CN103884839A - 一种用于定量检测fmdv有效抗原的反向液相阻断elisa方法 - Google Patents

一种用于定量检测fmdv有效抗原的反向液相阻断elisa方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法。本发明通过将标准阳性血清的稀释方法固定，即固定血清抗体的量，将待检抗原作系列稀释与之作用，同时设置已知有效抗原含量的标准对照抗原，基于阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，成功建立了一种对口蹄疫病毒有效抗原定量的新技术，命名为反向液相阻断ELISA。该方法继承了液相阻断ELISA方法用于测定血清抗体时可分型、操作简单、重复性好、高敏感性、高特异性、可批量检测等优点，同时实现了对FMDV的有效抗原量的定量测定，为解决现今国内外急需解决的疫苗效力检验动物替代问题提供了技术手段。

Description

一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测FMDV有效抗原的新方法，特别涉及一种可用于分型、测定血清FMD抗体的液相阻断ELISA检测方法、一种可定量FMDV中146S抗原含量的蔗糖梯度离心方法以及标定血清抗体某一抗体效价下50%阻断有效抗原量的方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
口蹄疫（Foot and Mouth Disease,FMD）是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。目前已知口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:O、A、亚洲1、C型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对O、A和亚洲1型进行疫苗免疫。
疫苗接种与扑杀相结合是发展中国家预防、控制乃至逐步消灭口蹄疫最为常用的手段。随着新技术的发展，出现了以表位疫苗、类病毒样颗粒、合成肽为代表的新型疫苗，但是传统的口蹄疫灭活疫苗仍然在我国口蹄疫控制中发挥着主要作用。现阶段疫苗生产中口蹄疫病毒的繁殖已经开始由传统的转瓶BHK21细胞单层培养法向BHK21细胞悬浮培养方法过渡，BHK21细胞悬浮培养方法由于其在病毒培养中的巨大优势引起了疫苗生产厂家的重视。口蹄疫病毒主要采用二乙烯亚胺（BEI）灭活，病毒灭活彻底，并且灭活前后抗原含量变化小，免疫佐剂以油佐剂为主。
FMD疫苗的效力试验主要采用本动物进行免疫攻毒试验，即PD50测定法:用疫苗50%动物保护剂量(PD50)来评价疫苗免疫效果，常规疫苗需至少达到3PD50，紧急接种疫苗需至少达到6PD50。目前，发达国家已经采用本动物替代方法检测FMD疫苗的效力，该检测方法也是我国FMD疫苗生产急需解决的关键技术之一。FMD疫苗效力检验替代方法主要有疫苗抗原定量方法和血清学测定口蹄疫抗体替代法。
FMD疫苗抗原定量主要有免疫扩散法、间接夹心ELISA146S抗原定量法、蔗糖密度梯度离心法。口蹄疫病毒抗原定量的方法目前常用的是蔗糖密度梯心纯化146S方法和间接夹心ELIA方法测定146S含量方法。蔗糖密度梯度离心纯化测定完整病毒粒子（146S）含量是最常用的的方法。根据沉降系数不同，可以分为完整病毒粒子（146S）、空衣壳(76S)、病毒感染相关肽(45S)、小分子蛋白（12S）。146S抗原是口蹄疫疫苗中使动物肌体产生保护性抗体的主要免疫成分，因此146S抗原颗粒也被认为与口蹄疫疫苗的效力具有平行关系。1971年，Fayet等首次建立了用紫外光定量蔗糖梯度中口蹄疫病毒粒子146S抗原颗粒的方法；1974年，Barreling等在此基础上做了改进，使此方法更加精确敏感。Doel等进一步发展和标准化了这个方法，并于1982年向OIE正式推荐了这个方法。1990年，Junsuke等用蔗糖密度梯度离心法对口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原颗粒纯化后，用软件CDS系统对146S抗原颗粒实现了电脑自动化定量。有研究者还开展了146S抗原颗粒含量与疫苗的本动物效力(PD50)相关性的研究。试验证明，在一定的范围内，146S抗原颗粒的含量与疫苗效力有相关性。
由于蔗糖密度梯度离心测定146S抗原不能区分血清型，而ELISA方法在技术操作要求、FMDV定型、批量检测等方面具有优势，研究者一直探索用ELISA方法解决抗原定量问题。Van Maanen等1990年用针对VP1的单克隆抗体双抗夹心ELISA法定量FMD疫苗的146S含量；Crowther等1995年利用诊断VP1的单克隆抗体建立能区分146S和12S的双抗夹心法。单克隆抗体作为捕获抗体不能完全辨别抗原的所有功能区域，不能完全反映抗原的免疫原性和本动物接种疫苗后一系列复杂的免疫反应；基于多克隆抗体建立的双抗夹心ELISA，由于同型FMD毒株间存在许多亚型，要想定量准确，必须使捕获抗体和检测抗体与要检测的抗原以及标准对照抗原同源，在未知被检测的毒株来源的情况下，该方法也很不理想。
口蹄疫血清学效力检测替代方法是通过检测疫苗免疫后的抗体滴度水平来评价疫苗免疫效力，主要包括病毒中和试验和液相阻断ELISA试验。1968年，Stellman等提出了用中和抗体滴度分析疫苗效力的统计学方法;到1976年，Pay等根据中和抗体滴度和疫苗效力的关系建立了疫苗的抗原剂量、中和抗体滴度和保护率的相关公式。马军武等通过液相阻断ELISA检测疫苗免疫抗体与攻毒保护分析确定了猪、牛、羊等口蹄疫免疫抗体与攻毒保护的关系。疫苗免疫血清抗体效价检测须用非口蹄疫疫苗免疫动物，无法从根本上取代本动物的使用，阴性动物的选择也存在困难。
口蹄疫灭活疫苗本动物效力检验替代方法的探索是国内外面临和亟待解决的一个问题，有效的替代方法应该具有很好的特异性、敏感性和重复性，而且要易于标准化。疫苗免疫效果主要是由疫苗中的有效抗原含量决定的，所以建立能科学准确测定疫苗中的有效抗原含量的方法是解决口蹄疫疫苗效力检验替代问题的关键。所谓有效抗原应为具有一定的免疫原性并且免疫产生的血清抗体具有一定的抗感染或攻毒保护的抗原。因此，有效抗原应包括完整病毒粒子（146S）、空衣壳(76S)和部分抗原肽。
本发明综合分析了液相阻断ELISA测定抗体、间接ELISA测定抗原量和病毒中和试验等方法。液相阻断ELISA方法测定抗体是在满足检测血清敏感性和特异性的条件下固定抗原的量，将待检血清系列稀释，从而测定血清抗体效价；经典的病毒中和试验提到可以固定抗原的量测定血清抗体的量，反之也可以通过固定血清的量测定抗原的滴度。我们从中得到启发，把标准阳性血清的稀释方法固定，将待检抗原作系列稀释与之作用，基于阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，本发明成功建立了一种对口蹄疫病毒有效抗原定量的新技术，本发明将这种ELISA方法命名为反向液相阻断ELISA。
作为FMDV抗原定量的反向液相阻断ELISA方法，它继承了液相阻断ELISA方法用于测定血清抗体时可分型、操作简单、重复性好、高敏感性、高特异性、可批量检测等方便的所有优点，实现了像测定血清抗体一样测定FMDV的有效抗原量。利用该项技术本发明已经初步建立起O、亚1和A型FMDV有效抗原定量的反向液相阻断ELISA方法。口蹄疫病毒抗原含量测定反向液相阻断ELISA方法的建立和应用可以解决现今国内外急需解决的疫苗效力检验动物替代问题。
反向液相阻断ELISA方法定量FMDV有效抗原量，在进一步试验的基础上可以解决一下几个问题：通过与蔗糖密度梯度离心方法平行比较，可以确定完整病毒粒子（146S）含量与利用液相阻断ELISA测定的有效抗原含量的关系；通过测定疫苗中有效抗原量与试验动物攻毒保护的关系，可以确定疫苗有效抗原含量与50%动物保护剂量（PD50）的关系；通过测定疫苗中有效抗原量与免疫动物抗体水平的关系（合格率、保护率），可以根据免疫有效抗原含量掌握动物疫苗免疫后群体抗体水平。同时通过口蹄疫病毒生产流程中，对每一个环节抗原量的监测有利于持续改进提高优化生产工艺；可以实现按有效抗原量进行单价苗（或多组份苗）、双价及多价疫苗的配制；可以对疫苗储藏、流通、免疫接种前各个阶段进行有效抗原量监测，确保疫苗的质量和动物免疫的有效性；动物疫苗免疫可以实现按有效抗原量指导免疫。
因此反向液相阻断ELISA测定口蹄疫病毒有效抗原量的方法必将在测定疫苗抗原含量、疫苗效力检验替代、疫苗免疫群体抗体水平评估、疫苗质量控制、免疫指导等方面得到广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够定量口蹄疫病毒有效抗原的新方法-—反向液相阻断ELISA方法，其基本原理是标准阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的。如果把标准阳性血清的稀释方法固定，加入不同比例稀释的待检抗原（标准抗原以已知的最佳稀释度稀释）与之作用，每个稀释度的抗原均设置不加血清的四孔抗原对照；同样稀释的阳性标准血清在其相同的抗体滴度下阻断50%时的被检抗原和标准对照抗原的有效抗原量是相同的。由于标准阳性血清抗体滴度的计算值是在一定范围内变化的，计算出的抗体滴度与对应抗原的有效抗原含量存在着反比例关系，被检抗原的有效抗原含量等于被检抗原对应的阳性标准血清的抗体滴度除以标准对照抗原对应的阳性标准血清的抗体滴度乘以（标准对照抗原的有效抗原含量/对应的稀释倍数）乘以待检抗原对应的稀释倍数。血清的具体抗体滴度按改进的reed-Meunch法计算。本发明将这种ELISA检测技术命名为反向液相阻断ELISA方法。与液相阻断ELISA测定血清抗体的区别在于：液相阻断ELISA方法测定抗体时是将满足标准阳性血清抗体测定敏感性和特异性要求的有效抗原通过稀释固定，去检测被检血清中的抗体滴度；反向液相阻断ELISA是将已知抗体效价的阳性标准血清的稀释方法固定，加入按不同稀释度稀释的被检抗原，对变量、固定量及已知量与被检测量的设置刚好是相反的。
本发明在国内外率先突破了对液相阻断ELISA方法的利用，克服了蔗糖密度梯度离心、间接夹心ELISA等方法定量146S抗原的不足。由于该方法操作简单、可分型、经济有效，能快速、便捷、准确地测定出FMDV的有效抗原含量，是抗原定量和疫苗效力检验替代的最理想方法，必将会被广泛应用。
为了达到该目的，本发明所采取的技术方案步骤如下：
1、FMDV阳性标准血清抗体效价的测定（液相阻断ELIS方法）；
2、FMDV146S抗原的纯化（蔗糖密度梯度离心法）；
3、标准阳性血清阻断50%FMDV有效抗原量的测定（146S）或以一般FMDV抗原作为标准对照抗原其有效抗原量的标定；
经蔗糖密度离心纯化的146S抗原标定过的普通FMDV抗原，其有效抗原量既已确定就可以作为该方法的标准对照抗原。
5、血清抗体滴度的计算方法；
6、被检抗原有效抗原量的计算方法（改进的reed-Meunch法）；
此外还可包括：
7、取值范围的计算；
8、敏感性（准确检测最低极限）和特异性分析。
具体的，本发明为一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法，其特征在于通过将标准阳性血清的稀释方法固定以达到固定血清的量的目的，并将待检抗原作系列稀释与之作用，同时设置已知有效抗原含量的标准对照抗原，参考阳性标准血清在某一抗体效价下阻断50%标准对照抗原的有效抗原量的测定结果，基于标准阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，通过以下公式计算得到：
Figure BDA00002615752900051
其中，血清的具体抗体滴度按以下公式计算得到：
Figure BDA00002615752900052
血清抗体滴度D=1/2n+s
其中，n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数，例如血清抗体效价处于1：512（即1：29）-1：1024（即1：210），n即为9。
临界值（OD50%）:即标准对照抗原平均OD492nm值的50%。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的标准对照抗原为已知有效抗原含量的抗原，可以是纯化的146S抗原，也可以是经146S标定过的已知有效抗原含量的普通抗原。
优选的，本发明所述的方法，具体的包括以下步骤：
（1）标准阳性血清抗体滴度测定；
（2）FMDV 146S抗原的纯化及含量测定；
（3）标准阳性血清阻断50%时146S有效抗原量的测定
（4）被检FMDV样品有效抗原的标定
a、包被ELISA板
用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液将兔抗FMDV血清稀释并包被ELISA板，室温过夜，PBST洗板5次；
b、按每孔50μl量在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按比例作2倍连续稀释，按每孔50μl量在血清稀释孔内加入按不同比例稀释的FMDV抗原以及作为标准对照抗原的146S抗原，不同浓度稀释的待检FMDV抗原和作为标准对照抗原的146S抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔，其中146S抗原量为阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断时146S抗原含量；
c、洗板和转移
将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板，将与兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST根据使用浓度进行稀释，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；
d、酶促反应
洗板5次，加入用PBST稀释的兔抗豚鼠辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板5次，加入底物溶液，50μl/孔，37℃孵育15分钟，再每孔加入50μl量的1.25%H2SO4终止反应，酶标仪492nm波长下读取吸光值；
（5）被检FMDV抗原有效抗原量计算：
其中，血清的具体抗体滴度按以下公式计算得到：
Figure BDA00002615752900062
血清抗体滴度D=1/2n+s
n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数。
临界值（OD50%）:即标准对照抗原平均OD492nm值的50%。
经蔗糖密度梯度离心纯化的146S抗原标定过的普通FMDV抗原，其有效抗原量既已确定就可以作为该方法的标准对照抗原。
在本发明所述的方法中，标准阳性血清阻断50%时146S有效抗原量的测定是按照以下步骤进行的：
a、包被ELISA板
用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液将兔抗FMDV血清稀释并包被ELISA板，室温过夜，PBST洗板5次；
b、抗原抗体反应
在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按比例作2倍连续稀释，一般使得血清抗体滴度处于4个稀释滴度的中间，按每孔50μl量在血清稀释孔内加入用PBST按不同比例稀释的146S抗原以及已知有效抗原含量的抗原作为对照抗原；不同浓度稀释的146S抗原和对照抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，对照抗原加入量为标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%对照抗原时的对照抗原的抗原含量，混匀后封板置4℃过夜；
c、洗板和转移
将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板，将与兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST稀释至工作浓度，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；
d、酶促反应
洗板5次，加入用PBST稀释的兔抗豚鼠辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板5次，加入底物溶液，50μl/孔，37℃孵育15分钟，再每孔加入50μl量的1.25%H2SO4终止反应，酶标仪492nm波长下读取吸光值；
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断146S的有效抗原量，作为本方法最根本的标准对照抗原。
在本发明以上任一项所述的方法，所述的FMDV抗原包括O型FMDV抗原，亚洲I型FMDV抗原以及A型FMDV抗原。
本发明利用阳性血清在同一的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的抗原抗体反应原理，通过在反应系统中把标准阳性血清的稀释方法固定，加入不同比例稀释的待检抗原（标准抗原以已知的稀释倍数稀释至最佳的有效抗原含量）与之作用，每个稀释度下的抗原均设置不加血清的四孔抗原对照；成功地建立起了反向液相阻断ELISA方法，可用于定量检测FMDV有效抗原。
本发明创造性的解决了阳性标准血清阻断50%有效抗原含量的测定问题，解决了一般FMDV抗原作为标准抗原有效抗原含量的标定难题。阳性标准血清同一抗体效价下阻断50%有效抗原量是一定的，把蔗糖密度梯度离心纯化的完整病毒粒子（146S）按不同的浓度（μg/ml）与之作用，满足检测敏感性和特异性要求的146S浓度就是阳性标准血清阻断50%的有效抗原量，此时的有效抗原则全部为146S抗原；把标准阳性血清按固定方法稀释，加入不同比例稀释的普通FMDV抗原和确定最佳作用浓度的146S抗原（对照抗原），由反向液相阻断ELISA试验结果计算出普通FMDV抗原的有效抗原含量，这时的有效抗原量就包括146S、75S和部分抗原肽。因此，本发明成功的建立了有效抗原定量的反向液相阻断ELISA方法，为抗原定量、疫苗效力检验动物替代难题的解决提供了科学技术手段。
附图说明
图1为ELISA测定O型FMDV有效抗原含量与蔗糖纯化146S抗原含量的相关趋势图；
图2为ELISA测定亚洲1型FMDV有效抗原含量与蔗糖纯化146S抗原含量的相关趋势图；
图3为ELISA测定A型FMDV有效抗原含量与蔗糖纯化146S抗原含量的相关趋势图；
图4为试验布局图。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
实施例1利用反向液相阻断ELISA测定O型FMDV有效抗原量方法的建立和应用
1材料和方法
1.1抗原、抗体制备
1.1.1FMDV抗原：以生产于单层BHK21细胞繁殖的FMD/O/MYA98口蹄疫病毒经二乙烯亚胺灭活后离心除去细胞碎片的上清液作为试验抗原，用pH值7.4PBST稀释以满足试验敏感性和特异性要求的浓度作为最佳工作浓度（1:6）。
1.1.2捕获抗体（兔抗血清）：以纯化的O/MYA98/FMDV146S抗原免疫兔子制备，用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液以预先滴定的使用浓度（1∶1000）稀释包被ELISA板。
1.1.3检测抗体（豚鼠抗血清）：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠并用正常牛血清预阻断制备，用含10%正常牛血清和5%兔血清的PBST稀释至预先滴定的使用浓度(1∶1000)。
1.1.4兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，sigma公司购买，用PBST稀释至最佳使用浓度(1:500)。
1.1.5标准阳性血清：用与兔抗血清同源的FMDV灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，用液相阻断ELISA方法测定其抗体滴度1:720(1:512~1:1024)。
1.2方法
2.1O型标准阳性血清抗体滴度的测定
用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（兰州兽医研究所提供）测定其抗体滴度，按操作说明书进行，同时记录标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%抗原时的抗原的工作浓度，作为对照抗原，用于测定标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%146S抗原的有效抗原量。
2.2146S抗原纯化及测定
110ml灭活O/MYA98/FMDV经45000rmp，4℃超速离心3小时，弃去上清，沉淀用pH值7.6NET缓冲液悬浮匀浆至2ml，蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）离心35000rmp，8℃离心2.5小时。按0.5ml/管取样，在紫外分光光度计260nm波长，0.5光程下测定吸光值，合并146S病毒粒子再次测定吸光值后并计算146S含量。
2.3标准阳性血清阻断50%146S抗原量的测定
用pH值9.600.05M碳酸盐缓冲液将O型兔抗FMDV血清按1∶1000稀释并包被ELISA板，50μl/孔，室温过夜，PBST洗板5次。在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按1∶128~1:1024比例作2倍连续稀释（ELISA板：A-D排，1-12列，血清的固定稀释方法与该标准阳性血清的抗体效价有关，一般使得血清抗体滴度处于4个稀释滴度的中间。本发明中使用的标准阳性血清的抗体效价为1:720，此时的固定稀释方法为1∶128~1:1024。），146S抗原(50μg/ml )用PBST按照如下浓度稀释(μg/ml)：1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1μg/ml，加入到稀释好血清的载体板上，血清稀释孔每加50μl，此时阳性标准血清的抗体滴度变为1:256~1:2048的2倍连续稀释；每个浓度均作2个重复，每个浓度均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔；对照抗原按预先滴定的使用浓度稀释（对照抗原为标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%对照抗原时的对照抗原的浓度），混匀后封板置4℃过夜。将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板，将与兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用豚鼠抗血清稀释液（含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST）按1∶1000稀释，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板5次，加入用PBST稀释至最佳使用浓度的兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板5次，加入底物溶液（20mmol/L邻苯二胺,0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H2O2），50μl/孔，37℃孵育15分钟,再每孔加入50μl量的1.25%H2SO4终止反应。酶标仪492nm波长下读取吸光值（OD值）。
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度(0.4μg/ml)作为阳性标准血清在某一抗体滴度下50%阻断的146S抗原量。纯化的146S抗原为本方法有效抗原计算的最根本的标准对照抗原。
2.4普通FMDV抗原有效抗原量的标定
方法步骤同上，按每孔50μl量在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按适当的比例作2倍连续稀释（ELISA板：A-D排，1-12列），按每孔50μl量在血清稀释孔内加入按不同比例稀释的FMDV抗原和作为标准对照抗原的已滴定最佳工作浓度的146S抗原（阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断的146S抗原量），不同浓度的FMDV抗原以及标准对照抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔，试验布局如图4所示，其中1-10列为被检样品抗原，11-12列为已滴定最佳工作浓度的标准对照抗原，即146S抗原。计算标准阳性血清50%阻断的普通FMDV抗原的有效抗原含量，经146S抗原标定过的普通FMDV抗原，其有效抗原量既已确定就可以作为该方法的标准对照抗原。
2.5被检抗原有效抗原量计算：
Figure BDA00002615752900111
血清抗体滴度计算（改进的reed-munech法）
Figure BDA00002615752900112
血清抗体滴度D=1/2n+s；
n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数；
临界值（OD50%）:即标准对照抗原平均OD492nm值的50%。
2.6与蔗糖密度梯度离心方法纯化146S抗原比较
口蹄疫病毒灭活抗原30份，其中O/MYA98纯化146S抗原2份、O/MYA98毒株8份、OZK毒株5份、OHK毒株5份、ON毒株5份、亚洲1型毒株1份、A型毒株1份、O/A型混合（1∶1）抗原1份、O/亚洲1型混合（1∶1）抗原1份、O/A/Asial1型混合（1:1:1）抗原1份。用反向液相阻断ELISA方法测定上述30份样品的有效抗原量，同时用蔗糖密度梯度离心纯化其中23份样品的146S含量。
2.7取值范围
将阳性标准血清50%阻断标准对照抗原的有效抗原量平行重复多次，计算每次的有效抗原量，以最大值减去最小值除以2作为系统的修正值，因此被检样品的有效抗原量的取值范围等于测定值±n修正值(n为抗原的稀释倍数)。
2.8检测的最低限度（敏感性）和特异性
敏感性：将FMD/O/MYA98灭活抗原作系列稀释，当根据抗体效价计算得到的抗原含量与实际稀释的抗原量能保持一致的最小抗原含量。
特异性：将A型、亚洲1型FMDV灭活抗原与O型FMDV灭活抗原一起作为被检抗原检测，O型标准阳性血清与O型FMDV抗原发生阳性反应，与A型、亚洲1型FMDV灭活抗原不发生反应。
3结果
3.1O型标准阳性血清抗体滴度
按照口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒要求操作，O型标准阳性血清抗体滴度为1:720(1:512~1:1024)。
3.2FMD/O/MYA98灭活抗原146S纯化结果
110ml新灭活FMD/O/MYA98抗原经蔗糖密度梯度离心，按0.5ml/管取样，在紫外分光光度计260nm波长，0.5光程下测定吸光值，合并146S病毒粒子再次测定吸光值（OD值=0.1383），合并146S抗原6ml，计算总含量212.08μg，即35.35μg/ml。
3.3标准阳性血清阻断50%146S抗原量的测定结果
对照抗原及不同浓度的146S抗原与阳性标准血清的抗体滴度对应关系如下表1所示：
表1
Figure BDA00002615752900121
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在某一抗体滴度下50%阻断146S抗原量，即0.4μg/ml。
3.4普通FMDV抗原有效抗原量的标定
将FMD/O/MYA98抗原按预先滴定的稀释倍数1:6稀释，146S抗原按0.4μg/ml稀释，在同一块ELISA板上各重复6孔，然后计算各自对应抗体滴度的平均值。FMD/O/MYA98灭活抗原对应抗体滴度的平均值为1:792，146S抗原对应抗体滴度的平均值为1:788。计算FMD/O/MYA98抗原的有效抗原量为2.40μg/ml。
一般将抗体滴度个位数字作四舍五入处理，被检抗原的有效抗原量=被检抗原的对应的抗体滴度（1：790）/对照抗原对应的抗体滴度（1：790）×对照抗原的有效抗原量（0.4μg/ml）/对应稀释倍数（1）×被检抗原的稀释倍数（6）=1：790/1：790×0.4×6=2.40μg/ml。
其有效抗原量既已确定就可以作为该方法的标准对照抗原。
3.5取值范围
将FMD/O/MYA98灭活抗原有效抗原含量为2.40μg/ml，以0.402μg/ml稀释做20个重复测定，测定最大值为0.45μg/ml，最小值为0.347μg/ml，（0.45-0.347）/2=0.052μg/ml，被检抗原的有效抗原含量应为测定值±0.05n(n为被检抗原的稀释度)，本实施例中被检抗原的有效抗原含量取值范围即为2.40±0.3μg/ml。
3.6检测的最低限度（敏感性）和特异性
敏感性：将O/MYA98FMDV抗原作系列稀释，阳性血清抗体滴度为1:2990时，对照抗原对应的抗体滴度为1:720，被检的有效抗原含量为0.096μg/ml，与实际稀释的抗原量（0.1μg/ml）接近。因此该方法检测最低限度（敏感性）为0.1μg/ml。
特异性：A型和亚洲1型FMDV抗原与O型FMDV灭活抗原一起作为被检抗原检测，O型标准阳性血清与O型FMDV抗原发生阳性反应，与A型和亚洲1型FMDV抗原均均呈阴性反应。因此该方法具有良好的特异性。
3.7反向液相阻断ELISA测定与蔗糖密度梯度离心纯化30份抗原样品结果比较
30份样品经反向液相阻断ELISA测定有效抗原含量和蔗糖密度梯度离心纯化146S抗原结果及相互关系见下表2，其中O/A等体积混合抗原、O/Asial1等体积混合抗原、O/A/Asial1等体积混合抗原的O型抗原和O/MYA98-8为同一份抗原。
表2
Figure BDA00002615752900131
从上表146S与ELISA测定的有效抗原的比值可以看出：反向液相阻断ELISA检测O型FMDV有效抗原含量与蔗糖梯度离心纯化146S抗原，返回相关性检验值为1，属于高度相关；从ELISA测定有效含量与蔗糖纯化146S含量的相关趋势图（图1所示）也可以看出两者的相关性趋势非常一致。23份普通O型FMDV灭活抗原146S抗原与有效抗原含量比值分析，常规新灭活FMDV抗原中完整病毒粒子（146S）占全部有效抗原含量的80%左右（平均值为76.9%），随着FMDV病毒的降解会随之降低。从上表可以看出在反向液相阻断ELSIA测定O型FMDV有效抗原含量体系中，O型口蹄疫病毒抗原多个亚型毒株的有效抗原量检测不受影响，对于双价抗原或三价抗原中O型FMDV抗原有效抗原量的检测不受影响，能真实反应O型FMDV有效抗原量在多价抗原中的含量。
4结论
4.1本研究建立的O型FMDV有效抗原含量定量反向液相阻断ELISA技术，检测有效抗原最低限度为0.1μg/ml，因此具有良好的敏感性；与O型口蹄疫病毒灭活抗原及O型146S抗原发生阳性反应，与A型、亚洲1型FMDV抗原反应呈阴性，因此具有很好的特异性。
4.2利用FMD/O/MYA98毒株作为抗原建立的反向液相阻断ELISA技术，能很好检测其它亚型如OZK、OHK、ON毒株的有效抗原含量，不受FMDV亚型差异的影响。
4.3利用反向液相阻断ELISA测定的O型FMDV有效抗原含量与蔗糖密度梯度离心纯化的146S抗原具有良好的相关性。可以通过有效抗原的检测计算出146S抗原含量，因此可以代替蔗糖密度梯度离心方法测定FMDV抗原中的146S含量。通过新灭活抗原纯化得到的146S抗原约占全部FMDV有效抗原含量的80%左右，也证明了146S抗原是FMDV抗原有效抗原的主要成分。
4.4本研究为测定O型FMDV有效抗原量提供了经济、科学有效的技术，为O型FMDV灭活疫苗效力检验动物替代提供了科学的方法。
实施例2利用反向液相阻断ELISA测定亚洲1型FMDV有效抗原量方法的建立和应用
1材料和方法
1.1抗原、抗体制备
1.1.1FMDV抗原：以生长于单层BHK21细胞繁殖的FMDV AsialⅠ/JSL口蹄疫病毒经二乙烯亚胺灭活后离心除去细胞碎片的上清液作为试验抗原，用pH值7.4PBST稀释以满足试验敏感性和特异性要求的浓度作为最佳工作浓度（1:3）。
1.1.2捕获抗体（兔抗血清）：以纯化的AsialⅠ/JSL FMDV146S抗原免疫兔子制备，用pH值9.6碳酸盐缓冲液以预先滴定的使用浓度（1∶1000）稀释包被ELISA板。
1.1.3检测抗体（豚鼠抗血清）：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠并用正常牛血清预阻断制备，用含10%正常牛血清和5%兔血清的PBST稀释至预先滴定的使用浓度(1:1000)。
1.1.4兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，sigma公司购买，用PBST稀释至最佳使用浓度(1∶1000)。
1.1.5标准阳性血清：用与兔抗血清同源的FMDV疫苗免疫牛制备的高免血清，用液相阻断ELISA方法测定其抗体滴度1:720(1:512~1:1024)。
1.2方法
2.1亚洲Ⅰ型标准阳性血清抗体滴度的测定
用口蹄疫亚洲Ⅰ型抗体液相阻断ELISA试剂盒（兰州兽医研究所提供）测定其抗体滴度，按操作说明书进行，同时记录标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%抗原时的抗原的工作浓度，作为对照抗原，用于测定标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%146S抗原的有效抗原量。
2.2146S抗原纯化及测定
110ml灭活AsialⅠ/JSL FMDV经45000rmp，4℃超速离心3小时，弃去上清，沉淀用pH值7.6NET缓冲液悬浮匀浆至2ml，蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）离心35000rmp，8℃离心2.5小时。按0.5ml/管取样，在紫外分光光度计260nm波长，0.5光程下测定吸光值，合并146S病毒粒子再次测定吸光值后并计算146S含量。
2.3标准阳性血清阻断50%146S抗原量的测定
用pH值9.6碳酸盐缓冲液将亚洲Ⅰ型兔抗FMDV血清按最佳使用浓度（1∶1000）稀释并包被ELISA板，50μl/孔，室温过夜，PBST洗板5次。在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按1:128~1:1024比例作2倍连续稀释（ELISA板：A-D排，1-12列），146S抗原(50μg/ml)用PBST按照如下浓度稀释(μg/ml)：1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1μg/ml，加入到稀释好血清的载体板上，血清稀释孔每加50μl，此时阳性血清的抗体滴度变为1:256~1:2048的2倍连续稀释；每个浓度均作2个重复，每个浓度均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔；对照抗原按预先滴定的使用浓度稀释（即标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%对照抗原时的使用浓度），混匀后封板置4℃过夜。将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板，将与兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用豚鼠抗血清稀释液（含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST）按预先滴定的使用浓度（1:1000）稀释，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板5次，加入用PBST稀释至最佳使用浓度的兔抗豚鼠辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板5次，加入底物溶液（20mmol/L邻苯二胺,0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H2O2），50μl/孔，37℃孵育15分钟,再每孔加入50μl量的1.25%H2SO4终止反应。酶标仪492nm波长下读取吸光值（OD值）。
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在某一抗体滴度下50%阻断146S抗原量。纯化的146S抗原为本方法有效抗原计算的最根本的标准抗原。
2.4普通FMDV灭活抗原有效抗原量的标定
方法步骤同上，按每孔50μl量在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按适当的比例作2倍连续稀释（ELISA板：A-D排，1-12列），按每孔50μl量在血清稀释孔内加入按不同比例稀释的FMDV灭活抗原和作为标准对照抗原的已滴定最佳工作浓度的146S抗原（阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断的146S抗原量），不同浓度的FMDV抗原和标准对照抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔。计算标准阳性血清50%阻断的普通FMDV抗原中的有效抗原含量，经146S抗原标定过的普通FMDV抗原，其有效抗原量既已确定就可以作为该方法的标准对照抗原。
2.5被检抗原有效抗原量计算：
Figure BDA00002615752900171
血清抗体滴度计算（改进的reed-munech法）
Figure BDA00002615752900172
血清抗体滴度D=1/2n+s
n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数；
临界值（OD50%）:即标准对照抗原平均OD492nm值的50%。
2.6与蔗糖密度梯度离心方法纯化146S抗原比较
口蹄疫病毒灭活抗原30份，其中亚洲1型纯化146S样品2份、AsialⅠ/JSL抗原18份、AsialⅠ/XJ毒株5份、O型毒株1份、A型毒株1份、AsialⅠ/O型混合（1∶1）抗原1份、亚洲1/A型混合（1∶1）抗原1份、Asial1/O/A型混合（1∶1:1）抗原1份。用反向液相阻断ELISA方法测定上述20份样品的有效抗原量，同时用蔗糖密度梯度离心纯化其中23份样品的146S含量。
2.7取值范围将阳性标准血清50%阻断标准对照抗原的有效抗原量平行重复多次，计算每次的有效抗原量，以最大值减去最小值除以2作为系统的修正值，因此被检样品的有效抗原量的取值范围等于测定值±n修正值(n为抗原的稀释倍数)。
2.8检测的最低限度（敏感性）和特异性
敏感性：将FMDV AsialⅠ/JSL灭活抗原作系列稀释，当根据抗体效价计算得到的抗原含量与实际稀释的抗原量能保持一致的最小抗原含量。
特异性：将O型、A型FMDV灭活抗原与亚洲1型FMDV抗原一起作为被检抗原检测，亚洲1型标准阳性血清与亚洲1型FMDV抗原发生阳性反应，与O型、A型FMDV抗原不反应。
3结果
3.1亚洲1型标准阳性血清抗体滴度
按照口蹄疫亚洲1型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒要求操作，亚洲1型标准阳性血清抗体滴度为1:720(1:512~1:1024)。
3.2FMDV AsialⅠ/JSL抗原146S纯化结果
110ml新灭活FMDV AsialⅠ/JSL抗原经蔗糖密度梯度离心，按0.5ml/管取样，在紫外分光光度计260nm波长，0.5光程下测定吸光值，合并146S病毒粒子再次测定吸光值（OD值=0.061），合并146S抗原6ml，计算总含量93.55μg，即15.59μg/ml。
3.3标准阳性血清阻断50%146S抗原量的测定结果
抗原对照及不同浓度的146S抗原与阳性标准血清的抗体滴度对应关系如下表3：
表3
Figure BDA00002615752900181
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在某一抗体滴度（1:720）50%阻断146S抗原量，即0.4μg/ml。
3.4一般FMDV灭活抗原有效抗原量的标定结果
将FMDV AsialⅠ/JSL灭活抗原按预先滴定的稀释倍数1:3稀释，146S抗原按0.4μg/ml稀释，在同一块ELISA板上各重复6孔，然后计算各自对应抗体滴度的平均值。FMDV AsialⅠ/JSL灭活抗原对应抗体滴度的平均值为1:628，146S抗原对应的平均值为1:609。计算FMDV AsialⅠ/JSL灭活抗原量为1.16μg/ml。
将抗体滴度进行四舍五入后处理：1:628,即1：630；1:609，即1：610；
被检抗原的有效抗原量=（被检抗原对应的抗体滴度/标准对照抗原对应的抗体滴度）×（对照抗原的有效抗原量/稀释倍数）×被检抗原对应的稀释倍数=1：630/1：610×0.4/1×3=610/630×0.4×3=1.1619≈1.16(μg/ml)
3.5取值范围
将FMDV AsialⅠ/JSL灭活抗原有效抗原含量为1.16μg/ml，以0.387μg/ml稀释做20个重复测定，测定最大值为0.425μg/ml，最小值为0.328μg/ml，（0.45-0.347）/2=0.0485μg/ml，被检抗原的有效抗原含量应为测定值±0.05n(n为被检抗原的稀释度)，本实施例中被检抗原的有效抗原含量=1.16±0.15μg/ml。
3.6检测的最低限度（敏感性）和特异性
敏感性：将FMDV AsialⅠ/JSL灭活抗原作系列稀释，阳性血清抗体滴度为1:3110时，对照抗原对应的抗体滴度为1:810，被检的有效抗原含量为0.101μg/ml，与实际稀释的抗原量（0.1μg/ml）接近。因此该方法检测最低限度（敏感性）为0.1μg/ml。
特异性：将A型和O型FMDV灭活抗原与亚洲1型FMDV灭活抗原一起作为被检抗原检测，亚洲1型标准阳性血清与亚洲1型FMDV抗原发生阳性反应，与A型和O型FMDV灭活抗原均呈阴性反应。因此该方法具有良好的特异性。
3.7反向液相阻断ELISA测定及蔗糖密度梯度离心纯化30份抗原样品结果比较
30份样品经反向液相阻断ELISA测定有效抗原含量和蔗糖密度梯度离心纯化146S抗原结果及相互关系见下表4，其中亚洲1/A等体积混合抗原、Asial1/O等体积混合抗原、Asial1/O/A等体积混合抗原的亚洲1型抗原和FMDV Asial1/JSL-18为同一份抗原。
表4
Figure BDA00002615752900191
从上表146S与ELISA测定的有效抗原的比值可以看出：反向液相阻断ELISA检测亚洲1型FMDV有效抗原含量与蔗糖梯度离心纯化146S抗原，相关系数为0.982，属于高度相关；从ELISA测定有效含量与蔗糖纯化146S含量的相关趋势图（图2所示。）也可以看出两者的相关性趋势非常一致。23份普通亚洲1型FMDV灭活抗原146S抗原与有效抗原含量比值分析，对于正常新灭活FMDV抗原中完整病毒粒子（146S）占全部有效抗原含量的80%左右（平均值为76.0%），随着FMDV病毒的讲解会随之降低。从上表可以看出在反向液相阻断ELSIA测定亚洲1型FMDV有效抗原含量体系中，亚洲1型口蹄疫不同亚型毒株有效抗原量检测不受影响，对于双价抗原或三价抗原中亚洲1型FMDV抗原有效抗原量的检测不受影响，能真实反应亚洲1型FMDV有效抗原量在多价抗原中的含量。
4结论
4.1本研究建立的亚洲1型FMDV有效抗原含量反向液相阻断ELISA技术，检测有效抗原最低限度为0.1μg/ml，因此具有良好的敏感性；与亚洲1型口蹄疫病毒灭活抗原及亚洲1型146S抗原发生阳性反应，与A型、O型FMDV抗原均呈阴性反应，因此具有很好的特异性。
4.2利用FMDV Asial1/JSL毒株作为抗原建立的反向液相阻断ELISA技术，能检测如Asial1/JSL、Asial1/XJ毒株的有效抗原含量及蔗糖纯化146S抗原量，并能根据有效抗原量计算出146S抗原量，不受FMDV亚型间差异的影响。
4.3利用反向液相阻断ELISA测定的亚洲1型FMDV有效抗原含量与蔗糖密度梯度离心纯化的146S抗原具有良好的相关性。可以通过有效抗原的检测计算出146S抗原含量，因此可以代替蔗糖密度梯度离心方法测定146S含量。通过新灭活抗原纯化得到的146S抗原约占全部FMDV有效抗原含量的80%左右，也证明了146S抗原是FMDV抗原有效抗原的主要成分。
4.4本研究为测定亚洲1型FMDV有效抗原量提供了经济、科学有效的技术，为亚洲1型FMD疫苗效力检验动物替代提供了有效的方法。
实施例3利用反向液相阻断ELISA测定A型FMDV有效抗原量方法的建立和应用
1材料和方法
1.1抗原、抗体制备
1.1.1FMDV抗原：以生长于单层BHK21细胞繁殖的FMDV AF-72口蹄疫病毒经二乙烯亚胺灭活后离心除去细胞碎片的上清液作为试验抗原，用pH值7.4PBST稀释以满足试验敏感性和特异性要求的浓度作为最佳工作浓度（1:4）。
1.1.2捕获抗体（兔抗血清）：以纯化的AF-72FMDV146S抗原免疫兔子制备，用pH值9.6碳酸盐缓冲液以预先滴定的使用浓度（1∶1000）稀释包被ELISA板。
1.1.3检测抗体（豚鼠抗血清）：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠并用正常牛血清预阻断制备，用含10%正常牛血清和5%兔血清的PBST稀释至预先滴定的使用浓度(1:1000)。
1.1.4兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，sigma公司购买，用PBST稀释至最佳使用浓度(1:500)。
1.1.5标准阳性血清：用与兔抗血清同源的FMDV疫苗免疫牛制备的高免血清，用液相阻断ELISA方法测定其抗体滴度1:720(1:512~1:1024)。
1.2方法
2.1A型阳性标准血清抗体滴度的测定
用口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA试剂盒（兰州兽医研究所提供）测定其抗体滴度，按操作说明书进行，同时记录标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%抗原时的抗原的工作浓度，作为对照抗原用于测定标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%146S抗原的有效抗原量。
2.2146S抗原纯化及测定
110ml灭活AF-72FMDV经45000rmp，4℃超速离心3小时，弃去上清，沉淀用pH值7.6NET缓冲液悬浮匀浆至2ml，蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）离心35000rmp，8℃离心2.5小时。按0.5ml/管取样，在紫外分光光度计260nm波长，0.5光程下测定吸光值，合并146S病毒粒子再次测定吸光值后并计算146S含量。
2.3标准阳性血清阻断50%146S抗原量的测定
用pH值9.6碳酸盐缓冲液将A型兔抗FMDV血清按最佳使用浓度（1∶1000）稀释并包被ELISA板，50μl/孔，室温过夜，PBST洗板5次。在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按1:128~1:1024比例作2倍连续稀释（ELISA板：A-D排，1-12列），146S抗原(50μg/ml)用PBST按照如下浓度稀释(μg/ml)：2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1μg/ml，加入到稀释好血清的载体板上，血清稀释孔每加50μl，此时阳性血清的抗体滴度变为1:256~1:2048的2倍连续稀释；每个浓度均作2个重复，每个浓度均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔；对照抗原按预先滴定的使用浓度稀释（对照抗原为标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%对照抗原时的对照抗原的浓度），混匀后封板置4℃过夜。将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板，将与兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用豚鼠抗血清稀释液（含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST）按预先滴定的使用浓度（1∶1000）稀释，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板5次，加入用PBST稀释至最佳使用浓度的兔抗豚鼠辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时。洗板5次，加入底物溶液（20mmol/L邻苯二胺,0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H2O2），50μl/孔，37℃孵育15分钟，再每孔加入50μl量的1.25%H2SO4终止反应。酶标仪492nm波长下读取吸光值（OD值）。
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在某一抗体滴度下50%阻断146S抗原量。经蔗糖密度梯度离心纯化的146S抗原为本方法有效抗原计算的最根本的标准抗原。
2.4普通FMDV灭活抗原作为标准抗原有效抗原量的标定
方法步骤同上，按每孔50μl量在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按适当的比例作2倍连续稀释（ELISA板：A-D排，1-12列），按每孔50μl量在血清稀释孔内加入按不同比例稀释的FMDV灭活抗原和作为标准对照抗原的已滴定最佳工作浓度的146S抗原（阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断的146S抗原量），不同浓度的FMDV抗原和标准对照抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔。计算标准阳性血清50%阻断的普通FMDV抗原中的有效抗原含量，经146S抗原标定过的普通FMDV抗原，其有效抗原量既已确定就可以作为该方法的标准对照抗原。
2.5被检抗原有效抗原量计算：
Figure BDA00002615752900231
血清抗体滴度计算（改进的reed-munech法）
Figure BDA00002615752900232
血清抗体滴度D=1/2n+s
n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数；
临界值（OD50%）:即标准对照抗原平均OD492nm值的50%。
2.6与蔗糖密度梯度离心方法纯化146S抗原比较
口蹄疫病毒灭活抗原30份，其中AF-72FMDV纯化146S样品2份、AF-72FMDV抗原23份、AsialⅠ/JSL毒株1份、O型毒株1份、AsialⅠ/A型混合（1∶1）抗原1份、O/A型混合（1∶1）抗原1份、Asial1/O/A型混合（1:1:1）抗原1份。用反向液相阻断ELISA方法测定上述20份样品的有效抗原量，同时用蔗糖密度梯度离心纯化其中23份样品的146S含量。
2.7取值范围
将阳性标准血清50%阻断标准对照抗原的有效抗原量平行重复多次，计算每次的有效抗原量，以最大值减去最小值除以2作为系统的修正值，因此被检样品的有效抗原量的取值范围等于测定值±n修正值(n为抗原的稀释倍数)。
2.8检测的最低限度（敏感性）和特异性
敏感性：将FMDV AF-72灭活抗原作系列稀释，当根据抗体效价计算得到的抗原含量与实际稀释的抗原量能保持一致的最小抗原含量。
特异性：将O型、亚洲1型FMDV灭活抗原与A型FMDV灭活抗原一起作为被检抗原检测，A型标准阳性血清与A型FMDV抗原发生阳性反应，与O型、亚洲1型FMDV灭活抗原不反应。
3结果
3.1A型标准阳性血清抗体滴度
按照口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒要求操作，A型标准阳性血清抗体滴度为1:720(1:512~1:1024)。
3.2FMDV AF-72灭活抗原146S纯化结果
110ml新灭活FMDV AF-72抗原经蔗糖密度梯度离心，按0.5ml/管取样，在紫外分光光度计260nm波长，0.5光程下测定吸光值，合并146S病毒粒子再次测定吸光值（OD值=0.1011），合并146S抗原6ml，计算总含量155.05μg，即25.84μg/ml。
3.3标准阳性血清阻断50%146S抗原量的测定结果
抗原对照及不同浓度的146S抗原与阳性标准血清的抗体滴度对应关系如下表5所示：
表5
Figure BDA00002615752900241
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在某一抗体滴度（1:740）50%阻断146S抗原量，即0.8μg/ml。
3.4普通FMDV抗原作为标准抗原有效抗原量的标定结果
将FMDV AF-72灭活抗原按预先滴定的稀释倍数1:4稀释，146S抗原按0.8μg/ml稀释，在同一块ELISA板上各重复6孔，然后计算各自对应抗体滴度的平均值。FMDV AF-72灭活抗原对应抗体滴度的平均值为1:725，146S抗原对应的平均值为1:820。计算FMDV AF-72灭活抗原量为3.60μg/ml。
将抗体滴度进行四舍五入后处理：1:725,即1：730；1:820，仍取1：820；
被检抗原的有效抗原量=（被检抗原对应的抗体滴度/标准对照抗原对应的抗体滴度）×（对照抗原的有效抗原量/稀释倍数）×被检抗原对应的稀释倍数
=1：730/1：820×0.8/1×4=820/730×0.8×4=3.59453≈3.60(μg/ml)
3.5取值范围
将FMDV AF-72灭活抗原有效抗原含量为3.60μg/ml，以0.903μg/ml稀释做20个重复测定，测定最大值为0.955μg/ml，最小值为0.860μg/ml，（0.955-0.860）/2=0.0475μg/ml，被检抗原的有效抗原含量应为测定值±0.05nμg/ml(n为被检抗原的稀释度)，本实施例中被检抗原的有效抗原含量的取值范围即为3.60±0.2μg/ml。
3.6检测的最低限度（敏感性）和特异性
敏感性：将FMDV AF-72灭活抗原作系列稀释，阳性血清抗体滴度为1:5860时，对照抗原对应的抗体滴度为1:570，被检的有效抗原含量为0.104μg/ml，与实际稀释的抗原量（0.1μg/ml）接近。因此该方法检测最低限度（敏感性）为0.1μg/ml。
特异性：将亚洲1型和O型FMDV灭活抗原与A型FMDV灭活抗原一起作为被检抗原检测，A型标准阳性血清与A型FMDV抗原发生阳性反应，与亚洲1型和O型FMDV灭活抗原均呈阴性反应。因此该方法具有良好的特异性。
3.7反向液相阻断ELISA测定及蔗糖密度梯度离心纯化30份抗原样品结果比较
30份样品经反向液相阻断ELISA测定有效抗原含量和蔗糖密度梯度离心纯化146S抗原结果及相互关系见下表6，其中O/A等体积混合抗原、Asial1/A等体积混合抗原、Asial1/O/A等体积混合抗原的A型抗原和FMDV Asial1/JSL AF-72-23为同一份抗原。
表6
从上表6146S与ELISA测定的有效抗原的比值可以看出：反向液相阻断ELISA检测A型FMDV有效抗原含量与蔗糖梯度离心纯化146S抗原，返回相关系数0.969，属于高度相关；从ELISA测定有效含量与蔗糖纯化146S含量的相关趋势图（图3所示。）也可以看出两者的相关性趋势非常一致。23份普通A型FMDV灭活抗原146S抗原与有效抗原含量比值分析，对于正常新灭活FMDV抗原中完整病毒粒子（146S）占全部有效抗原含量的50%左右（平均值为49.6%），随着FMDV病毒的讲解会随之降低。从上表可以看出在反向液相阻断ELSIA测定A型FMDV有效抗原含量体系中，对于双价抗原或三价抗原中A型FMDV抗原有效抗原量的检测不受影响，能真实反应A型FMDV有效抗原量在多价抗原中的含量。
4结论
4.1本研究建立的A型FMDV有效抗原含量反向液相阻断ELISA技术，检测有效抗原最低限度为0.1μg/ml，因此具有良好的敏感性；与A型口蹄疫病毒灭活抗原及A型146S抗原发生阳性反应，与亚洲1型、O型FMDV抗原均呈阴性反应，因此具有很好的特异性。
4.2利用FMDV AF-72毒株作为抗原建立的反向液相阻断ELISA技术，能检测普通灭活抗原A型FMDV的有效抗原含量及蔗糖纯化146S抗原量，并能根据有效普通灭活抗原的有效抗原含量预测含有的146S抗原含量。
4.3利用反向液相阻断ELISA测定的A型FMDV有效抗原含量与蔗糖密度梯度离心纯化的146S抗原具有良好的相关性。可以通过有效抗原的检测计算出146S抗原含量，因此可以代替蔗糖密度梯度离心方法测定146S含量。
4.4本研究为测定A型FMDV有效抗原量提供了经济、科学有效的技术，为A型FMD疫苗效力检验动物替代提供了有效的方法。

Claims (7)

1.一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法，其特征在于通过将标准阳性血清的稀释方法固定以达到固定血清的量的目的，并将待检抗原作系列稀释与之作用，同时设置已知有效抗原含量的标准对照抗原，参考阳性标准血清在某一抗体效价下阻断50%标准对照抗原的有效抗原量的测定结果，基于标准阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，通过以下公式计算得到：
Figure FDA00002615752800011
其中，血清的具体抗体滴度按以下公式计算得到：
Figure FDA00002615752800012
血清抗体滴度D=1/2n+s
其中，n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数；
临界值（OD50%）:即标准对照抗原平均OD492nm值的50%。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的标准对照抗原为已知有效抗原含量的抗原，包括纯化的146S抗原，经146S标定过的已知有效抗原含量的普通抗原。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的标准对照抗原为经蔗糖密度梯度离心纯化得到的146S抗原。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体的包括以下步骤：
（1）标准阳性血清抗体滴度测定；
（2）FMDV 146S抗原的纯化及含量测定；
（3）标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%时146S有效抗原量的测定；
（4）待检FMDV样品有效抗原量的标定
a、包被ELISA板
用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液将兔抗FMDV血清稀释并包被ELISA板，室温过夜，PBST洗板5次；
b、按每孔50μl量在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按比例作2倍连续稀释，按每孔50μl量在血清稀释孔内加入按不同比例稀释的FMDV抗原以及作为标准对照抗原的146S抗原，不同浓度稀释的待检FMDV抗原和作为标准对照抗原的146S抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100μl/孔，其中146S抗原量为阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断时146S抗原含量；
c、洗板和转移
将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板，将与兔抗血清同源的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清和5%健康兔血清的PBST稀释至工作浓度，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；
d、酶促反应
洗板5次，加入用PBST稀释的兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板5次，加入底物溶液，50μl/孔，37℃孵育15分钟，再每孔加入50μl量的1.25%H2SO4终止反应，酶标仪492nm波长下读取吸光值；
（5）被检FMDV抗原有效抗原量计算：
Figure FDA00002615752800021
其中，血清的具体抗体滴度按以下公式计算得到：
Figure FDA00002615752800022
血清抗体滴度D=1/2n+s
n为略低于临界值的稀释滴度的连续稀释倍数的指数；
临界值（OD50%）:即标准对照抗原平均OD492nm值的50%。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于将所述的标准对照抗原替换为经146S标定过的已知有效抗原含量的普通抗原，所述的普通抗原按照权利要求4中步骤（3）的方法标定。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，标准阳性血清阻断50%时146S有效抗原量的测定是按照以下步骤进行的：
a、包被ELISA板
用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液将兔抗FMDV血清稀释并包被ELISA板，室温过夜，PBST洗板5次；
b、抗原抗体反应
在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按比例作2倍连续稀释，一般使得血清抗体滴度处于4个稀释滴度的中间，按每孔50μl量在血清稀释孔内加入用PBST按不同比例稀释的146S抗原以及已知有效抗原含量的抗原作为对照抗原；不同浓度稀释的146S抗原和对照抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，对照抗原加入量为标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%对照抗原时的对照抗原的抗原含量，混匀后封板置4℃过夜；
c、洗板和转移
将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板，将与兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清和5%健康兔血清的PBST根据使用浓度进行稀释，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；
d、酶促反应
洗板5次，加入用PBST稀释的兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，50μl/孔，封板，37℃孵育1小时；洗板5次，加入底物溶液，50μl/孔，37℃孵育15分钟，再每孔加入50μl量的1.25%H2SO4终止反应，酶标仪492nm波长下读取吸光值；
选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断146S的有效抗原量，作为本方法最根本的标准对照抗原。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于所述的FMDV抗原包括O型FMDV抗原，亚洲I型FMDV抗原以及A型FMDV抗原。
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