CN104792990A - 一种a型口蹄疫竞争elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒。通过采用本发明的试剂盒对原来体外反应工艺进行改进，大大缩短了反应时间，由原来的4小时缩短为1.5小时，节省了体外反应的原辅料，更加快捷、经济。本发明采用酶标抗体进行反应，比传统的酶标二抗工艺，检测更为准确灵敏。采用本发明方法包被的反应板吸附性强，能够有效促进检测的准确性。

Description

一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术
口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引发的高传染性的偶蹄动物疾病，由于其传播性强，发病率高严重影响各国的畜牧业的发展，同时它亦是人畜共患病，社会危害性极大，已被列为国家农业部归为一类传染病。根据血清型口蹄疫共分为A、O、C、AsiaⅠ、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ七种，每个型又有若干个亚型，它们之间的抗原性都有很大的不同，给口蹄疫的防治工作带来很多困难。开发一种实用、灵敏、特异的检测诊断方法十分必要。
目前关于口蹄疫的诊断技术大致分为五大类临床诊断、血清学诊断、生物学试验、分子生物学检测技术以及环介导；其中以血清学中ELISA检测方法最为快速、敏感、准确。关于口蹄疫酶联免疫吸附试验主要有液相阻断ELISA、固相竞争ELISA、间接ELISA和间接夹心ELISA等，它们在应用中都存在一定的弊端。液相阻断法不仅可以检测病毒感染还可以检测抗体评价疫苗免疫效果，在市场中得到广泛的推广，但其亦存在耗时，操作步骤繁琐，人为误差大等弊端；间接法等虽然操作简单，较为快捷，但是不能定量评价样本中抗体滴度。
发明内容
本发明的目的是提供一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，能够快速、简便、灵敏的进行检测。
本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，试剂盒内设有洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，还包括A型口蹄疫阴阳性对照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反应板、能够与反应板中包被的抗体和加入反应板的样品中抗体反应生成结合物的A型口蹄疫病毒抗原，以及能够与所述结合物反应生成双抗夹心结合物的辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体。
所述A型口蹄疫多抗的96孔反应板是以A型口蹄疫兔抗血清为包被抗体，通过以下方法制备得到：
（1）、A型口蹄疫兔抗血清与PB缓冲液按体积比为1∶4000的比例稀释，然后以100μL/孔的加样量加入到反应板中，备用；
（2）、将步骤（1）的反应板在温度为4℃下包被20h，经洗涤液洗涤2-3次后，向反应板中加入封闭液，每孔200μL，备用；
（3）、将步骤（2）制得的反应板置于温度为4℃的条件下封闭16h，甩液后在温度为37℃的条件下干燥3h，即制得A型口蹄疫多抗的反应板。
包被A型口蹄疫多抗的反应板所用封闭液为牛血清蛋白体积浓度为5%的PB缓冲液。
所述A型口蹄疫兔抗血清的制备方法，包括以下步骤：
1）、将A型口蹄疫重组蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1的体积别混合乳化，制得乳化液，备用；
2）、对重为1.8-2.2kg的兔子进行首次免疫，每隔两周用乳化液对兔子进行一次加强免疫；
3）、末次加强免疫后的第7天进行一次耳缘静脉采血，检测血清抗体效价，OD450nm值达到1.9-2.1时，进行心脏采血，并将血清纯化即制得A型口蹄疫兔抗血清。
所述A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
、对96孔反应板进行样品布局，划分为样品列、阳性对照列、阴性对照列和多个病毒抗原对照孔，备用；
、在反应板中样品列的各孔内分别加入50μL样品稀释液，然后向样品列第一行的各孔分别加入50μL已稀释2倍的样品液，混合并搅拌均匀后制得稀释4倍后的样品液，再从样品列第一行各孔中吸取50μL样品液加入到第二行的各孔中，制得稀释8倍后的样品液，重复上述吸取、稀释过程，制得稀释不同倍数的样品液，采取同样的方法对阳性对照血清、阴性对照血清和PBST进行稀释，得到稀释不同倍数的阳性对照血清液、阴性对照血清液和病毒抗原对照液，备用；
、向反应板中的各孔分别加入50μL的病毒抗原，之后进行封板，并在温度为37℃下温育60min，备用；
、取出步骤的反应板并用洗涤液连续清洗4-6次，然后在洗水纸上甩干，向反应板的各孔内分别加入A型口蹄疫酶标单抗50μL，之后封板并在温度为37℃下 温育35min，备用；
、取出步骤的反应板并用洗涤液连续清洗4-6次，然后向反应板的各孔内分别加入底物溶液50μL，在温度为37℃下避光温育15min，然后向每孔内分别加入终止液50μL，并在450nm的波长下读取吸光值，计算其抗体效价；
、若抗体效价大于或等于1:64判为口蹄疫A型抗体阳性；1:64～1:32时，判为可疑；小于或者等于1:32，判为阴性；可疑血清样品进行复测，复测抗体效价大于或等于1:64，判为阳性，小于1:64判为阴性。
有益效果
    一、通过采用本发明的试剂盒对原来体外反应工艺进行改进，大大缩短了反应时间，由原来的4小时缩短为1.5小时，节省了体外反应的原辅料，更加快捷、经济。
 二、本发明采用酶标抗体进行反应，比传统的酶标二抗工艺，检测更为准确灵敏。
三、采用本发明方法包被的反应板吸附性强，能够有效促进检测的准确性。
具体实施例
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，试剂盒内设有洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，还包括A型口蹄疫阴阳性对照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反应板、能够与反应板中包被的抗体和加入反应板的样品中抗体反应生成结合物的A型口蹄疫病毒抗原，以及能够与所述结合物反应生成双抗夹心结合物的辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体。
所述A型口蹄疫多抗的96孔反应板是以A型口蹄疫兔抗血清为包被抗体，通过以下方法制备得到：
（1）、A型口蹄疫兔抗血清与PB缓冲液按体积比为1∶4000的比例稀释，然后以100μL/孔的加样量加入到反应板中，备用；
（2）、将步骤（1）的反应板在温度为4℃下包被20h，经洗涤液洗涤2-3次后，向反应板中加入封闭液，每孔200μL，备用；
（3）、将步骤（2）制得的反应板置于温度为4℃的条件下封闭16h，甩液后在温度为37℃的条件下干燥3h，即制得A型口蹄疫多抗的反应板。
包被A型口蹄疫多抗的反应板所用封闭液为牛血清蛋白体积浓度为5%的PB缓冲液。
所述A型口蹄疫兔抗血清的制备方法，包括以下步骤：
1）、将A型口蹄疫重组蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1的体积别混合乳化，制得乳化液，备用；
2）、对重为1.8-2.2kg的兔子进行首次免疫，每隔两周用乳化液对兔子进行一次加强免疫；
3）、末次加强免疫后的第7天进行一次耳缘静脉采血，检测血清抗体效价，OD450nm值达到1.9-2.1时，进行心脏采血，并将血清纯化即制得A型口蹄疫兔抗血清。
所述A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
、对96孔反应板进行样品布局，划分为样品列、阳性对照列、阴性对照列和多个病毒抗原对照孔，备用；
、在反应板中样品列的各孔内分别加入50μL样品稀释液，然后向样品列第一行的各孔分别加入50μL已稀释2倍的样品液，混合并搅拌均匀后制得稀释4倍后的样品液，再从样品列第一行各孔中吸取50μL样品液加入到第二行的各孔中，制得稀释8倍后的样品液，重复上述吸取、稀释过程，制得稀释不同倍数的样品液，采取同样的方法对阳性对照血清、阴性对照血清和PBST进行稀释，得到稀释不同倍数的阳性对照血清液、阴性对照血清液和病毒抗原对照液，备用；
、向反应板中的各孔分别加入50μL的病毒抗原，之后进行封板，并在温度为37℃下温育60min，备用；
、取出步骤的反应板并用洗涤液连续清洗4-6次，然后在洗水纸上甩干，向反应板的各孔内分别加入A型口蹄疫酶标单抗50μL，之后封板并在温度为37℃下 温育35min，备用；
、取出步骤的反应板并用洗涤液连续清洗4-6次，然后向反应板的各孔内分别加入底物溶液50μL，在温度为37℃下避光温育15min，然后向每孔内分别加入终止液50μL，并在450nm的波长下读取吸光值，计算其抗体效价；
、若抗体效价大于或等于1:64判为口蹄疫A型抗体阳性；1:64～1:32时，判为可疑；小于或者等于1:32，判为阴性；可疑血清样品进行复测，复测抗体效价大于或等于1:64，判为阳性，小于1:64判为阴性。
实施例1
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液，还包括：
（1）包被A型口蹄疫多抗的反应板：以A型口蹄疫兔抗血清为包被抗体，经PB缓冲液稀释到1∶4000，以100ul/孔的加样量加入96孔反应板，4℃条件下包被20h，洗涤液洗涤2-3次，再加入封闭液200ul/孔，4℃条件下封闭16h后甩液，于37℃干燥3h，装袋封口。
（2）A型口蹄疫酶标单抗：辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体。
（3）A型口蹄疫病毒抗原：用于定量检测样本抗体。
（4）A型口蹄疫阴阳性对照血清：用于试验认可标准。
所述封闭液为含5%牛血清蛋白的PB缓冲液；所述辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体购于洛阳佰奥通试验材料中心；所述A型口蹄疫病毒抗原和A型口蹄疫阴阳性对照血清购于中国农业科学院兰州兽医研究所。
所述A型口蹄疫兔抗血清的制备方法为：以A型口蹄疫重组蛋白与弗氏完全佐剂进行1∶1混合乳化，然后选择2kg左右的兔子进行首次免疫；以A型口蹄疫重组蛋白与弗氏不完全佐剂进行1∶1混合乳化液，每隔两周进行一次加强免疫；末次加强后的第7天进行一次耳缘静脉采血，检测血清抗体效价，当效价达到要求后，进行心脏采血，并将血清纯化制备得A型口蹄疫兔抗血清。
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒的检测方法，将A型口蹄疫兔抗血清包被在96孔反应板上，然后向孔内加入稀释液和样本进行梯度稀释，再向孔内加入定量的A型口蹄疫病毒抗原，这样已包被A型口蹄疫兔抗血清和样本血清中的抗体竞争A型口蹄疫病毒抗原，经洗涤液洗涤板内只剩下A型口蹄疫兔抗血清和A型口蹄疫病毒抗原的结合物；接着向孔内加入A型口蹄疫酶标单抗，形成A型口蹄疫多抗-A型口蹄疫病毒抗原-A型口蹄疫酶标单抗的双抗夹心结合物，加入辣根过氧化物酶底物显色液，得到A型口蹄疫多抗含量，结合病毒抗原含量评价出样本抗体效价，具体操作步骤如下：
（1）稀释样本：对96孔反应板进行样品布局，前10列作为样品列，11列为阳性对照列，第12列为阴性对照和病毒抗原对照列，参照表1。首先，向各孔加入50ul样品稀释液，接着向1-10列A孔加入50ul的已稀释2倍样品液并混合均匀，所得稀释浓度为1:4，然后从A孔吸取50ul样品加入B孔混合均匀，所得稀释浓度为1:8，以此类推稀释到H孔得到样品的稀释浓度为1:512。同时将已稀释4倍阳性对照血清亦作相同的稀释，得到1:8-1:1024的梯度稀释；阴性血清做1:2-1:4的梯度稀释。
（2）抗原抗体反应：向每孔加入等量50ul的病毒抗原，血清的稀释度加倍，变为1:8～1:1024，得到的样品及对照稀释布局如表1。然后封板，37℃ 温育60min.
（3）用洗涤液连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干。加A型口蹄疫酶标单抗，50μL/孔，封板，37℃ 温育35min。
（4）同上洗板5次，加50μL/孔底物溶液，37℃避光温育15min。每孔再加50μL终止液终止反应，立即在450nm波长下读取光吸收值（OD450nm 值）。
（5）结果判定：
1. 试验认可标准
每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至工作浓度，与血清/病毒抗原复合物同步加入酶标板孔，50uL/孔。病毒抗原对照D450nm 值应在1.7±1范围内。 阳性对照抗体效价应在 1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1：8。
2. 血清抗体效价的判定
抗原对照是4孔，弃去最高和最低OD450nm 值，计算剩余2孔的平均OD450nm 值，再除以2，即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50％反应的对照OD450nm 值。以病毒抗原对照平均OD450nm 值的50%为临界值，被检血清OD450nm 值大于临界值的孔为阴性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔。某份血清系列稀释中，阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体效价。若临界值处于两个稀释孔OD450nm 值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如处于1:64（反对数值为1.8）与1:128（反对数值为2.1）之间，则判定该份血清的抗体效价为1:90（反对数值为1.95）。定性检测中，两个重复孔只要有一孔为阳性孔，则抗体滴度判为1:128，两孔均为阳性孔，则判为抗体滴度＞1:128。
3. 结果判定
抗体效价大于或等于1:64判为口蹄疫A型抗体阳性；1:64～1:32时，判为可疑；小于或者等于1:32，判为阴性。可疑血清样品，可以复测，复测抗体效价大于或等于1:64，判为阳性，小于1:64判为阴性。
4. ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护关系
牛、羊：抗体滴度≥1:64,99%以上保护；≤1:16不保护；效价在1:22-64间，50%以上保护。
抗体效价计算对照表
本发明中洗涤液、样品稀释液，显色液，终止液属于现有技术，本领域技术人员可以根据需要配置。
实施例2
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒的制备：
1、以A型口蹄疫重组蛋白与弗氏完全佐剂进行1∶1混合乳化，然后选择2kg左右的兔子进行首次免疫；以A型口蹄疫重组蛋白与弗氏不完全佐剂进行1∶1混合乳化液，每隔两周进行一次加强免疫；末次加强后的第7天进行一次耳缘静脉采血，检测血清抗体效价，当效价达到要求后，进行心脏采血，并将血清纯化制备得A型口蹄疫兔抗血清。
2、包被A型口蹄疫多抗的反应板的制备：以A型口蹄疫兔抗血清为包被抗
体，经PB缓冲液稀释到1∶4000，以100ul/孔的加样量加入96孔反应板，4℃条件下包被20h，洗涤液洗涤2-3次，再加入封闭液200ul/孔，4℃条件下封闭16h后甩液，于37℃干燥3h，装袋封口。
3、按照已有的技术配置相应的，显色液、终止液、洗涤液和样品稀释液等。
辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体购于洛阳佰奥通试验材料中心； A型口蹄疫病毒抗原和A型口蹄疫阴阳性对照血清购于中国农业科学院兰州兽医研究所。
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒检测样品中A型口蹄疫抗体：
向已包被A型口蹄疫兔抗血清的96孔板上，加入的样品稀释；取10份牛血清，用样品稀释液对其进行1:2稀释，然后各取50ul于96孔板上进行2倍的梯度稀释，同时对阴阳对照进行稀释；接着向96孔板加入50ul/孔A型口蹄疫病毒抗原，然后封板，37℃ 温育60min。用洗涤液连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干。加A型口蹄疫酶标单抗，50μL/孔，封板，37℃ 温育35min。。用洗涤液连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干，加50μL/孔底物溶液，37℃避光温育15min。每孔再加50μL终止液终止反应，立即在450nm波长下读取光吸收值（OD450nm 值）。
实施例3
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒的制备同实施例2。
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒检测样品中A型口蹄疫抗体：
向已包被A型口蹄疫兔抗血清的96孔板上，加入的样品稀释；取10份猪血清，用样品稀释液对其进行1:2稀释，然后各取50ul于96孔板上进行2倍的梯度稀释，同时对阴阳对照进行稀释；接着向96孔板加入50ul/孔A型口蹄疫病毒抗原，然后封板，37℃ 温育60min。用洗涤液连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干。加A型口蹄疫酶标单抗，50μL/孔，封板，37℃ 温育35min。。用洗涤液连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干，加50μL/孔底物溶液，37℃避光温育15min。每孔再加50μL终止液终止反应，立即在450nm波长下读取光吸收值（OD450nm 值）。
实施例4
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒的制备同实施例2。
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒检测样品中A型口蹄疫抗体：
向已包被A型口蹄疫兔抗血清的96孔板上，加入的样品稀释；取10份羊血清，用样品稀释液对其进行1:2稀释，然后各取50ul于96孔板上进行2倍的梯度稀释，同时对阴阳对照进行稀释；接着向96孔板加入50ul/孔A型口蹄疫病毒抗原，然后封板，37℃ 温育60min。用洗涤液连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干。加A型口蹄疫酶标单抗，50μL/孔，封板，37℃ 温育35min。用洗涤液连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干，加50μL/孔底物溶液，37℃避光温育15min。每孔再加50μL终止液终止反应，立即在450nm波长下读取光吸收值（OD450nm 值）。

Claims (3)

1.一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，试剂盒内设有洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，其特征在于：还包括A型口蹄疫阴阳性对照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反应板、能够与反应板中包被的抗体和加入反应板的样品中抗体反应生成结合物的A型口蹄疫病毒抗原，以及能够与所述结合物反应生成双抗夹心结合物的辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述A型口蹄疫多抗的96孔反应板是以A型口蹄疫兔抗血清为包被抗体，通过以下方法制备得到：
（1）、A型口蹄疫兔抗血清与PB缓冲液按体积比为1∶4000的比例稀释，然后以100μL/孔的加样量加入到反应板中，备用；
（2）、将步骤（1）的反应板在温度为4℃下包被20h，经洗涤液洗涤2-3次后，向反应板中加入封闭液，每孔200μL，备用；
（3）、将步骤（2）制得的反应板置于温度为4℃的条件下封闭16h，甩液后在温度为37℃的条件下干燥3h，即制得A型口蹄疫多抗的反应板。
3.根据权利要求2所述的一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：包被A型口蹄疫多抗的反应板所用封闭液为牛血清蛋白体积浓度为5%的PB缓冲液。
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