CN105136782A - 一种免疫磁微粒化学发光法hcmv ie1抗原检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免疫磁微粒化学发光法HCMV？IE1抗原检测试剂盒，包括偶联有抗HCMV？IE1单克隆抗体的磁微粒混悬液、标准品、辣根过氧化物酶标记的抗HCMV？IE1多克隆抗体应用液、化学发光底物液、样品稀释液和洗涤液；将HCMV？IE1单克隆抗体包被在磁珠微球表面，捕捉样本中的IE1抗原再与加入的酶标HCMV？IE1多克隆抗体形成磁微粒-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物，催化酶促化学发光底物发光。

Description

一种免疫磁微粒化学发光法HCMV IE1抗原检测试剂盒

技术领域

本发明属免疫检测分析技术领域，尤其涉及一种免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒。

背景技术

人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus，HCMV)属于人类疱疹病毒β亚科病毒，在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布。在我国血清流行病学调查显示，40～100％成人有HCMV抗体。目前的研究表明HCMV是人类先天性感染最常见的病原体之一，对孕妇及胎儿影响巨大，常造成流产、死胎、胎儿畸形、发育迟缓及迟发性中枢神经系统缺陷等疾病。研究发现在发达国家先天性HCMV感染率比发展中国家要低：意大利为0.47％(CI:0.22–1.0％)；瑞典为0.46％(CI:0.37–0.58％)；冈比亚HCMV的先天性感染率高达13.6％。美国对HCMV先天性感染及影响做过详细的研究，其先天性感染率为1％，每年约40000新生儿伴有先天性HCMV感染，其中10％～15％发生迟发性后遗症，主要为迟发性耳聋(SNHL)、智力障碍、学习能力低下等神经系统损伤性疾病，其中因SNHL每年付出高达10亿美元的医疗帐单。目前我国还没有HCMV先天性感染率的详实流行病学调查结果。但2011年我国出生人口约1615万，以美国先天性HCMV感染率来计算，则我国2011年约有16.2万新生儿患先天性HCMV感染。家庭和国家都将为此支出高昂的成本。实际上，据现有的研究结果显示，我国先天性HCMV感染新生儿是16.2万人/年的2-3倍。由于先天性HCMV感染难以于产前确诊，迟发性后遗症如SNHL与新生儿听力筛查存在时间上的错位，难以早期发现。目前的研究还显示，尽早对先天性HCMV感染的患儿进行抗病毒治疗可以挽救听力。因此，承待建立临床简便易行且高度特异性的方法进行新生儿先天性感染的早期确诊。

病毒分离是诊断先天性HCMV感染的“金标准”。但传统的病毒分离方法需要半个月左右才能判定结果，费用昂贵，而且需要经过特殊训练的专业人员才可以胜任，ELISA方法虽然获得结果迅速，但是存在自动化程度不高等弊端。新近出现的将病毒分离与IE1抗体间接免疫荧光相结合的方法虽能在24h左右获得结果，但无法实现高通量和标准化检测。IE1基因是HCMV的立即早期基因，由HCMVUL122-UL123基因编码，它在病毒感染2h即开始表达，控制HCMVDNA的复制起始。现已证实是新生儿排毒的主要途径之一，其中HCMV的检出率与尿液相同。因此，我们制备了基于双抗体夹心和化学发光原理的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，可以准确筛查新生儿先天性HCMV感染，其检测结果与病毒分离和PCR检测高度一致。

发明内容

本发明的目的是：针对现有HCMV先天性感染测技术的不足，提供一种无创性免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，用于HCMV先天性感染检测。一种免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，包括偶联有抗HCMVIE1单克隆抗体的磁微粒混悬液、标准品、辣根过氧化物酶标记的抗HCMVIE1多克隆抗体应用液、化学发光底物液、样品稀释液和洗涤液。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，将HCMVIE1单克隆抗体包被在磁珠微球表面，捕捉样本中的IE1抗原再与加入的酶标HCMVIE1多克隆抗体形成磁微粒-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物，催化酶促化学发光底物发光。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述偶联有抗HCMVIE1单克隆抗体的磁微粒混悬液为含1g/L包被有抗体磁微粒的0.1MpH7.6PBS缓冲液；所述HCMVIE1单克隆抗体包括轻链和重链，轻链的氨基酸的序列如序列表SEQNo1.所示；所述重链的氨基酸的序列如序列表中SEQNo2.所示。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒表面的活性基团为羧基。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，包被磁微粒的抗体为HCMVIE1单克隆抗体，产生抗IE1单克隆抗体的杂交瘤编号为D94/D95，单克隆抗体可变区氨基酸序列如序列表SEQNo1.所示。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的抗HCMVIE1多克隆抗体应用液，为含1:8000稀释的辣根过氧化物酶标记兔免疫血清的0.1MpH7.6PBS缓冲液。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述标准品是以0.05MTris-NaCl、0.05MEDTA-Na₂、和1％牛血清白蛋白组成pH7.4缓冲液为基质，加入重组IE1蛋白纯品配制而成，标准品形态为液态。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物由A液和B液组成。

所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物中的A液为0.5MLuminol和0.25M对碘苯酚和0.2MTris-HCl缓冲液组成，最后调至pH7.4；化学发光底物B液为pH7.40.25M过氧化脲溶液。所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为含0.1％吐温200.1MpH7.6PBS缓冲液。

本发明的工作原理为双抗体夹心法酶联免疫与化学发光技术相结合的检测方法。在标本中加入包被HCMVIE1(D94/D95)单克隆抗体的免疫磁珠和HRP标记抗HCMVIE1多克隆抗体。包被免疫磁珠与酶标抗体分别与标本中IE1抗原的不同表位结合，形成磁珠-抗体-抗原-抗体复合物。在外加磁场中实现分离，弃去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶的作用下催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出了光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，在检测范围中，发光强度与样本中的IE1浓度成正比。

本发明所述的一种HCMVIE1抗原酶促化学发光法检测试剂盒，其特征在于有如下组份组成：

(1)偶联抗HCMVIE1(D94/D95)单克隆抗体的磁微粒混悬液，所述的HCMVIE1单克隆抗体包括轻链和重链，其中所述轻链的氨基酸的序列如序列表SEQNo1.所示，所述重链的氨基酸的序列如序列表中SEQNo2.所示。

(2)HRP标记的兔抗HCMVIE1多克隆抗体，该多克隆抗体来自重组IE1蛋白免疫新西兰大耳白兔所得。

(3)IE1标准品，是用pH7.4缓冲液(0.05M的Tris-NaCl、0.05MEDTA-Na₂、和1％BSA)溶解一定量的重组IE1蛋白纯品配制而成，标准品形态为液态，具有良好的稳定性。

(5)阴性参考品，为从排除乙型肝炎病毒、HIV和丙肝型肝炎病毒感染的新生儿唾液与标本稀释液按比例混合，过滤除菌制成；

(6)化学发光底物A由0.5MLuminol和0.25M对碘苯酚和0.2MTris-HCl缓冲液组成，最后调节pH至7.4；

(7)化学发光底物B为0.25M过氧化脲溶液，最后调节pH至7.4；

(8)洗涤液为含0.1％吐温200.1MpH7.6PBS缓冲液。

有益效果：

本发明公开一种无创、快速、准确度高、特异性好、灵敏度高的化学发光法检测婴儿唾液中HCMVIE1抗原的试剂盒制备方法。其优势体现在以下几个方面：

(1)其检测结果与目前业内公认的“金标准”—(病毒分离)方法一致率为100％。(见表2，3)，与荧光定量法一致率同样为100％。

(2)本发明检测方法通过检测婴幼儿唾液中病毒抗原，来反映患者HCMV感染状态，是一种无创的检测方法，减轻病人痛苦。

(3)本发明检测方法采用化学方法方法，其整个检测过程只需45min，较传统的HCMV病毒分离(2周以上)、HCMVpp65抗原血症(约4h)、快速免疫荧光(约48h)和PCR(约6h)方法极大的缩短了检测时程。

(4)本发明检测方法采用化学方法方法，整个检测过程除加样外均为机器化操作，尽可能的避免因人工操作导致的误差和对结果判断上的主观性。

(5)本发明检测方法为化学方法方法，采用抗体包被磁微粒，从而极大的增加了抗原抗体接触的面积，另外采用酶促化学方法的方法来增加检测方法的灵敏度。相对已有的抗原检测方法(pp65抗原血症)更加敏感，且具有定量的可能性。本发明检测方法使低水平的抗原血症检出得以实现。

(6)本发明检测方法所检测的靶抗原为HCMVIE1蛋白，该蛋白为HCMV特有，同属疱疹病毒的其他亚科不编码该蛋白(或其同源物)，通过制备HCMVIE1特异性单克隆抗体，来保证检测方法的特异性。

附图说明

图1.HPLC检测IE1标准品的纯度

图2.WesternBlot检测IE1单抗和酶标IE1多抗与HCMV培养物的反应性A：Abcam公司IE1单克隆抗体对照；B：本发明中的IE1酶标记多克隆抗体；C：本发明中的IE1(D94/D95)单克隆抗体(“+”为病毒培养物提取的蛋白；“-”为未感染病毒的细胞提取的蛋白)

图3.本发明试剂盒的标准曲线

具体实施方式

为了实现本发明的技术方案，本发明采用了如下具体实施方式。

1HCMVIE1抗原标准品的制备

1.HCMVIE1基因的扩增

核酸提取：将HCMVAD169株病毒(安徽医科大学微生物学教研室保存)接种至MRC-5细胞(购自美国ATCC)，待细胞病变达到70％以上时，Trizol(Invitrogen公司)法提取总RNA，经紫外分光光度计测定其纯度为A260nm/A280nm＝1.91。

引物设计、cDNA第一链合成、聚合酶链反应：根据已报道的HCMV病毒基因序列(GenBank登录号FJ527563)设计引物，在上、下游引物分别增加HindIII和BamHI酶切位点及保护碱基，由华大基因合成。

上游引物：5’-CCCAAGCTTATGGAGTCCTCTGCCAAGAGA-3’

下游引物：5’-CGCGGATCCCTGGTCAGCCTTGCTTCTAGT-3’

cDNA第一链合成：按照M-MLVReverseTranscriptase(Promage公司)说明书进行。

聚合酶链反应(PCR)：按照TaqDNAPolymerase(Takara公司)说明书进行加样，反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72C延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下可观察到在1800bp处出现单一的条带，符合IE1基因的大小。

2.HCMVIE1原核表达菌株的构建

双酶切：用BamHI和SacI分别双酶切IE1基因扩增产物和原核表达载体pET21a(密理博公司)，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析后，利用DNA凝胶回收试剂盒，按照操作说明回收纯化酶切后的目的基因和载体。

连接：按照线性化载体与目的片段的量为1:3比例，取2μl线性化载体pET21a、6μlIE1基因片段、1μlT4DNA连接酶及1μl连接缓冲液混匀，16℃连接过夜。

转化：将连接反应液10μl加入100μlE.coliBL21(DE3)感受态细菌中，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴5min，加入900μlSOC液体培养基，37℃温和振摇1h，3500r/min离心1min，弃去900μL上清，留100μL均匀涂在含氨卞青霉素的选择性LB培养基上，37℃恒温培养16h。

鉴定：次日挑取单克隆接种于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中37℃过夜培养，离心收集菌体，利用质粒小提试剂盒小量提取质粒。用BamHI和SacI双酶切此质粒，经1％的琼脂糖凝胶电泳可见，在1686bp处有特异条带。同时将提取的质粒送华大基因进行DNA序列测定，结果显示构建的pET21a-IE1载体中的IE1基因DNA序列与IE1基因cDNA序列一致。

3.重组IE1蛋白的表达、纯化

重组IE1蛋白的表达：选取鉴定后的菌种，接种至液体LB培养基中37℃培养，当菌液浓度在吸光度达到0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，32℃诱导5h后收取菌液。重组IE1蛋白以可溶形式表达，故将菌体超声破碎后，离心收集上清。

重组IE1蛋白的纯化：重组IE1蛋白C端融合有组氨酸标签(6×His)，依次经镍离子亲和层析、DEAE阴离子交换层析和分子筛层析得到精纯的重组IE1蛋白。经过SDS-PAGE电泳可见单一条带，用Bio-Rad公司的QuantityOne凝胶分析软件鉴定纯度>95％，高效液相色谱(HPLC)显示重组IE1形成的峰面积占总面积的99.3％(图1)，纯度可以作为标准品。

4.标准品制备

将纯化的重组IE1蛋白用Lowry法定量，无菌滤器(0.22μm)过滤除菌，溶解于含0.05MTris-NaCl、0.05MEDTA-Na₂、和1％牛血清白蛋白组成pH7.4缓冲液中制成标准品。

2抗IE1抗体的制备和验证

2.1抗IE1(D94/D95)单克隆抗体的制备

采用小鼠腹腔接种法制备含单克隆抗体的腹水。具体操作过程为：于BALb/c小鼠腹腔内注射0.5ml液体石蜡油；2周后再向小鼠腹腔注射5×10⁶个杂交瘤细胞(总体积为0.5ml)；10-14天后小鼠腹腔有腹水渗出，根据鼠的健康状况可一次杀鼠取腹水，或间隔数日抽取腹水几次，采水量的多少及采水时间应根据鼠的大小及健康状况决定；将收集的腹水置4℃，离心机12000r/min离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物；上清用滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积10mMpH7.4的PBS稀释；稀释后的腹水经ProteinG层析柱纯化；Lowry法测定纯化后抗体浓度为17.8mg/ml，得到的鼠抗IE1mAb经SDS-PAGE电泳和HPLC鉴定纯度>95％。

2.2抗IE1多克隆抗体的制备

将实施例1中制备重组IE1蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大耳白兔后采集兔血清并纯化获得抗IE1多克隆抗体。具体操作过程为：选取体重为4.0kg左右的雄性新西兰大耳白兔，于皮下多点注射注射纯化后的HCMVIE1蛋白600μg，共4次。第一次免疫将抗原与等量的弗氏完全佐剂混合，后3次与等量弗氏不完全佐剂混合，每次免疫间隔10d。于末次免疫后1周，经耳缘静脉小量采血，通过琼脂双扩散实验测试抗体效价，滴度大于1:32时经腹主动脉放血，分离血清备用。血清经饱和硫酸铵沉淀法，分离出免疫球蛋白，再经ProteinG层析柱纯化，Lowry法测定纯化后抗体浓度的为19.5mg/ml，得到的兔抗IE1多克隆抗体经SDS-PAGE电泳和HPLC鉴定纯度>95％。

2.3辣根过氧化物酶标记兔抗IE1多克隆抗体的制备

采用改良的过碘酸钠法，称5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中，于上液中加入0.2ml新配制的0.1MNaIO₄溶液，4℃避光搅拌20min；将上述溶液装入透析袋中，对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析；加入20μL0.2MpH9.5碳酸氢钠缓冲液，使以上醛基化的HRP的pH升高到9.0，然后立即加入10mg抗体，在1mL0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光搅拌2h；将上述溶液装入透析袋中，对10mMpH7.4的PBS进行透析，加入等体积的饱和硫酸铵溶液静置1h；3000r/min离心30min，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于5mL10mMpH7.4的PBS中；将上述溶液装入透析袋中，对10mMpH7.4的PBS透析，去除铵离子后(奈氏试剂检测)，10000r/min离心30min去沉淀，上清为酶标记多克隆抗体。

2.4抗IE1(D94/D95)单克隆抗体、多克隆抗体和酶标记多克隆抗体的WesternBlot验证

从HCMV感染的MRC-5细胞中提取蛋白，用本发明中的抗体与市售的IE1抗体(购自Abcam公司)分别作为一抗进行WesternBlot试验。观察是否能够检测出IE1蛋白。

结果显示：本发明中的抗IE1单克隆抗体、多克隆抗体和酶标记多克隆抗体与Abcam公司购买的抗IE1单克隆抗体对照均在72kD处检测到阳性条带(图2)。

3制备偶联抗HCMVIE1(D94/D95)单克隆抗体的磁微粒混悬液

3.1缓冲液配制

1)初洗缓冲液的配制：称取0.1952g的MEShygrate于100ml的纯水中，加入50μl吐温-20，配成0.01mol/LMES缓冲液，调整pH至5.0。

2)偶联缓冲液的配制：称取0.38138gNa₂B₄O₇·10H₂O溶于40ml纯水中，得到0.05M硼砂溶液；称取0.1237gH₃BO₃溶于10ml纯水中，得到0.2M硼酸溶液；取18ml0.05M的Na₂B₄O₇溶液与2ml0.2M的H₃BO₃溶液混合，定容至80ml得0.05M硼酸缓冲液。

3)终洗液的配制：称取2.78gNa₂HPO₄溶于100ml纯水得MNa₂HPO₄溶液；称取1.2gNaH₂PO₄溶于50ml纯水得0.2MNaH₂PO₄溶液；取81ml0.2MNa₂HPO₄溶液与19ml0.2MNaH₂PO₄溶液混合，得0.2MPB缓冲溶液得0.2MPB缓冲溶液；取50ml0.2MPB缓冲液，2倍稀释到100ml，加入0.9gNaCl,0.5gBSA、0.05％吐温-20，充分溶解混匀。

4)封闭液的配制：用pH8.5的0.01MTris-HCl缓冲液配制1％的BSA溶液(M/V)100ml。

5)EDC溶液的配制：称取25mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶解于1ml的初洗缓冲液中，配制成25mg/ml的EDC溶液。

6)NHS溶液的配制：称取25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于初洗缓冲液中，配置成25mg/mlNHS溶液。

3.2抗体与磁珠偶联

1)初洗：

a)取100μl磁珠，将其稀释成10mg/ml的磁珠浓度，从中吸取100μl。

b)磁分离架上分离，去上清。

c)用初洗液250μL洗涤三次，磁分离，去上清。

2)活化：

a)取初洗完成的磁珠，加入150μLMES，再加入50μLEDC及50μL的NHS溶液，充分混匀。室温下25℃活化30min。

b)活化完成磁分离去上清，以250μL偶联缓冲液重悬洗涤三次，分离去上清。

3)稀释抗HCMVIE1(D94/D95)单克隆抗体：

a)将抗HCMVIE1单克隆抗体从-20℃冰箱中取出，待其融化后取出40μL，用偶联缓冲液1:10稀释到400μL。

4)偶联：

a)加入400μL用偶联缓冲液稀释的0.08mg/ml浓度的抗HCMVIE1单克隆抗体重悬活化完的磁珠，充分混匀。磁珠包被比率为1mg磁珠包被0.032mg抗体。

b)37℃偶联2h，37℃摇床摇晃恒温混匀。

5)封闭：

a)将偶联结束的磁珠于磁分离架上分离，去上清。

b)加入400μL封闭液，37℃摇床封闭1h。

c)封闭结束后去除上清。

6)终洗保存：

a)以400μL终洗液洗涤封闭完成的磁珠，重复三次。

b)最终定容到500μL。

4检测方法的建立及与其它检测方法的比较

4.1试剂盒组成

本发明所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，包括偶联有抗HCMVIE1(D94/D95)单克隆抗体的磁微粒混悬液、标准品、辣根过氧化物酶标记的抗HCMVIE1多克隆抗体、化学发光底物液以及洗涤液。

磁微粒为表面含有羧基的活性基团，磁微粒混悬液采用氨基戊二醛法制备，通过化学键联结磁性微粒和HCMVIE1抗体，抗体的浓度控制在0.50μg/人份，以0.01MPBS和1％BSA作为缓冲体系和保护体系。

所用的阴性参考品是排除乙型肝炎病毒、HIV和丙型肝炎病毒感染的新生儿唾液与标本稀释液按比例混合过滤除菌制成。

所用的阳性参考品是以阴性参考品中加入重组IE1标准品配制而成，IE1终浓度为100ng/ml。

辣根过氧化物酶标记的抗HCMVIE1多克隆抗体为兔多克隆抗体，用0.01M的pH7.4的PBS和1％酪蛋白组成的稀释液将其稀释至工作浓度1:8000。

化学发光底物A为在100ml双蒸水中加入12.11gTris溶解后加入适量HCl溶液调节pH，最终配制成0.1MpH7.6Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入0.088g鲁米诺和0.051g对碘苯酚，混合均匀。

发光底物B为0.023g过氧化脲和0.024g2-吗啡啉基-3-氯吡啶加入到0.1MpH7.6Tris-HCl缓冲液中混合均匀，定容至100ml制成。

洗涤液为10ml吐温20加入到1L0.1MpH7.6PBS缓冲液中混合均匀。

4.2本发明试剂盒使用操作程序

1)待测样品预处理：取无菌尼龙植绒采样拭子，置于新生儿口腔至唾液饱和，将拭子放入500μl样品稀释液中，震荡20s作为待测样品；

2)在反应杯中依次加入100μl对照品及待测样本；

3)在上述反应杯中再加入磁微粒混悬液20μl；

4)将反应杯中的溶液混合均匀，37℃温育15分钟；

5)使用磁分离器洗涤设备，将反应杯中的磁微粒用洗液洗涤3次；

6)在反应杯中加入酶标记物50μl，37℃温育15分钟；

7)使用磁分离器洗涤设备，将反应杯中的磁微粒用洗液洗涤3次；

8)加入发光底物A和发光底物B各50μl，混匀后室温避光反应5分钟；

9)使用化学发光检测仪检测发光信号值并记录；

10)采用四参数拟合方式，建立定标曲线，计算测定结果。

使用本发明试剂盒按照上述程序检测，所用时间较短，测定结果仅需45分钟即可得出，方便快捷，且准确性高、重复性好。

3.2试剂盒标准曲线范围的确定

将IE1标准品用阴性参考品稀释成不同的浓度进行测定，以稀释的理论浓度为横坐标，对应检测的发光值取对数为纵坐标，以四参数拟合方式进行线性拟合，得到试剂盒标准曲线线性范围为0～3125pg/mL，公式为y＝39.51x+800.6，线性系数R＝0.9946(图3)。

3.3试剂盒Cut-off值

400份由病毒分离检测以及荧光定量PCR同时检测为阴性/阳性的唾液标本，用本公司的试剂盒(批号为20140410)进行检测，ROC曲线分析最佳Cut-off值及相对应的特异性和灵敏度，选择了ROC曲线面积最大的点为最佳Cut-off值。

3.4试剂盒精密度和准确性

3.4.1精密度：分析批内精密度平均7.66％(n＝10)，分析批间精密度平均7.86％(n＝30)，变异系数(CV％)小于10％.

3.4.2准确性：采用回收试验进行检测，回收率(实测浓度与理论浓度的比值)为87％-114％。

3.5与其它方法检测临床标本的结果比较

在检测方法建立后，我们分别对病毒分离检测以及荧光定量PCR同时检测为阳性或阴性的新生儿标本，用本发明中的试剂盒进行了检测，结果见表2和3。

表2.40份阳性标本在本试剂盒的检测结果比较

表3.40份阴性标本在本试剂盒的检测结果比较

Claims (10)

1.一种免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，包括偶联有抗HCMVIE1单克隆抗体的磁微粒混悬液、标准品、辣根过氧化物酶标记的抗HCMVIE1多克隆抗体应用液、化学发光底物液、样品稀释液和洗涤液。

2.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，将HCMVIE1单克隆抗体包被在磁珠微球表面，捕捉样本中的IE1抗原再与加入的酶标HCMVIE1多克隆抗体形成磁微粒-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物，催化酶促化学发光底物发光。

3.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述偶联有抗HCMVIE1单克隆抗体的磁微粒混悬液为含1g/L包被有抗体磁微粒的0.1MpH7.6PBS缓冲液；所述HCMVIE1单克隆抗体包括轻链和重链，轻链的氨基酸的序列如序列表SEQNo1.所示；所述重链的氨基酸的序列如序列表中SEQNo2.所示。

4.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒表面的活性基团为羧基。

5.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，包被磁微粒的抗体为HCMVIE1单克隆抗体，产生抗IE1单克隆抗体的杂交瘤编号为D94/D95，单克隆抗体可变区氨基酸序列如序列表SEQNo1.所示。

6.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的抗HCMVIE1多克隆抗体应用液，为含1:8000稀释的辣根过氧化物酶标记兔免疫血清的0.1MpH7.6PBS缓冲液。

7.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述标准品是以0.05MTris-NaCl、0.05MEDTA-Na₂、和1%牛血清白蛋白组成pH7.4缓冲液为基质，加入重组IE1蛋白纯品配制而成，标准品形态为液态。

8.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物由A液和B液组成。

9.根据权利要求6所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物中的A液为0.5MLuminol和0.25M对碘苯酚和0.2MTris-HCl缓冲液组成，最后调至pH7.4；化学发光底物B液为pH7.40.25M过氧化脲溶液。

10.根据权利要求1所述的免疫磁微粒化学发光法HCMVIE1抗原检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为含0.1%吐温200.1MpH7.6PBS缓冲液。