CN106771182A

CN106771182A - 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒

Info

Publication number: CN106771182A
Application number: CN201611069263.3A
Authority: CN
Inventors: 丁家波; 冯宇; 朱良全; 蒋卉; 彭小薇; 王芳; 张磊
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明涉及牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒。本发明将提纯的布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)经定量后包被96孔酶标板，免疫健康绵羊制备阳性血清，非免疫健康绵羊制备的阴性血清和HRP标记羊抗牛IgM抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记羊抗牛IgM抗体稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。本发明在常规提取LPS方法中，增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提；采用标准曲线和OD529nm吸光度值相结合的方法检测LPS纯度；采用试管凝集试验对阳性血清进行了效价标定；对主要试剂配方的改进和优化，控制反应背景，缩短了高通量检测的时间。

Description

牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，属生物制品检测技术领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是一种严重威胁人类健康的世界性重要人畜共患病，可感染人、多种家畜和野生动物，主要表现为发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损伤等。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，所以建立快速准确的诊断方法对防治和清除布病非常必要。

布鲁氏菌抗体检测中的国际贸易指定试验主要有虎红平板凝集试验(RBT)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。荧光偏振试验(FPA)是国际贸易中选择试验。目前我国《布鲁氏菌病防治技术规范》中规定的牛布鲁氏菌抗体检测方法为：先经虎红凝集试验(RBPT)初步检测，再经试管凝集试验(SAT)或补体结合试验确诊。试管凝集试验不仅操作复杂，耗时长，而且也存在特异性不高的问题；补体结合试验是公认的确诊方法，但是试验操作复杂，需有良好的试验设施和训练有素的人员作准确的组分滴定、试剂保存和结果判断。荧光偏振试验(FPA)对实验条件和操作技术要求都较高。

ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，该方法解决了常规方法耗时费力的不足，提高了检测的特异性、敏感性和便捷性。申请人已经成功开发了牛布鲁氏菌病ELISA诊断试剂盒，不仅申请了国家发明专利(申请号：CN201510477116.9)，还获得了国家新兽药注册证书(证书号：2015新兽药证字67号)，该试剂盒的成功开发和广泛使用，使我国摆脱了对进口试剂盒的依赖。

IgM是机体初次体液免疫反应最早产生的免疫球蛋白，其虽然持续时间短，但由于其最早产生，因此在抗感染免疫的早期起着十分重要的作用，可通过检测IgM抗体进行疾病的早期诊断。另外，IgM因其特殊的五聚体结构，对于抗原的结合能力更强，更容易激活补体系统，所以其对布鲁氏菌血清学检测的干扰更高，导致对血清中真实凝集效价的误判。鉴于以上原因，针对IgM的检测对于布鲁氏菌病的早期诊断和及时了解真实感染状况具有重要意义。

在本发明实施过程中，为了客观评价试剂盒的特异性和敏感性，我们将2009～2013年间课题组收集的350份田间羊的血清样本，经虎红凝集试验初筛后，再用试管凝集试验和商品化竞争ELISA试剂盒检测，选择了49份阳性样本和51份阴性样本。本发明开发的试剂盒，与已确认的49份羊布病阳性血清样本的符合率为95.9％(47/49)，与已确认的121份阴性样本的符合率为92.1％(47/51)，由此确定试剂盒对田间样本的敏感性为95.9％，特异性为92.1％，显示了试剂盒诊断结果的可靠性。

本发明的内容

本发明的目的在于建立了一种牛布鲁氏菌IgM亚型抗体高通量检测技术。其核心是将提纯的布鲁氏菌脂多糖(LPS)经定量后包被96孔酶标板，以人工免疫健康奶牛制备阳性血清，以健康非免疫奶牛血清作阴性血清，HRP标记羊抗牛IgM抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记羊抗牛IgM抗体稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测牛血清中的光滑型布鲁氏菌IgM亚型抗体。

本发明的技术方案

1.一种牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要含有：以制备的布鲁氏菌脂多糖(LPS)作为包被抗原，以人工免疫健康牛制备阳性血清，以采集健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记羊抗牛IgM抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记兔抗羊IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测牛血清中的光滑型布鲁氏菌IgM亚型抗体。

2.本发明所述牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，的特征在于阳性血清的制备和标定方法是：

用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的15月龄成年牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛；对筛选的阴性牛用布鲁氏菌参考强毒株A19灭活抗原以5×10¹⁰CFU/牛颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用试管凝集试验测定凝集效价为2000IU/ml；静脉放血，分离血清，用羊布病阴性血清与效价为2000IU的阳性血清等体积5倍稀释，将其效价调整为400IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，作为试剂盒中布病阳性血清。

3.本发明所述牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒的应用的特征在于使用该试剂盒能对牛布鲁氏菌病早期感染进行高通量检测。

本发明具体实施方式

1.本申请建立了抗原制备用菌种(猪种布鲁氏菌S2株，B.suisS2)的质量标准。

(1)菌落形态菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。

(2)染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～0.6μm之间。革兰氏染色为阴性，柯氏染色为红色。

(3)纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行，应纯粹。

(4)特异性检验

1)血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应出现凝集，与粗糙型血清不出现凝集。

2)以S2基因组DNA为模板，使用如下4条引物，能扩增出大小分别为178bp和285bp的特异性PCR条带。

Feri：5’-GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’(序列1)

Reri:5’-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3’(序列2)

F_melitensis:5’-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3’(序列3)

R_IS711:5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’(序列4)

PCR反应体系：50μL的反应体系中，含5μL 10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物储存液2μL，Taq酶2U，模板DNA 1μL(或挑取菌落少许)。

PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。

结果：扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分别为178bp和733bp(见附图1)。

2.本申请建立了包被抗原LPS的提纯和定量方法

(1)菌悬液制备将鉴定合格的B.suis S2株二级种子接种于胰眎琼脂扁瓶中，37℃培养48小时后，每瓶加入含有0.5％苯酚的生理盐水20ml浸泡菌体表面10min以上，洗下培养物，收集于无菌玻璃瓶中。

(2)菌液灭活及灭活检验将收集好的菌悬液加热到80℃，维持120min，待其自然冷却后，存于4℃。对灭活菌液应进行灭活检验。取灭活菌液0.1ml涂布胰眎琼脂或TSA平板，37℃培养7天，不应无菌生长。

(3)LPS的粗提将灭活检验合格的菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:3(W/W)比例加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热到66℃，然后加入66℃预热的90％(V/V)苯酚溶液。在此温度下(66℃)持续搅拌15min，置室温自然冷却后，于4℃10000g离心15min。用一长管吸弃下层棕红色的酚相，将水相用Whatman1号滤纸过滤去除大菌体碎片。用量筒量取酚相体积，然后加入3倍体积-15℃以下预冷的甲醇(含1％甲醇饱和的醋酸钠)，4℃孵育2小时，4℃10000g离心10min，弃上清。

(4)蛋白酶消化和苯酚抽提将沉淀用原水相1/2体积蒸馏水重悬，加入一定量的蛋白酶K，使其终浓度达50μg/ml，并用1N NaOH调节pH值至8.0，置56℃水浴消化2小时。加入等体积苯酚溶液抽提2遍后，4℃10000g离心10min。收集上清液于4℃保存，在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15min后，10000g离心15min,弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析过夜，换液2次(每一次至少4000ml)，收集透析袋内容物，此即提纯的LPS。

(5)LPS纯度测定将制备的LPS冻干后称重，记录LPS净重M。将商品化LPS标准品稀释成1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml等不同稀释度；同时根据称重结果将LPS配制成1mg/ml的初始浓度，并稀释成100μg/ml的浓度。将上述各稀释度的LPS溶液取100μl/样品加入96孔酶标板上，在529nm波长下读取吸光度。建立LPS标准品各稀释度的OD529值，并建立浓度与吸光度之间的标准曲线。根据标准曲线以及布鲁氏菌LPS吸光度，计算LPS的浓度。LPS纯度为LPS浓度×单位体积/单位质量。

通过上述处理，LPS纯度由一般的85％～88％提高到93％～97％。

3.本申请建立了试剂盒中阴性对照血清和阳性对照血清的制备与检验标准

(1)阴性对照血清的制备

1)动物用虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验均检测为布鲁氏菌抗体阴性的24月龄左右、性成熟的健康牛。

2)血清制备颈静脉采血，分离血清，用0.45μm滤器过滤除菌，收集的血清加入0.05％proclin 300防腐，无菌分装，检验合格后，-20℃保存备用。

(2)阴性对照血清的检验

1)性状橙黄或淡黄色澄清液体。

2)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3)特异性检验经虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验检验应均为阴性。将制备的阴性对照血清作为待检血清，进行间接ELISA检测，其OD450nm<0.1，且P％<10％。

(3)阳性对照血清的制备与检验

(1)阳性对照血清的制备

1)动物筛选用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的24月龄左右成年牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛。

2)血清制备将布鲁氏菌参考疫苗株A19灭活抗原制成菌悬液，以5×10¹⁰CFU/羊颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血。用试管凝集试验测定凝集效价，此时效价一般为2000IU/ml。当效价超过2000IU/ml时，静脉放血，分离血清。根据实际测定的效价，用羊布病阴性血清将其效价稀释至400IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，加入proclin 300至终浓度为0.05％，-20℃保存备用，作为试剂盒中布病阳性血清。

(2)阳性对照血清的检验

①性状橙黄或淡黄色澄清液体。

②无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

③效价测定采用试管凝集试验测定阳性对照血清的效价，应为1:400。将制备的阳性对照血清作为待检血清，进行间接ELISA检测，其OD450nm≥0.8。将阳性对照血清用阴性对照血清进行1:32稀释作为待检血清，进行间接ELISA检测，计算P％，应不低于20％。

4.本发明确定了试剂盒各组分的制备和检验标准

(1)抗原包被板的制备及检验

1)原包被板的制备以包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将抗原稀释至10μg/ml，加入到酶标板中，每孔100μl，2～8℃包被16小时。以1×洗涤液洗涤1次，每孔加入封闭液(含5％明胶的0.01M pH7.4的PBS)200μl，2～8℃封闭24小时。以1×洗涤液洗涤1次，在吸水纸上拍干，自然风干，于铝箔袋真空包装。

2)原包被板的检验包装袋封闭良好，孔底清洁透明，无异物。

(2)20×涤液的配制及检验

1)配制称取Na₂HPO₄·12H₂O 5.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 70.0g，NaCl 170.0g，Tween-2010.0ml，加去离子水至800ml，调pH值至7.2～7.6，定容至1000ml。分装备用。

2)检验

①性状无色透明液体，低温储藏时可能会出现白色结晶，37℃水浴可使其溶解。

②pH值应为7.2～7.6。

(3)样品稀释液的配制及检验

1)配制称取Na₂HPO₄·12H₂O0.25g，NaH₂PO₄·2H₂O3.5g，NaCl8.5g，Tween-200.5ml，蔗糖:5g，加去离子水至800ml，调pH值7.2～7.6，定容至1000ml。加入proclin 300溶液使其终浓度为0.05％，过滤除菌后，无菌分装。

2)检验

①性状无色透明液体。

②无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

③pH值应为7.2～7.6。

(4)HRP标记-羊抗牛IgM抗体的配制及检验

1)配制将HRP标记-羊抗牛IgM抗体(AbD公司)用酶标二抗保护液作1:100稀释，加入proclin 300溶液使其终浓度为0.05％，无菌分装。

2)检验

①性状橙黄色澄明液体。

③效价测定将配制的HRP标记-羊抗牛IgM抗体溶液用稀释液作1:100稀释，作为试剂盒的酶标二抗，用试剂盒的对阳性对照血清、阴性对照血清、质控阳性血清、质控阴性血清进行检测。检测结果应满足：阳性对照血清OD450nm≥0.8；阴性对照血清OD450nm＜0.1且P％＜15％；质控阳性血清P1:P％≥60％；P2:P％≥40％；P3:P％≥15％；质控阴性血清(N1、N2、N3、N4、N5)P％值均＜15％。

(5)HRP标记-羊抗牛IgM抗体稀释液的配制及检验

1)配制称取Na₂HPO₄·12H₂O 0.25g，NaH₂PO₄·2H₂O 3.5g，NaCl 8.5g，Tween-200.5ml，加去离子水至800ml，加入马血清5ml，调pH值7.2～7.6，定容至1000ml。加入proclin300溶液使其终浓度为0.05％，无菌分装。

2)检验

①性状淡黄色澄明液体。

(6)底物显色液的来源及检验

1)来源用于本试剂盒的底物溶液购自美国KPL公司，分为底物溶液A(TMBPeroxidase Substrate)和底物溶液B(Peroxidase Substrate B)。

2)检验性状底物溶液A和B均为棕色瓶包装，无色透明液体。

(7)终止液的配制及检验

1)配制1M HCl，定量分装。

2)检验性状无色透明液体。

5.使用足够样本的参考血清评价试剂盒的特异性和敏感性。

基本步骤如下：(1)将2009～2013年间课题组收集的350份田间牛的血清样本，分别用虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测，将两种方法均检测为阳性的血清样本和均检测为阴性的样本再用补体结合试验确认，选择三种方法全为阳性的血清作为阳性参考血清，三种方法全为阴性的血清作为阴性参考血清。(2)用筛选出的49份确定为布病阳性的血清和51份布病阴性血清作为待检血清，评价试剂盒的可靠性。

附图说明

图1猪布鲁氏菌S2的PCR鉴定鉴定图图中1:大肠杆菌阴性对照；2:DNA Marker；3:M28菌株的PCR扩增。

图2不同包被液包被效果的比较。

图3不同封闭液的效果比较。

图4不同HRP-羊抗牛IgM抗体稀释液的稀释效果比较。

本发明微生物资源信息

本发明所涉及的微生物为：猪种布鲁氏菌(BrucellaSuis)S2株(CVCC70502)，，系猪种布鲁氏菌生物2型，是布鲁氏菌病弱毒活疫苗参考株牛种A19株(或称S19株，CVCC70202)：由北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心鉴定、保管和供应(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p35，25)。

本发明的优点

本发明涉及牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，弥补了国内外无专门针对布病牛IgM亚型抗体的间接ELISA检测方法。选取猪种布鲁氏菌S2株作为LPS提取的生产菌种，在常规提取LPS方法的基础上，增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步骤，有效提高了LPS纯度；采用标准曲线和OD529nm吸光度值相结合的方法，建立了LPS纯度检测方法；采用试管凝集试验对试剂盒阳性血清进行了效价标定，确保试剂盒阳性血清的稳定性。本发明通过对主要试剂配方的改进和优化，有效控制试剂盒的反应背景，缩短了高通量检测所需的时间。本发明将提纯的布鲁氏菌脂多糖(LPS)经定量后包被96孔酶标板，以人工免疫健康绵羊制备阳性血清，以健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记羊抗牛IgM抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记羊抗牛IgM抗体稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测绵羊和山羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。

实施例

以下实施例是为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1

——试剂盒组分优化研究

1.包被液的选择

分别选用碳酸盐缓冲液(pH9.6)、Tris-HCL缓冲液(pH8.5)、磷酸缓冲液(pH7.2)和柠檬酸缓冲液(pH5.0)作为包被液，包被的抗原浓度为均10μg/ml，经封闭液封闭后，与阳性血清反应OD值最高者作为抗原吸附效果最好的包被液。结果通过对4种包被液的比较，表明pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液的包被效果最好(结果见附图2)。

2.封闭液的选择

分别采用含5％明胶的PBS、含10％脱脂奶粉的PBS、含10％马血清的PBS和含3％BSA的PBS作为封闭剂进行封闭，封闭条件为2～8℃24小时。比较阳性对照血清和阴性对照血清的OD值的比值，确定最佳的封闭液成分。结果以含5％明胶的PBS作为封闭剂时，阳性血清的OD值和P/N值均最高，因此，选择含5％明胶的PBS作为本方法的封闭液，结果见附图3。

3.HRP-羊抗牛IgM抗体稀释液的选择

分别比较PBST、含10％脱脂奶粉的PBST、含5％马血清的PBST作为HRP标记羊抗牛IgM抗体稀释液的效果。用上述稀释液分别对羊抗牛IgM抗体进行稀释，比较OD值和P/N值，从中选取阳性血清OD值高，并且P/N值也最高的稀释液作为HRP-羊抗牛IgM抗体稀释液。结果以含5％马血清的PBST作为样品稀释液时，阳性血清的OD值较高，且P/N值最高，因此，以含5％马血清的PBST作为HRP-羊抗牛IgM抗体稀释液，结果见附图4。

实施例2

——牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒阳性对照血清的制备

用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的24月龄左右成年牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛。对筛选的阴性牛用布鲁氏菌参考疫苗株A19(S19)灭活抗原制成菌悬液，以5×10¹⁰CFU/牛颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血。用试管凝集试验测定凝集效价，此时效价一般为1:2000(800IU/ml)。当效价超过2000IU/ml时，静脉放血，分离血清。根据实际测定的效价，用牛布病阴性血清将其效价稀释至400IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，加入proclin 300至终浓度为0.05％，-20℃保存备用，作为试剂盒中布病阳性血清。

1.布病阴性牛筛选

采用虎红平板凝集试验、试管凝集试验及补体结合试验对临床试验牛进行检测，选择三种方法均检测为阴性的成年牛作为制备阳性血清的候选牛。结果试验中选择了编号为021、035、112的三份血清检测，结果见表1。3份待检血清样品与虎红抗原均无凝集颗粒出现，呈均匀浑浊，判为布病抗体阴性。对照阳性血清与虎红抗原呈明显凝集颗粒，液体几乎完全透明。试管凝集试验中3份待检血清样品4个不同稀释度(1:25、1:50、1:100、1:200)结果均为阴性。补体试验中3份待检血清样品均100％溶血，判为布病抗体阴性。

表1三种不同方法对待检血清的检测结果

注：(1)虎红平板凝集试验结果说明：

++++：出现大的凝集片或颗粒，液体完全透明；+++：有明显的凝集颗粒，液体几乎完全透明；++：有较明显的凝集颗粒，液体稍透明；+：稍能见到凝集，液体混浊；—：无凝集，液体均匀混浊。

(2)试管凝集试验结果说明：4+：菌体完全凝集和沉淀，液体100％清亮；3+：菌体几乎完全凝集和沉淀，液体75％清亮；2+：有显著的凝集和沉淀，液体50％清亮；1+：有清楚可见的凝集和沉淀，液体25％清亮；—：无凝集和沉淀，液体菌液混浊。

(3)补体结合试验结果说明：P：阳性；N：阴性。

2.免疫

免疫一般只需进行两次。初免：用2ml布鲁氏菌A19灭活抗原(5×10¹⁰CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性的成年牛。加强免疫：初免3个月后，双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用试管凝集试验测定凝集效价应不低于1:200。若效价达不到标准，继续加强免疫1～2次，15日后再试血，直至效价合格。本发明021、035号和112号牛进行二次免疫后采用试管凝集试验测定的效价分别为1:2100、1:2200、1:2000。

3.血清制备

二免14日后采血，测定试管凝集效价，进一步用阴性对照血清将分离的阳性血清按比例(约5:1)稀释到预期效价为1:400，加入Proclin 300(Sigma公司)至终浓度为0.05％，无菌分装，作为待检阳性对照血清。

4.检验

对制备完成的阳性对照血清按如下项目进行检验：

(1)性状观察血清制品色泽为淡黄或微红色澄明液体。

(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，为无菌生长。

(3)效价测定将血清作1:140，1:150，1:160，1:170，1:180稀释进行试管凝集试验，测定其效价。将制备的血清1:32稀释作为待检血清，用牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒进行检测，计算P％，均不低于85％。

实施例3

——试剂盒敏感性试验

采用3批羊牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒对已确认的49份羊布病阳性血清样本的符合率为95.9％(47/49)，与已确认的121份阴性样本的符合率为92.1％(47/51)，由此确定试剂盒对田间样本的敏感性为95.9％，特异性为92.1％，显示了试剂盒诊断结果的可靠性。

附注

本发明方法使用说明

1 用法

1.1 样品处理取动物全血，待血液凝固后，以4000r/min离心10min，收集上清，血清应清亮，无溶血。

1.2 1×洗涤液的配制使用前，将20×洗涤液恢复至室温(20～25℃)，并摇动，使结晶溶解(可在37℃水浴中加热5～10min)，然后用去离子水作1:20稀释，充分混匀。

1.3 待检血清和对照血清的稀释在血清稀释板中将待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清用样品稀释液作1:50稀释。

1.4 操作步骤

1.4.1 加样取抗原包被板(根据样品多少，可拆开分次使用)，以1×洗涤液300μl/孔洗板1次，弃去洗涤液。将稀释好的待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别加入到ELISA板中，100μl/孔，其中阳性对照血清和阴性对照血清各加2孔(孔1、孔2)。加样结束后，37℃作用30min。取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl 1×洗涤液，洗涤3次，最后1次甩干或拍干。

1.4.2 加酶标抗体将HRP-鼠抗羊Fc段单克隆抗体用稀释液作1:200稀释后，每孔加入100μl，37℃作用30min。按1.4.1中的方法洗涤3次，甩干。

1.4.3 显色与终止将底物溶液A和B按1:1(V/V)混合后，立即加入到ELISA反应板中，100μl/孔，室温避光显色15min后，每孔加50μl终止液终止反应。

2 结果判定反应终止后，15min内用酶标仪测定OD_450nm值。

2.1 计算方法

2.2 实验成立条件

当阳性对照平均OD_450nm≥0.8，阴性对照平均OD_450nm<0.2且P％<85％时，实验成立。

2.3 结果判定

当血清样本的P％值≥85％时，为牛布鲁氏菌IgM亚型抗体阳性；

当血清样本的P％值<85％时，为牛布鲁氏菌IgM亚型抗体阴性。

　　序列表

　　<110>中国兽医药品监察所

　　<120>牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒

　　<130>

　　<160> 4

　　<170>Patentin version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 21

　　<212> DNA

　　<213>人工序列

　　<223>对人工序列的描述：引物Feri

　　<400> 1

　　GCGCCGCGAAGAACTTATCAA 21（序列1）

　　<210>2

　　<211> 20

　　<212> DNA

　　<213>人工序列

　　<223>对人工序列的描述：引物Reri

　　<400>2

　　CGCCATGTTAGCGGCGGTGA 20（序列2）

　　<210>3

　　<211> 23

　　<212> DNA

　　<213>人工序列

　　<223>对人工序列的描述：引物Fmelitensis

　　<400>3

　　AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA 23（序列3）

　　<210>4

　　<211> 24

　　<212> DNA

　　<213>人工序列

　　<223>对人工序列的描述：引物RIS711

　　<400>4

　　TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT 24（序列4）

1

Claims

2.权利要求1所述牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于阳性血清的制备和标定方法是：

3.权利要求1所述牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒的应用，其特征在于使用该试剂盒能对牛布鲁氏菌病早期感染进行高通量检测。