉醇结合率有所下降。

最终选择聚乙二醇的浓度为0.1％，形成配方3：即0.01M的PBS缓冲溶液，其中还含有0.05M EDTA，0.10％环糊精，0.20％BSA，0.10％吐温，0.05％防腐剂-300，0.10％S9 表面活性剂，0.10％聚乙二醇。

在配方3基础上加入不同浓度酪蛋白，各因子的结合率如下表4所示：

表4

数据表明，当加入不同比例的酪蛋白时，多因子中13个项目的结合率并没有很大程度的下降，但地塞米松、氟苯尼考在酪蛋白浓度在0.05％时，结合率最低。表明地塞米松、氟苯尼考在S9表面活性剂、酪蛋白的同时作用下，使得结合率达到最低的效果。

因此最终优选的配方4为0.01M的PBS缓冲溶液，其中还含有0.05M EDTA，0.10％环糊精，0.20％BSA，0.10％吐温，0.05％防腐剂-300，0.10％S9表面活性剂，0.10％聚乙二醇，0.05％酪蛋白。

实施例2配制酶标二抗稀释液的稀释剂B

申请人发现，酶标二抗稀释液的稳定性对检测的准确度同样具有一定影响，以常规的稀释剂，即配方5：0.01M PBS缓冲溶液，还含有0.05wt％的防腐剂300，5％小牛血清。通过阴性对照液进行稳定性测试，测试方法是直接测试稀释剂B保存在37℃的条件下，在不同时间取出对阴性对照检测OD₄₅₀的值，结果如下表5所示：

表5

数据表明，多因子中13个项目阴性对照值在保存3天起出现不同程度下降，随着保存时间的延长，下降程度更大。

在配方5的基础上，加入不同浓度海藻糖，在0-15天，37℃条件下，对阴性对照液进行稳定性测试，结果如下表6所示：

表6

数据表明，当加入不同比例的海藻糖时，多因子中13个项目的阴性对照吸光度值在 37℃稳定性的测评下，下降程度有所缓解，随着海藻糖浓度的增加，稳定性越好，但浓度达到0.1％时出现稳定性变差的情况，所以选择0.05％为最佳浓度。在添加浓度0.05％海藻糖后，反应液B的稳定性在37℃保存12天时出现下降的现象，所以单纯加入海藻糖不能完全解决反应液B的长久稳定性问题，需再加入其它成分以延长有效期。

申请人在配方的0.01M PBS缓冲溶液，含有0.05wt％的防腐剂300，5％小牛血清，0.05％海藻糖的基础上，加入不同质量浓度的丙三醇，结果如下表7所示：

表7

数据表明，当加入不同比例的丙三醇时，多因子中13个项目的阴性对照吸光度值在 37℃稳定性的测评下，下降程度有所缓解，随着丙三醇增加，稳定性越好，但添加量达到10％时出现稳定性变差的情况，而在添加浓度50ml丙三醇后，反应液B的稳定性在37℃ 保存30天时未出现下降的现象，所以选择丙三醇添加量为5wt％。

最终酶标二抗稀释液的稀释剂B配方为0.01M PBS缓冲溶液，还含有0.05wt％的防腐剂300，5％小牛血清，0.05％海藻糖，5％丙三醇。

实施例3、乳品多因子快速检测试剂盒

一、试剂盒组成如下：

(1)反应板孔13块：β-内酰胺类抗生素反应板孔(8孔×12条)，黄曲霉毒素M1反应板孔(8孔×12条)，氟苯尼考反应板孔(8孔×12条)，地塞米松反应板孔(8孔×12条)，磺胺反应板孔(8孔×12条)，庆大霉素反应板孔(8孔×12条)，三聚氰胺反应板孔(8 孔×12条)，玉米赤霉醇反应板孔(8孔×12条)，四环素反应板孔(8孔×12条)，红霉素反应板孔(8孔×12条)，链霉素反应板孔(8孔×12条)，卡那霉素反应板孔(8孔×12 条)，林可霉素反应板孔(8孔×12条)；

反应板孔的制备如下：

用包被缓冲液将各药物抗原稀释成10.0μg/mL，每孔加入包被原100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后每孔加入150μL 封闭液，37℃温育1h，倾去孔内液体，干燥后获得包被有包被原的反应板孔，用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：0.03mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液；

封闭液：含有50g/L蔗糖、2.5g/L酪蛋白、0.5％小牛血清、3‰叠氮钠的0.2mol/LpH7.7 磷酸盐缓冲溶液。

(2)预混板孔：(96孔2mL深孔板)；

(3)阴性对照：1瓶(12mL)含10％脱脂奶粉的0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液；

(4)多因子单克隆抗体工作液：1瓶(50mL)：将β-内酰胺类抗生素单克隆抗体用稀释液稀释1200倍，磺胺单克隆抗体用稀释液稀释70000倍，四环素单克隆抗体用稀释液稀释56000倍，链霉素单克隆抗体用稀释液稀释12000倍，地塞米松单克隆抗体用稀释液稀释30000倍，玉米赤霉烯醇单克隆抗体用稀释液稀释2000倍，氟苯尼考单克隆抗体用稀释液稀释3500倍，三聚氰胺单克隆抗体用稀释液稀释10000倍，黄曲霉毒素M1单克隆抗体用稀释液稀释3000倍，卡那霉素单克隆抗体用稀释液稀释150000倍，林可霉素单克隆抗体用稀释液稀释85000倍，庆大霉素单克隆抗体用稀释液稀释80000倍，红霉素单克隆抗体用稀释液稀释20000倍，制成单克隆抗体混合工作液，即反应液A。

稀释剂为0.01M的PBS缓冲溶液，其中还含有0.05M EDTA，0.10％环糊精，0.20％BSA， 0.10％吐温，0.05％防腐剂-300，0.10％S9表面活性剂，0.10％聚乙二醇，0.05％酪蛋白。

(5)酶标二抗稀释液：羊抗鼠IgG用稀释剂B稀释100倍，1瓶(25mL)；

稀释剂B为0.01M PBS缓冲溶液，还含有0.05wt％的防腐剂300，5％小牛血清，0.05％海藻糖，5％丙三醇

(6)浓缩清洗剂：1瓶(20×，100mL/瓶)：含有2％吐温20和0.05％Proclin 300的0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液。

(7)显色剂A、显色剂B各1瓶(70mL/瓶)；所述显色剂A为0.1％过氧化脲、0.5％乙酸钠、0.5‰光稳定剂、0.2‰聚乙烯醇的混合水溶液。所述显色剂B为为0.2％N,N二甲基甲酰胺、0.3％甲酸、0.5％四甲基联苯胺(TMB)、0.5‰光稳定剂、0.1％环糊精的混合水溶液。

(8)停止剂：1瓶(70mL/瓶)：为0.05％硫酸、0.2％十二烷基硫酸钠的混合水溶液。

二、试剂盒操作步骤

(1)提前将各项目反应板孔安放在板架上，做好标记，并记录下各阴性对照和样品的位置。

(2)取出预混板孔，把阴性对照和样本对应的位置做好标记和记录，先每孔加入400 μL反应液A，然后加入200μL反应液B，最后加入900μL阴性对照和样品，用8道移液器轻轻吹打20次，室温(23℃-27℃)预反应8min。

(3)用8道移液器每次取90μL预混液分别加入到相应的反应板孔中，轻轻震荡酶标板10s，0℃避光反应8min。

(4)倒掉板孔中液体，每孔加入260μL洗涤工作液(浓缩清洗剂用去离子水稀释 20倍)，充分洗涤3-4次，每次浸泡15～30s。

(5)倒掉板孔中液体，将反应板倒置于吸水纸上，拍干。

(6)立即在每孔中加入100μL显色剂A、B混合液(显色剂A、显色剂B按体积 1:1混合)，盖好盖板膜，避光反应5min。

(7)揭开盖板膜，在各板孔中加入50μL停止剂，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀。

(8)终止后5min内用酶标仪在双波长450nm、630nm读取酶标板吸光度值。以 OD₆₃₀-OD₄₅₀为吸光度。

(9)结果判定

判定标准：当样本OD值大于cut off值，判为阴性；当样本OD值小于或等于cut off值，判为阳性。

cut off值＝阴性对照OD值×各项目结合率

项目结合率＝20份样品平均结合率+3倍标准差

结合率＝空白样本吸光度值/阴性对照吸光度值×100％

三、试剂盒的性能评价

三.(1)、各检测因子结合率测定

将空白原奶样品(LC-MS/MS检测阴性)分别加入不同浓度的对照品，至所需浓度(目标药物的最低检测限)。对空白添加样品进行测定，按照本实施例的步骤二：“试剂盒操作步骤”进行检测，取20份添加样本吸光度值/阴性对照吸光度值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，得到项目结合率。结果见表8。表8中各因子的添加浓度是按照国家标准残留限量或仪器方法检测限进行，比如对于地塞米松，按照GB/T 22978-2008牛奶和奶粉中地塞米松残留量按照液相色谱-串联质谱法测定的检测限进行。高于检测限浓度就是阳性，低于检测限浓度就是阴性。

表8

为避免假阴性结果，项目结合率根据计算出的数值上调处理，本试剂盒项目结合率分别为：β-内酰胺类抗生素35％，磺胺25％，四环素30％，链霉素15％，地塞米松20％，玉米赤霉醇25％，氟苯尼考25％，三聚氰胺30％，黄曲霉毒素M1 30％，卡那霉素25％，林可霉素30％，庆大霉素25％，红霉素20％。

三.(2)、试剂盒的特异性和假阳性测试

特异性是指方法在实验条件下达到的实际最低检出水平时，检出阴性结果的阴性样品数占总阴性样品数的百分比。

用本试剂盒检测50份阴性原奶样本，按照本实施例的步骤二：“试剂盒操作步骤”进行检测，对出现阳性结果的样本重复检测一次，并经仪器方法复检，统计阴性数，按照下列公式计算特异性：特异性＝阴性数/50×100％。假阳性率是指方法在实验条件下达到的实际最低检出水平时，阴性样品中检出阳性结果的最大概率(以百分比计)，计算结果为方法最大假阳性率的结果。

统计假阳性数，按照下列公式计算假阳性率：假阳性率＝假阳性数/50×100％。

检测结果见表9，结果显示所有样本均为阴性结果。根据公式进行计算，本试剂盒特异性为100％，假阳性率为0。

表9

结果显示所有样本均为阴性结果。根据公式进行计算，本试剂盒特异性为100％，本试剂盒假阳性率为0。

三.(3)试剂盒灵敏度和假阴性测试

灵敏度是指方法在实验条件下达到的实际最低检出水平时，检出阳性结果的阳性样品数占总阳性样品数的百分比。假阴性率是指方法在实验条件下达到的实际最低检出水平时，阳性样品中检出阴性结果的最大概率(以百分比计)，计算结果为方法最大假阴性率的结果。

用本试剂盒检测50份阳性添加原奶样品，各因子的添加浓度见表8，按照本实施例的步骤二：“试剂盒操作步骤”进行检测，对可疑阴性样本重复检测一次，并经仪器方法复检，统计阳性数，灵敏度＝阳性数/50×100％。统计假阴性数，按照下列公式计算假阴性率：假阴性率＝假阴性数/50×100％。

表10

检测结果见表10，结果显示所有样本检测均为阳性结果，根据公式进行计算，结果显示所有样本检测均为阳性结果，本试剂盒灵敏度为100％，本试剂盒假阴性率为0。

实施例4与仪器方法一致性

用本试剂盒和仪器法分别对50份原奶盲样进行测定，比较测定结果。仪器方法根据国家标准或行业标准规定的方法操作，结果见表11。

表11

与仪器方法比较，本试剂盒检测方法符合率较好，说明本试剂盒方法有效可靠，可以用于实际样本的检测。

Claims

1.一种乳制品多因子检测试剂盒，包括：多因子反应板孔，多因子的单克隆抗体稀释液，酶标二抗稀释液；其特征在于，多因子的单克隆抗体稀释液是由多因子的单克隆抗体用稀释剂A稀释得到，所述稀释剂A为含有S9表面活性剂、聚乙二醇、酪蛋白中的至少一种的PBS缓冲溶液。

2.如权利要求1所述的乳制品多因子检测试剂盒，其特征在于，所述多因子包括β-内酰胺类，磺胺，四环素，链霉素，地塞米松，玉米赤霉醇，氟苯尼考，三聚氰胺，黄曲霉毒素M，卡那霉素，林可霉素，庆大霉素，红霉素、螺旋霉素、替米考星、喹诺酮类中的至少一种。

3.如权利要求1所述的乳制品多因子检测试剂盒，其特征在于，所述稀释剂A中S9表面活性剂、聚乙二醇和酪蛋白的质量浓度独立地为0.01-0.5％；优选为0.05-0.2％；更优选地，S9表面活性剂和/或聚乙二醇的质量浓度为0.1-0.2％，酪蛋白的质量浓度为0.05-0.1％。

4.如权利要求3所述的乳制品多因子检测试剂盒，其特征在于，所述稀释剂A还包括0.04-0.07M的EDTA，0.010-0.015M的PBS，0.05-0.5wt％的环糊精，0.2-0.4wt％的BSA，0.1-0.2wt％的吐温，0.01-0.05的防腐剂；优选地，所述吐温为20，所述防腐剂选自proclin300。

5.如权利要求1所述的乳制品多因子检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗稀释液是酶标二抗用稀释剂B稀释100-150倍的酶标记物工作液；所述稀释剂B为含有海藻糖和丙三醇的PBS缓冲液。

6.如权利要求5所述的乳制品多因子检测试剂盒，其特征在于，在稀释剂B中，海藻糖质量浓度为0.01-0.1％，丙三醇的质量浓度为1-10％；优选地，在稀释剂B中，海藻糖质量浓度为0.05-0.1％，丙三醇的质量浓度为1-5％。

7.一种使用权利要求1-6任一项所述的乳制品多因子检测试剂盒检测乳品中危害因子的方法，包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述判断样品中是否含有多因子的判断标准是，设立一临界值(cut off)，样品吸光度大于临界值时，判定为阴性；样品吸光度小于或者等于临界值时，判定为阳性；

所述临界值是通过以下公式计算得到：

临界值＝阴性对照OD值×各项目结合率，其中项目结合率＝样品平均结合率+3倍标准差，样品平均结合率是取多份同一样品在相同条件下进行结合率的测试所取的平均值，每个样品的结合率＝样本吸光度值/阴性对照吸光度值×100％。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多因子的单克隆抗体稀释液、酶标二抗稀释液、阴性对照液或者样品液的加入量按照体积比为4-6：2-3：8-10，加入后在室温下反应5-10min；所述反应是轻轻震荡反应板，0-5℃下避光反应5-10min，加入显色剂反应是按照体积比1-2：1-2加入显色剂A和显色剂B，避光反应5-10min。

10.如权利要求7所述的方法，所述测试吸光度是450±50nm(OD₄₅₀)处的吸光度；优选地，所述吸光度是450±50nm(OD₄₅₀)处的吸光度减去630±50nm处的吸光度(OD₆₃₀)。