CN117783524A - 一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇a10型病毒抗原的建立与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的建立与应用，属于病原检测技术领域。本发明提供了一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒（CA10）抗原的试剂，采用第一动物抗CA10多克隆抗体作为包被相，以第二动物抗CA10多克隆抗体作为检测二抗，以HRP标记的驴抗兔IgG抗体作为酶结合物催化TMB显色，从而检测CA10抗原。本发明还构建了包含所述试剂的试剂盒，以及检测CA10抗原的方法，具有较好的特异性，较高的灵敏度，精密度‑重复性和中间精密度较好，准确性较高。
Description
技术领域
本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的建立与应用。
背景技术
手足口病（Hand-foot-mouth disease，HFMD）是由多种人类肠道病毒引起的常见传染病，引起HFMD的病原体主要为CV-A16、4、5、7、9、10, 和B 3、5、埃可病毒以及EV-A71，其中柯萨奇A组10型（coxsackievirus A10，CV-A10）已经成为除肠道病毒71 型（enterovirus71，EV-A71）、CV-A16和CV-A6以外引起发病的主要病原体之一。
在HFMD爆发期间，存在多种肠道病毒混合感染，混合感染有可能加重疾病和/或延长病程。因此，对混合感染监测有助于HFMD预防和治疗，但已经上市的EV-A71疫苗对CV-A10病毒无交叉保护作用， 所以加强对CV-A10感染的防控工作，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。目前市场上对于CV-A10感染没有特异性的治疗药物，也没有CV-A10疫苗可以预防，所以对于CV-A10的感染，疫苗仍然是防控的最有效手段，对于疫苗的研发已有报道。而相关疫苗的研究开发和病毒抗原的快速检测试剂盒是预防控制此传染病的关键。
在实际检验中，当HFMD已经被确定为某种肠道病毒感染后，想要确定是否还存在CV-A10的感染，通常还需要用CV-A10的特异引物进行RT-PCR，然后巢式PCR，通过琼脂糖电泳鉴定是否有CV-A10感染。这就需要两次RT-PCR，增加了成本，尤其进行大规模分子流行病调查，其花费的成本相当巨大，因此，探索简便快速的CV-A10检测方法非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的建立与应用，具有较好的特异性和灵敏度，精密度-重复性和中间精密度较好。
本发明提供了一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的试剂，包括以第一动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体作为包被相，以第二动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体作为检测二抗，以HRP标记的驴抗兔IgG抗体作为酶结合物。
优选的，所述包被相和检测二抗的工作浓度均为1~10µg/ml；
所述酶结合物的工作浓度为1：5000~1:10000。
优选的，所述第一动物和第二动物的种类不同，来源包括鼠和兔。
本发明还提供了一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的试剂盒，包括上述试剂，还包括显色试剂、包被液、样品稀释液、封闭液、工作液稀释液、洗液和终止液。
优选的，所述显色试剂包括TMB；
优选的，所述包被液的成分包括：0.014mol/L Na2CO3、0.035mol/L NaHCO3和1mol/L尿素；
优选的，所述样品稀释液包括0.01mol/L的PBS缓冲液；
优选的，所述封闭液和工作液稀释液均包括3%BSA溶液；
优选的，所述洗液包括含0.05% Tween20的PBS缓冲液；
优选的，所述终止液包括2M H2SO4溶液。
本发明还提供了一种非诊疗目的的定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的方法，包括以下步骤：（1）利用上述试剂盒中的工作液稀释液将第一动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体稀释至工作浓度，加入酶标板吸附后封闭，得包被酶标板；
（2）将样品稀释后加入步骤（1）所述包被酶标板，第一孵育后第一洗涤；
（3）在所述第一洗涤后，加入检测二抗，第二孵育后第二洗涤；
（4）在所述第二洗涤后，加入酶结合物，第三孵育后第三洗涤；
（5）在所述第三洗涤后，加入显色试剂，显色后终止反应，测定OD值，根据OD值确定柯萨奇A10型病毒抗原的含量。
优选的，所述第一孵育、第二孵育、第三孵育和显色的温度均为37℃；
所述第一孵育的时间为2h，第二孵育的时间为1h，第三孵育的时间为0.5h；
所述显色的时间为10min。
优选的，所述测定OD值时，以450nm为检测波长，630nm为参考波长，读取每孔的OD值；
将每孔450nm的OD减去空白孔450nm的OD 得到每孔450nm时的OD(Blank450)，同样地，将每孔630nm的OD减去空白孔630nm的OD 得到每孔630nm时的OD(Blank630)，以（Blank450- Blank630）所得的OD值作为每个样品孔的最终OD值。
优选的，当阳性对照平均OD/阴性对照平均OD≥2.1，线性R2≥0.97时试验成立；
以2.1倍平均阴性对照作为Cutoff，OD≥Cutoff则为阳性，反之则为阴性。
优选的，所述阳性对照为柯萨奇A10型病毒，阴性对照为PBS。
有益效果：本发明提供了一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的试剂，采用第一动物抗柯萨奇A10型病毒（CA10）多克隆抗体作为包被相，以第二动物抗CA10多克隆抗体作为检测二抗，以HRP标记的驴抗兔IgG抗体作为酶结合物催化TMB显色，从而检测CA10抗原，具体原理见图2。由于本发明采用不同种属动物来源的针对CA10的多克隆抗体作为包被抗体（包被相）和检测抗体，因此当CA10病毒与包被抗体结合后，鉴于不同种属动物在识别同一病毒的抗原表位上有一定差异，使得不会影响CA10病毒与另一种属来源的抗体结合，保证了该检测方法具有较高的灵敏性。如果包被抗体和检测抗体同为一种动物来源的，那么它们与CA10病毒结合的抗原表位是相同的，当CA10病毒与包被抗体结合后，与检测抗体结合的抗原表位就会减少，这就会导致检测灵敏度的降低。
本发明还构建了包含所述试剂的试剂盒，检测系统具有较好的特异性，其对CA16、CA6、EV71、甲型肝炎病毒和脊髓灰质炎等肠道病毒无交叉反应；在80~5EU/ml的范围内，该系统具有良好的线性（R2≥0.97）；同时，该系统具有较高的灵敏度，检测下限达到5~10EU/ml；精密度-重复性和中间精密度较好，变异系数（CV%）都小于15%；准确性较高，准确性在80%~120%范围内，平均准确性达101%；在37℃条件下放置24h后，其线性保持不变（R2≥0.97），平均准确性为103%，精密度-重复性CV%为8.7%。
附图说明
图1为本发明试剂盒的检测线性和线性范围结果图；
图2为本发明检测原理图；
图3为本发明具体实施例原理图。
具体实施方式
本发明提供了一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的试剂，包括以第一动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体作为包被相，以第二动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体作为检测二抗，以HRP标记的驴抗兔IgG抗体作为酶结合物。
本发明所述第一动物和第二动物的种类不同，来源优选包括鼠、兔或其他，如第一动物为鼠时，第二动物可为兔也可为其他。本发明实施例中以第一动物为鼠，第二动物为兔为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明对所述多克隆抗体的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规手段免疫对应动物即可，实施例中采用经甲醛灭活的CA10病毒分别免疫Balb/c小鼠和日本大耳兔，免疫剂量为1000EU/只，一免后一个月加强免疫一次，剂量与一免相同。二免后一个月采血分离血清，利用Protein A/G凝胶柱按照说明书分别对两种血清中的抗CA10 IgG进行纯化。本发明所述CA10病毒来源于昆明市儿童院一例手足口病患者，病毒经分离、噬斑克隆纯化、在Vero细胞上传代而得到。
本发明以鼠抗CA10多克隆抗体做包被相，以兔抗CA10多克隆抗体作为检测二抗，且所述鼠抗CA10多克隆抗体和兔抗CA10多克隆抗体的工作浓度优选为1~10µg/ml，更优选为1~5µg/ml，最优选均为1μg/ml。
本发明以HRP标记的驴抗兔IgG抗体作为酶结合物，所述HRP标记的驴抗兔IgG抗体的工作浓度优选为1:5000~1：10000:，更优选为1:5000~1:8000，最优选为1：5000。本发明所述酶结合物优选购自abcam公司。
本发明利用所述试剂检测CV10抗原的原理如图2所示，本发明采用鼠抗CA10病毒多克隆抗体作为包被抗体（包被相），该包被抗体与样品中的CA10病毒结合，通过洗板，CA10病毒被结合到包被抗体上，其他无关物质被去除，然后加入兔抗CA10多克隆抗体与结合到包被抗体上的CA10病毒结合，再加入HRP标记的驴抗兔IgG抗体，进而催化TMB显色，通过酶标仪测定OD值，从而对CA10病毒抗原进行检测和定量，具体原理见图3。
本发明还提供了一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的试剂盒，包括上述试剂，还包括显色试剂、包被液、样品稀释液、封闭液、工作液稀释液、洗液和终止液。
本发明所述显色试剂优选包括TMB；所述包被液的成分包括：0.014mol/L Na2CO3、0.035mol/L NaHCO3和1mol/L尿素；所述样品稀释液包括0.01mol/L的PBS缓冲液；所述封闭液和工作液稀释液均包括3%BSA溶液；所述洗液包括含0.05% Tween20的PBS缓冲液；所述终止液包括2M H2SO4溶液。
本发明还提供了一种非诊疗目的的定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的方法，包括以下步骤：（1）利用上述试剂盒中的工作液稀释液将第一动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体稀释至工作浓度，加入酶标板吸附后封闭，得包被酶标板；
（2）将样品稀释后加入步骤（1）所述包被酶标板，第一孵育后第一洗涤；
（3）在所述第一洗涤后，加入检测二抗，第二孵育后第二洗涤；
（4）在所述第二洗涤后，加入酶结合物，第三孵育后第三洗涤；
（5）在所述第三洗涤后，加入显色试剂，显色后终止反应，测定OD值，根据OD值确定柯萨奇A10型病毒抗原的含量。
本发明优选用包被液将鼠抗CA10多克隆抗稀释到工作浓度（1µg/ml），然后加入酶标板，0.1ml/孔，放置于2~8℃吸附过夜（8~12h），次日每孔加入200µl的封闭液并置于2~8℃封闭过夜，封闭完成后用洗液洗涤一次，晾干备用。
本发明优选将样品利用样品稀释液稀释到合适的稀释度后，选取至少5个连续适宜稀释度加入酶标板中，每孔100µl，同时设2孔阳性对照（适宜浓度的CA10病毒），2孔阴性对照（PBS）和1孔空白对照。将酶标板置37℃孵育2h，用洗液洗涤4次，每孔加入100µl的兔抗CA10多克隆抗体（1µg/ml），空白孔除外，并将检测板置37℃孵育1h。用洗液洗板4次，每孔加入100µl的驴抗兔HRP，空白孔除外，再将检测板置37℃孵育0.5h。洗板4次，每孔中加入100µl的显色试剂（TMB），置37℃避光显色10min，每孔中加入50µl的终止液。
本发明利用酶标仪检测OD值，优选以450nm为检测波长，630nm为参考波长，读取每孔的吸光度值（OD值）。将每孔450nm的OD减去空白孔450nm的OD 得到每孔450nm时的OD(Blank450)，同样地，将每孔630nm的OD减去空白孔630nm的OD 得到每孔630nm时的OD(Blank630)，以（Blank450- Blank630）所得的OD值作为每个样品孔的最终OD值。
试验成立标准：阳性对照平均OD/阴性对照平均OD应≥2.1；线性R2应≥0.97。以2.1倍平均阴性对照作为Cutoff，OD≥Cutoff则为阳性，反之则为阴性。如果进行定量检测，则需将标准品按照样品的稀释方法进行梯度稀释和上样，后续操作一致，计算时，标准品和样品分别选择5个连续稀释度采用双平行线法计算样品的浓度。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的建立与应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、试剂、器材和设备说明
CA10病毒免疫相应动物制备得到鼠抗CA10多克隆抗体和兔抗CA10多克隆抗体，酶结合物购自abcam公司，包被液（0.014mol/L Na2CO3+0.035mol/L NaHCO3+1 mol/L 尿素），样品稀释液为0.01mol/L PBS，封闭液、二抗稀释液和酶稀释液为3% BSA，洗液为0.05%TWEEN20 PBS溶液，终止液为2mol/L硫酸，96孔康宁可拆卸酶标板，洗板机，酶标仪，37℃培养箱。
2、检测系统条件的建立
设置多个鼠抗CA10多克隆抗体，兔抗CA10多克隆抗体和酶使用浓度，对这些浓度进行组合，比较这些条件下该系统的线性，以线性R2≥0.97作为该检测系统的工作条件。在该条件试验中，鼠抗使用浓度分别设置了0.5 µg/ml、1.0 µg/ml和10 µg/ml；兔抗使用浓度分别设置为1.0 µg/ml、2.0 µg/ml、4.0µg/ml、5.0µg/ml、10µg/ml和15µg/ml；酶使用浓度设置为1：5000和1：10000，设置不同的组合，评价在这些条件下线性情况，选择线性较好的条件作为该检测方法的工作条件，结果见下表1和表2。
3、酶标板包被
在前期条件试验的基础上，用包被液将鼠抗CA10多克隆抗稀释到1µg/ml，然后加入酶标板，0.1ml/孔，放置于2~8℃吸附过夜，次日每孔加入200µl的3% BSA并置于2~8℃封闭过夜，封闭完成后用PBS洗涤一次，晾干备用。
4、操作步骤
定量检测： 将样品或标准品做10倍预稀释后再做2倍系列梯度稀释至1：1280（1：20-1：1280），将酶标板取出恢复至室温，分别将不同稀释度的标准品和样品（1：20-1：1280）加入酶标板中，每孔100µl，同时设2孔阳性对照（适宜浓度的CA10病毒，1：4），2孔阴性对照（PBS）和1孔空白对照。将酶标板置37℃孵育2h，用洗液洗涤4次，每孔加入100µl的兔抗CA10多克隆抗体（1µg/ml），空白孔除外，并将检测板置37℃孵育1h。用洗液洗板4次，每孔加入100µl的驴抗兔HRP，空白孔除外，再将检测板置37℃孵育0.5h。洗板4次，每孔中加入100µl的TMB，置37℃避光显色10min，每孔中加入50µl的终止液。以450nm为检测波长，630nm为参考波长，读取每孔的吸光度值（OD值）。将每孔450nm的OD减去空白孔450nm的OD 得到每孔450nm时的OD(Blank450)，同样地，将每孔630nm的OD减去空白孔630nm的OD 得到每孔630nm时的OD(Blank630)，以（Blank450- Blank630）所得的OD值作为每个样品孔的最终OD值。试验成立标准：阳性对照平均OD/阴性对照平均OD应≥2.1；线性R2应≥0.97。以2.1倍平均阴性对照作为Cutoff，OD≥Cutoff则为阳性，反之则为阴性。结果计算时，标准品和样品分别选择5个连续稀释度（1：20-1：320）采用双平行线法计算样品的浓度。
定性检测：将样品做4倍稀释，将该稀释过的样品加入酶标板，每孔100µl，重复3孔，同时设2孔阳性对照（适宜浓度的CA10病毒，1：4），2孔阴性对照（PBS）和1孔空白对照，无需标准品。后续操作与定量检测操作一致。结果判定时，以样品OD≥Cutoff为阳性，反之则为阴性。
5、检测系统评价
在确定了检测系统的使用条件和操作步骤后，需对该系统进行全面的评价，包括：特异性、线性、灵敏度、线性范围、精密度-重复性、中间精密度、准确度和耐用性等项目的评价。
5.1特异性评价
将CA16、CA6、EV71、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等肠道病毒属病毒收获液加入酶标板，每孔100µl并重复3孔。后续操作按4进行。根据Cutoff判定每个检测孔的阴阳性。
结果如表3所示，该系统具有较好的特异性，针对CA6、CA16、EV71、甲型肝炎病毒和脊髓灰质炎等肠道病毒无交叉反应，经3次重复检测，检测结果都为阴性，但能很好的识别CA10病毒，3次重复检测都为阳性，并且其OD/阴性对照OD都远远大于2.1。
5.2线性、线性范围和灵敏度评价
取浓度为1600EU/ml的CA10病毒液进行稀释，取1：20~1：1280共7个稀释度加入酶标板，每孔100µl，后续操作按4进行，重复3次。以阳性最高稀释度对应的CA10抗原浓度为该检测系统的灵敏度；以R2在0.97以上且5个以上连续稀释度作为该系统线性范围和线性。
结果如图1所示，经3次重复检测显示，该检测系统的线性范围为80~5EU/ml，在该范围内具有较好的线性，R2都在0.97以上，同时具有较高的灵敏度，达到5~10EU/ml。
5.3精密度-重复性评价
分别取一支未知浓度的CA10病毒液和一支浓度为1600EU/ml的病毒液，梯度稀释后，以浓度为1600EU/ml的病毒液作为标准品，用该检测试剂测定该未知病毒液的抗原含量，重复测定5次。计算5次测定结果的变异系数（CV%），CV%应小于或等于15%。
结果如表4所示，该系统具有较好的精密度，5次测定结果的变异系数为9.7%。
5.4中间精密度评价
分别取一支未知浓度的CA10病毒液和一支浓度为1600EU/ml的病毒液，梯度稀释后，以浓度为1600EU/ml的病毒液作为标准品，用该检测试剂测定该未知病毒液的抗原含量。以上操作每天重复测定2次，共计重复测定6次。计算6次测定结果的变异系数（CV%），CV%应小于或等于15%。
结果如表5所示，该系统具有较好的中间精密度，6次结果总的变异系数（CV%）都小于15%，为9.7%。
5.5准确度评价
取一支1600EU/ml的病毒液，稀释至浓度为800EU/ml，以浓度为1600EU/ml的病毒液作为标准品，测定该病毒液的抗原含量，并计算回收率（实际测定值/理论值800×100%），以上操作重复5次。每次检测的回收率都应在80~120%范围内。
结果如表6所示，用该系统对同一个已知浓度的样品进行5次重复测定，每次测定结果的回收率（%）都在80%~120%的范围内，平均回收率为101%。
5.6耐用性评价
将该检测板放置于37 ℃ 24h后备用，取一定量的浓度为1600EU/ml的病毒液并稀释至1200EU/ml，以浓度为1600EU/ml的病毒液作为标准品，测定该病毒液的抗原含量，重复以上操作5次。计算每次测定结果的回收率，以及计算5次重复测定结果的变异系数（CV%）。每次测定结果的回收率都应在80~120%范围内，5次重复测定结果的CV%应小于或等于15%。
结果如表7所示，该检测系统在37℃放置24h后，其线性、准确性和精密度均不受较大影响，线性R2均在0.97以上，总的回收率和变异系数（CV%）分别为103%和8.7%。
在使用条件（鼠抗CA10多克隆抗体包被浓度为1µg/ml，兔抗CA10多克隆检测二抗为1µg/ml，驴抗兔HRP IgG为1：5000）下，该检测系统具有良好的特异性、线性、灵敏度、精密度、准确度和耐用性，能准确、稳定的对CA10病毒抗原进行定量。
对比例1
本发明还与现有专利技术(2022115866374)进行了对比，将同一样品预先稀释到1：4，然后梯度稀释至1：512，然后选择1：4至1：512分别用本发明和现有专利进行检测，比较两种检测试剂的线性和灵敏性，灵敏性以阳性最高稀释度表示。重复三次。结果显示，本发明的灵敏度较高，两种检测试剂的线性R2都在0.98以上，结果见表8。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的试剂，其特征在于，包括以第一动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体作为包被相，以第二动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体作为检测二抗，以HRP标记的驴抗兔IgG抗体作为酶结合物。
2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述包被相和检测二抗的工作浓度均为1~10µg/ml；
所述酶结合物的工作浓度为1：5000~1:10000。
3.根据权利要求1或2所述试剂，其特征在于，所述第一动物和第二动物的种类不同，来源包括鼠和兔。
4.一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述试剂，还包括显色试剂、包被液、样品稀释液、封闭液、工作液稀释液、洗液和终止液。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述显色试剂包括TMB；
所述包被液的成分包括：0.014mol/L Na2CO3、0.035mol/L NaHCO3和1mol/L尿素；
所述样品稀释液包括0.01mol/L的PBS缓冲液；
所述封闭液和工作液稀释液均包括3%BSA溶液；
所述洗液包括含0.05% Tween20的PBS缓冲液；
所述终止液包括2M H2SO4溶液。
6.一种非诊疗目的的定量检测柯萨奇A10型病毒抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用权利要求4或5所述试剂盒中的工作液稀释液将第一动物抗柯萨奇A10型病毒多克隆抗体稀释至工作浓度，加入酶标板吸附后封闭，得包被酶标板；
（2）将样品稀释后加入步骤（1）所述包被酶标板，第一孵育后第一洗涤；
（3）在所述第一洗涤后，加入检测二抗，第二孵育后第二洗涤；
（4）在所述第二洗涤后，加入酶结合物，第三孵育后第三洗涤；
（5）在所述第三洗涤后，加入显色试剂，显色后终止反应，测定OD值，根据OD值确定柯萨奇A10型病毒抗原的含量。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述第一孵育、第二孵育、第三孵育和显色的温度均为37℃；
所述第一孵育的时间为2h，第二孵育的时间为1h，第三孵育的时间为0.5h；
所述显色的时间为10min。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述测定OD值时，以450nm为检测波长，630nm为参考波长，读取每孔的OD值；
将每孔450nm的OD减去空白孔450nm的OD 得到每孔450nm时的ODBlank450，同样地，将每孔630nm的OD减去空白孔630nm的OD 得到每孔630nm时的ODBlank630，以ODBlank450减去ODBlank630所得的OD值作为每个样品孔的最终OD值。
9.根据权利要求6或8所述方法，其特征在于，当阳性对照平均OD/阴性对照平均OD≥2.1，线性R2≥0.97时试验成立；
以2.1倍平均阴性对照作为Cutoff，OD≥Cutoff则为阳性，反之则为阴性。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述阳性对照为柯萨奇A10型病毒，阴性对照为PBS。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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