CN104792996B - 一种狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒及其检测方法,其特点是;检测试剂盒由纯化的狂犬病毒抗原包被的微孔板、酶标记的SPA及其他试剂配套组成;检测方法应用间接法原理检测人或动物血清或血浆中的狂犬病毒IgG抗体,适用于狂犬疫苗免疫后血清学效果评价及流行病学调查。本发明应用的酶标抗体是金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A,SPA),其优点在于SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合,因此,本发明在具有ELISA试剂盒的全部特点的同时,不仅可以用于人的狂犬病毒抗体检测,还可以用于多种动物的免疫效果检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测狂犬病毒抗体(IgG)的方法,特别是涉及一种狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒及其检测方法,属于酶联免疫检测技术领域。本发明所述的试剂盒采用间接法测定样品中的狂犬病毒抗体(IgG)含量,可用于狂犬疫苗免疫效果的监控、个体免疫状态的确定。
背景技术
狂犬病(Rabies)俗称疯狗症,是一种人畜共患的传染病,病原体为狂犬病病毒;所有温血动物包括人类,都可能被感染。它会导致动物的急性脑炎和周围神经炎症,发病后死亡率高达百分之百。没有接受疫苗免疫的感染者,当神经症状出现后几乎必然死亡,通常的死亡原因都是由于中枢神经(脑-脊髓)被病毒破坏,最终死于自主神经系统受损导致的脏器衰竭、呼吸衰竭。但是只要及时的接种疫苗,一般都能诱发机体产生足够的免疫力消灭病毒。因而对已注射过疫苗的人或动物进行狂犬病毒抗体(IgG)的检测,是一种有效的评估免疫效果的手段。
目前市场上有类似的相关用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒,多数是ELISA方法,例如。
公开号为CN 101936997A的中国发明给出的一种《 人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒》,所述检测试剂盒包含有:预包被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液,其特征在于:酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体,包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液,包被量为每孔0.1-1μg;封闭液为质量浓度是1-10%的BSA或脱脂牛奶;封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原,包被量为每孔0.1-1μg;样品稀释液为含有质量浓度0.1-10%牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05%NaN3的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS);酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗人IgG酶结合物;浓缩洗涤液为含体积浓度0.05%吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS;酶底物A溶液为3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液,酶底物B溶液为双氧水溶液;终止液为1mol/L H2SO4溶液,阳性对照、阴性对照放置在盒内。
公开号为CN101936998A的中国发明给出的一种《犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒》,试剂盒内:酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体,包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液,包被量为每孔0.1-1μg;封闭液为质量浓度是1-10%的BSA或脱脂牛奶;封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原,包被量为每孔0.1-1μg;样品稀释液为含有质量浓度0.1-10%BSA和含有质量浓度0.01-0.05%NaN3的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS;酶结合物为辣根过氧化物酶-兔抗犬IgG酶结合物;浓缩洗涤液为含体积浓度0.05%吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS;酶底物A溶液为3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液,酶底物B溶液为双氧水溶液;终止液为1mol/L H2SO4溶液,阳性对照、阴性对照放置在盒内。
公开号为CN 102175867A的中国发明给出的《一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒》,其特征在于,其包括:1)包被有0.05μg/ml~0.1μg/ml重组狂犬病病毒G蛋白的酶标板;2)样品稀释液:含有0.5‰~1‰酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液;3)洗涤液:含有0.5‰~1‰吐温的磷酸盐缓冲液;4)酶标记物:用辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgGFc片段单克隆抗体;5)显色剂A:含有0.4‰~0.6‰过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液;6)显色剂B:含有0.2‰~0.25‰四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液;7)终止液:1.5mol/L~2mol/L硫酸溶液;8)阴性对照:正常人血清;9)阳性对照:含有狂犬病毒抗体的人血清。
公开号为CN 103323588A的中国发明给出的《一种犬狂犬病毒抗体的检测方法及检测试剂盒》,这种犬狂犬病毒抗体的检测方法,其特征在于包括下述步骤:(1)确定标准点:通过中和实验用标准品进行标定本方法的标准点,其抗体效价为0.5IU/mL;(2)编号:每次试验应在包被板上设空白对照孔1孔,标准孔3孔,阴性对照孔1孔,阳性对照孔1孔,其余为待检样品孔;(3)加样品稀释液:用加样器在包被板的标准空与待检样品孔加入样品稀释液,每孔100ul;空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔不加样品稀释液;(4)加样:分别于标准孔加入标准品10μl,各待检样品孔加入待检样品10μl,阴性对照孔加入阴性对照血清100μl,阳性对照孔加入阳性对照血清100μl;空白对照孔不加样;(5)温育(一):充分混匀,贴上封板膜,37±2℃温育60分钟;(6)洗板(一):洗板机洗或手洗5次;(7)加酶标结合物:除空白对照孔以外,各孔中加入酶标结合物100μl;(8)温育(二):贴上封板膜,37±2℃温育30分钟;(9)洗板(二):方法同洗板(一);(10)加显色剂:每孔加入显色剂A 50μl,全部加完后再在每孔中加入显色剂B 50μl,混匀;(11)温育(三):37±2℃显色10分钟,显色10分钟指从开始加显色剂B 到开始加终止液的间隔时间;(12)终止:显色完毕后立即于每孔加50μl终止液, 混匀;(13) 测定: 终止后应在10分钟内完成判读,对空白对照调零,用酶标仪在450nm波长处测定吸光值,或使用双波长测定吸光值,测定波长为450nm,参考波长可选630nm或655nm;(14)结果判定:若待测样品的OD值≥标准品OD值,结果判阳性且具备免疫保护水平;若待测样品的OD值<标准品OD值,结果为样品不具备免疫保护水平,个体需进行进一步的免疫。
以上技术方案因为其操作简便、灵敏度高、结果稳定、准确度好等特点,得到广泛认可及应用。但是,这些试剂盒所具有的应用面较窄,针对每一类动物的IgG抗体的检测,均需要制备对应的二抗及抗酶标结合物,使用起来并不方便;同时,在试剂盒灵敏度上,仍有提高的空间,可以进行更精准的检测,使得假阳性、假阴性结果出现的几率大大下降。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足,经过深入研究和大量试验后,提供一种检测狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒及其检测方法,由纯化的狂犬病毒抗原包被的微孔板、酶标记的SPA及其他试剂配套组成,应用间接法原理检测人或动物血清或血浆中的狂犬病毒IgG抗体。适用于狂犬疫苗免疫后血清学效果评价及流行病学调查。
本发明试剂盒应用的酶标抗体是金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal ProteinA,SPA),其优点在于SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合,这种特点使得其较之其他酶结合物,具有更高的灵敏度、低干扰等特点,同时具有广泛的应用面,结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛;对大白鼠、绵羊的亲和力差;对马、犊牛、山羊等无亲和力。因此,本发明试剂盒在具有ELISA试剂盒的全部特点同时,不仅可以用于人的狂犬病毒抗体检测,还可以用于多种动物的免疫效果检测。
为实现上述目的,本发明采用如下原理:先确定RV-Ag包被浓度后包被于微孔板中,加入标准样品或待测样品,孵育后,再加入酶标记的SPA与待测样品结合,反应后加入底物进行显色反应加以测定,根据标准品的吸光度值与其浓度的关系作标准曲线,即可测定待测样品的含量。
本发明给出的技术解决方案是:这种狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒,主要有纯化的狂犬病毒抗原包被板、浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、浓缩洗涤液、阴阳性对照、终止液,包括如下:
1)96孔酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液进行包被,终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml;
2)10倍浓缩稀释液: KH2PO4:0.4g;Na2HPO412H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于100ml蒸馏水中,调节pH至7.2。加入Tween 20 0.5ml,用0.22μm滤膜过滤;
3)酶结合物工作液:辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物,使用稀释液进行5000-20000倍稀释;
4)显色液:柠檬酸盐缓冲液150ml ,H2O2 300μl,小心混匀,作为A液;柠檬酸盐缓冲液150ml,加入OPD 600mg,小心混匀,作为B液,由于OPD的光解性,配制时应注意避光,使用棕色瓶配制;
5)20倍浓缩洗液:KH2PO4:0.4g;Na2HPO412H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于50ml蒸馏水中,加入10ml Tween 20,调节pH值到7.0;
6)阳性对照液:取2 IU/ml的人免疫球蛋白,进行400倍稀释;
7)阴性对照液:人阴性血清稀释100倍;
8)终止液:2mol/L硫酸。
所述的狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒选用抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司。制造本品用的毒种为巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒,由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应。将毒种接种Vero单层细胞扩培后,进行灌流培养。72h后收获病毒液,经浓缩灭活后,进行纯化。将灭活的病毒液经层析柱纯化,灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样,进行凝胶层析纯化,收获层析首峰。抗原检定:纯化蛋白抗原活性峰与狂犬病毒抗体阳性血清呈特异性反应。
所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物,其制备方法如下。
1)肉汤培养基:蛋白胨10g,氯化钠5g,葡萄糖5g,牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4);琼脂培养基:肉汤培养基+2%琼脂粉;金黄色葡萄球菌1800标准菌株:购自中国科学院微生物研究所,溶菌酶:北京鼎国生物技术有限公司。
2)培养方法。
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培,37℃恒温培养24h,菌体呈均匀混浊状即可。再将此培养基传代两次后,将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h,细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体。
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔,离心洗涤三次,收集菌体。加入0.02mol/L,pH8.0的tris缓冲液溶解菌体,使菌体浓度为15%。再加入溶菌酶,使溶菌酶与菌悬液质量比为5%,混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h。冷却后以12000r/min,4℃离心30min,共收集上清液20ml。用氨水调节pH至7.0,加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml,使其饱和度为80%,4℃下静置盐析过夜。次日10000r/min -15000r/min,4℃离心30min,弃去上清。沉淀用0.01mol/L,pH7.4的PBS液15ml溶解,装入预先处理好的透析袋内,4℃下透析24h,收集透析袋内的液体,此为SPA的粗提品。
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱,上样SPA粗提品。待样品完全进入Sephadex G-200后,加入缓冲液,并与装缓冲液瓶连接。调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离,使此密闭系统中流体静水压大约是6-12cm,流速调节到大约4-6ml/h。以1ml/份收集洗脱液,用紫外分光光度计测蛋白浓度,将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图,绘出峰位,收集主峰液各管并合并。收集的样品-20℃保存备用。
3)标记步骤。
(a)称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中,加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml,室温避光搅拌1小时。
(b)上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液,继续搅拌30分钟。
(c)加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时,加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液, 4℃透析过夜。
(d)加入SPA,室温避光轻轻搅拌2小时。
(e)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。
(f)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,沉淀HRP-SPA除去未结合游离物,或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物。
(g)加0.02 mol/L pH7.2 PBS,4℃透析去除NH4 +和SO4 2-。
(h)加等量甘油分装低温保存。
试剂盒的制备程序包括。
1)RV-Ag和酶标抗体浓度的选择,采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度。
2)包被酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液,配制包被液100ml,终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml。酶标板每孔加包被液200μl,用封口膜封好,4℃包被12小时。弃去包被液,加封闭液300μl/孔,再用封口膜封好置于湿盒中37℃ 1小时,最后倒空板,并作封闭、干燥和密封等处理,保存于2-8℃。对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验,并进行检定,合格后方可使用。
使用操作方法:
1)平衡:将试剂盒从冷藏环境中取出,置室温平衡30分钟后使用;
2)配洗液:将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用;
3)洗板:每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复4次,拍干;
4)加样:将阴性对照,阳性对照和空白(样品稀释液)加入到酶标板内,200μl/孔,均设1孔。取1ml稀释液,加入10μl待检样品,充分混合,按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔。振荡混匀后贴上封口膜,置37℃温育30分钟;
5)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复5次,拍干;
6)加酶标记物:每孔加入200μl酶结合物,加盖封板膜,振荡混匀。置37℃温箱中,温育30分钟;
7)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复6次,拍干;
8)显色:每孔依次加入底物A、B液各100μl,加盖封板膜,振荡混匀,37℃避光显色15分钟;
9)终止:每孔加入终止液各50μl,振荡混匀终止反应;
10)测定:用空白对照孔调零,并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值;
11)结果判定。
每个试验结果独立使用,通过(Cut off)值判定结果。
计算临界值:
Cut off(C.0)=0.10+阴性对照平均值(NC)A450值(当阴性平均值A450值小于0.1时,按0.1计算;当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算)
阴性结果:标本吸光度值<临界值为阴性
阳性结果:标本吸光度值≥临界值为阳性。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于。
本发明采用酶联免疫吸附法,应用间接法原理对试剂盒的标准品和样品的测定,以此检测人或动物的血清或血浆中狂犬病毒IgG抗体的含量。本发明所述的试剂盒由纯化的狂犬病毒抗原包被的微孔板、酶标记的SPA及其他试剂配套组成,适用于狂犬疫苗免疫后血清学效果评价及流行病学调查。本发明所述的试剂盒应用的酶标抗体是金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A,SPA),其优点在于SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合,因此,本发明所述的试剂盒在具有ELISA试剂盒的全部特点同时,不仅可以用于人血清中狂犬病毒IgG抗体的含量检测,还可以用于多种动物血清中狂犬病毒IgG抗体的含量检测。
附图说明
图1为IgG标准品曲线。
具体实施方式
以下的实施例详细说明了本发明,但不用于限制本发明的范围。
实施例1: 检测狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒的制备与人血清检测。
狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒,主要由纯化的狂犬病毒抗原包被板、浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、浓缩洗涤液、阴阳性对照、终止液。包括如下:
1)96孔酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液进行包被,终浓度的蛋白含量为0.3μg/ml;
2)10倍浓缩稀释液: KH2PO4:0.4g;Na2HPO412H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于100ml蒸馏水中,调节pH至7.2。加入Tween 20 0.5ml,用0.22μm滤膜过滤;
3)酶结合物工作液:辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物,使用稀释液进行10000倍稀释;
4)显色液:柠檬酸盐缓冲液150ml ,H2O2 300μl,小心混匀,作为A液;柠檬酸盐缓冲液150ml,加入OPD 600mg,小心混匀,作为B液,由于OPD的光解性,配制时应注意避光,使用棕色瓶配制;
5)20倍浓缩洗液:KH2PO4:0.4g;Na2HPO412H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于50ml蒸馏水中,加入10ml Tween 20,调节pH值到7.0;
6)阳性对照液:取2 IU/ml的人免疫球蛋白,进行400倍稀释;
7)阴性对照液:人阴性血清稀释100倍;
8)终止液:2mol/L硫酸。
狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒选用抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司。制造本品用的毒种为巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒,由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应。将毒种接种Vero单层细胞扩培后,进行灌流培养。72h后收获病毒液,经浓缩灭活后,进行纯化。将灭活的病毒液经层析柱纯化,灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样,进行凝胶层析纯化,收获层析首峰。
所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物,其制备方法如下。
1)肉汤培养基:蛋白胨10g,氯化钠5g,葡萄糖5g,牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4);琼脂培养基:肉汤培养基+2%琼脂粉;金黄色葡萄球菌1800标准菌株:购自中国科学院微生物研究所,溶菌酶:北京鼎国生物技术有限公司。
2)培养方法。
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培,37℃恒温培养24h,菌体呈均匀混浊状即可。再将此培养基传代两次后,将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h,细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体。
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔,离心洗涤三次,收集菌体。加入0.02mol/L,pH8.0的tris缓冲液溶解菌体,使菌体浓度为15%。再加入溶菌酶,使溶菌酶与菌悬液质量比为5%,混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h。冷却后以12000r/min,4℃离心30min,共收集上清液20ml。用氨水调节pH至7.0,加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml,使其饱和度为80%,4℃下静置盐析过夜。次日12000r/min,4℃离心30min,弃去上清。沉淀用0.01mol/L,pH7.4的PBS液15ml溶解,装入预先处理好的透析袋内,4℃下透析24h,收集透析袋内的液体,此为SPA的粗提品。
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱,上样SPA粗提品。待样品完全进入Sephadex G-200后,加入缓冲液,并与装缓冲液瓶连接。调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离,使此密闭系统中流体静水压大约是6-12cm,流速调节到大约4-6ml/h。以1ml/份收集洗脱液,用紫外分光光度计测蛋白浓度,将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图,绘出峰位,收集主峰液各管并合并。收集的样品-20℃保存备用。
3)标记步骤。
(a)称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中,加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml,室温避光搅拌1小时。
(b)上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液,继续搅拌30分钟。
(c)加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时,加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液, 4℃透析过夜。
(d)加入SPA,室温避光轻轻搅拌2小时。
(e)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。
(f)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,沉淀HRP-SPA除去未结合游离物,或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物。
(g)加0.02 mol/L pH7.2 PBS,4℃透析去除NH4 +和SO4 2-。
(h)加等量甘油分装低温保存。
制备程序包括。
1)RV-Ag和酶标抗体浓度的选择,采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度。
2)包被酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液,配制包被液100ml,终浓度的蛋白含量为0.3μg/ml。酶标板每孔加包被液200μl,用封口膜封好,4℃包被12小时。弃去包被液,加封闭液300μl/孔,再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时,最后倒空板,并作封闭、干燥和密封等处理,保存于2-8℃。对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验,并进行检定,合格后方可使用。
使用操作方法:
1)平衡:将试剂盒从冷藏环境中取出,置室温平衡30分钟后使用;
2)配洗液:将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用;
3)洗板:每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复4次,拍干;
4)加样:将阴性对照,阳性对照和空白(样品稀释液)加入到酶标板内,200μl/孔,均设1孔。取1ml稀释液,加入10μl待检样品,充分混合,按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔。振荡混匀后贴上封口膜,置37℃温育30分钟;
5)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复5次,拍干;
6)加酶标记物:每孔加入200μl酶结合物,加盖封板膜,振荡混匀。置37℃温箱中,温育30分钟;
7)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复6次,拍干;
8)显色:每孔依次加入底物A、B液各100μl,加盖封板膜,振荡混匀,37℃避光显色15分钟;
9)终止:每孔加入终止液各50μl,振荡混匀终止反应;
10)测定:用空白对照孔调零,并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值;
11)结果判定。
每个试验结果独立使用,通过(Cut off)值判定结果。
计算临界值:
Cut off(C.0)=0.10+阴性对照平均值(NC)A450值(当阴性平均值A450值小于0.1时,按0.1计算;当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算)
阴性结果:标本吸光度值<临界值为阴性
阳性结果:标本吸光度值≥临界值为阳性。
实施例2: 狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒的制备与狗血清的检测。
狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒,主要由纯化的狂犬病毒抗原包被板、浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、浓缩洗涤液、阴阳性对照、终止液。包括如下:
1)96孔酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液进行包被,终浓度的蛋白含量为0.1μg/ml;
2)10倍浓缩稀释液: KH2PO4:0.4g;Na2HPO412H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于100ml蒸馏水中,调节pH至7.2。加入Tween 20 0.5ml,用0.22μm滤膜过滤;
3)酶结合物工作液:辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物,使用稀释液进行20000倍稀释;
4)显色液:柠檬酸盐缓冲液150ml ,H2O2 300μl,小心混匀,作为A液;柠檬酸盐缓冲液150ml,加入OPD 600mg,小心混匀,作为B液,由于OPD的光解性,配制时应注意避光,使用棕色瓶配制;
5)20倍浓缩洗液:KH2PO4:0.4g;Na2HPO412H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于50ml蒸馏水中,加入10ml Tween 20,调节pH值到7.0;
6)阳性对照液:取2 IU/ml的犬免疫球蛋白,进行400倍稀释;
7)阴性对照液:犬阴性血清稀释100倍;
8)终止液:2mol/L硫酸。
狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒选用抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司。制造本品用的毒种为巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒,由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应。将毒种接种Vero单层细胞扩培后,进行灌流培养。72h后收获病毒液,经浓缩灭活后,进行纯化。将灭活的病毒液经层析柱纯化,灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样,进行凝胶层析纯化,收获层析首峰。
所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物,其制备方法如下。
1)肉汤培养基:蛋白胨10g,氯化钠5g,葡萄糖5g,牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4);琼脂培养基:肉汤培养基+2%琼脂粉;金黄色葡萄球菌1800标准菌株:购自中国科学院微生物研究所,溶菌酶:北京鼎国生物技术有限公司。
2)培养方法。
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培,37℃恒温培养24h,菌体呈均匀混浊状即可。再将此培养基传代两次后,将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h,细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体。
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔,离心洗涤三次,收集菌体。加入0.02mol/L,pH8.0的tris缓冲液溶解菌体,使菌体浓度为15%。再加入溶菌酶,使溶菌酶与菌悬液质量比为5%,混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h。冷却后以12000r/min,4℃离心30min,共收集上清液20ml。用氨水调节pH至7.0,加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml,使其饱和度为80%,4℃下静置盐析过夜。次日12000r/min,4℃离心30min,弃去上清。沉淀用0.01mol/L,pH7.4的PBS液15ml溶解,装入预先处理好的透析袋内,4℃下透析24h,收集透析袋内的液体,此为SPA的粗提品。
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱,上样SPA粗提品。待样品完全进入Sephadex G-200后,加入缓冲液,并与装缓冲液瓶连接。调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离,使此密闭系统中流体静水压大约是6-12cm,流速调节到大约4-6ml/h。以1ml/份收集洗脱液,用紫外分光光度计测蛋白浓度,将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图,绘出峰位,收集主峰液各管并合并。收集的样品-20℃保存备用。
3)标记步骤。
(a)称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中,加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml,室温避光搅拌1小时。
(b)上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液,继续搅拌30分钟。
(c)加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时,加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液, 4℃透析过夜。
(d)加入SPA,室温避光轻轻搅拌2小时。
(e)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。
(f)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,沉淀HRP-SPA除去未结合游离物,或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物。
(g)加0.02 mol/L pH7.2 PBS,4℃透析去除NH4 +和SO4 2-。
(h)加等量甘油分装低温保存。
制备程序包括。
1)RV-Ag和酶标抗体浓度的选择,采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度。
2)包被酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液,配制包被液100ml,终浓度的蛋白含量为0.1μg/ml。酶标板每孔加包被液200μl,用封口膜封好,4℃包被12小时。弃去包被液,加封闭液300μl/孔,再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时,最后倒空板,并作封闭、干燥和密封等处理,保存于2-8℃。对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验,并进行检定,合格后方可使用。
使用操作方法:
1)平衡:将试剂盒从冷藏环境中取出,置室温平衡30分钟后使用;
2)配洗液:将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用;
3)洗板:每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复4次,拍干;
4)加样:将阴性对照,阳性对照和空白(样品稀释液)加入到酶标板内,200μl/孔,均设1孔。取1ml稀释液,加入10μl待检样品,充分混合,按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔。振荡混匀后贴上封口膜,置37℃温育30分钟;
5)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复5次,拍干;
6)加酶标记物:每孔加入200μl酶结合物,加盖封板膜,振荡混匀。置37℃温箱中,温育30分钟;
7)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复6次,拍干;
8)显色:每孔依次加入底物A、B液各100μl,加盖封板膜,振荡混匀,37℃避光显色15分钟;
9)终止:每孔加入终止液各50μl,振荡混匀终止反应;
10)测定:用空白对照孔调零,并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值;
11)结果判定。
每个试验结果独立使用,通过(Cut off)值判定结果。
计算临界值:
Cut off(C.0)=0.10+阴性对照平均值(NC)A450值(当阴性平均值A450值小于0.1时,按0.1计算;当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算)
阴性结果:标本吸光度值<临界值为阴性
阳性结果:标本吸光度值≥临界值为阳性
结果。
1)狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒检测人免疫组与非免疫组的结果。
表1 免疫组与非免疫组的结果对比。
由表1结果所示,本试剂盒有较强的特异性,灵敏度高,符合临床使用要求。
2)狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒检测狗免疫组与非免疫组的结果。
表2 免疫组与非免疫组的结果对比。
由表2结果所示,本试剂盒有较强的特异性,灵敏度高,符合临床使用要求。
3)标准曲线(图1 IgG标准品曲线)。
从图1可以看出,各个标准品线性关系良好,回归曲线Y=0.0010X+0.0126,R2=0.9952,因此计算出的样品IgG含量,非常接近真实值。
4)样品回收率实验。
表3 不同样品的回收率。
由表3可知,该试剂盒的灵敏度可以达到4mIU/mL,优于市场销售的同类产品,使用该试剂盒测得的样品回收率平均值为101.17%,当样品浓度降至2 mIU/mL时,其回收率结果较大,不具有参考价值。
Claims (2)
1.一种狂犬病毒IgG抗体酶联免疫检测试剂盒,主要有96孔酶标板、10倍浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、20倍浓缩洗液、阴阳性对照、终止液,其特征在于包括有:
(1)96孔酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液进行包被,终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml;
(2)10倍浓缩稀释液:KH2PO4:0.4g;Na2HPO4•12H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于100ml蒸馏水中,调节pH至7.2,加入Tween 20 0.5ml,用0.22μm滤膜过滤;
(3)酶结合物工作液:辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物,使用稀释液进行5000-20000倍稀释;
(4)底物显色液:柠檬酸盐缓冲液150ml ,H2O2 300μl,小心混匀,作为A液;柠檬酸盐缓冲液150ml,加入OPD 600mg,小心混匀,作为B液,由于OPD的光解性,配制时应注意避光,使用棕色瓶配制;
(5)20倍浓缩洗液:KH2PO4:0.4g;Na2HPO4•12H2O:5.8g;NaCl:16.0g;KCl:0.4g;溶于50ml蒸馏水中,加入10ml Tween 20,调节pH值到7.0;
(6)阳性对照液:取2 IU/ml的人免疫球蛋白,进行400倍稀释;
(7)阴性对照液:人阴性血清稀释100倍;
(8)终止液:2mol/L硫酸;
(9)其灵敏度可达到4mIU/mL ;
选用的狂犬病毒抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司,制造本品用的毒种为由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应的巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒,将毒种接种Vero单层细胞扩培后,进行灌流培养,72h后收获病毒液,经浓缩灭活后,进行纯化,将灭活的病毒液经层析柱纯化,灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样,进行凝胶层析纯化,收获层析首峰,抗原检定:纯化蛋白抗原活性峰与狂犬病毒抗体阳性血清呈特异性反应;
所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物由以下方法制备:
1)肉汤培养基:蛋白胨10g,氯化钠5g,葡萄糖5g,牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4;琼脂培养基:肉汤培养基+2%琼脂粉;金黄色葡萄球菌1800标准菌株:购自中国科学院微生物研究所,溶菌酶:北京鼎国生物技术有限公司;
2)培养方法:
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培,37℃恒温培养24h,菌体呈均匀混浊状即可,再将此培养基传代两次后,将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h,细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体;
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔,离心洗涤三次,收集菌体,加入0.02mol/L,pH8.0的tris缓冲液溶解菌体,使菌体浓度为15%,再加入溶菌酶,使溶菌酶与菌悬液质量比为5%,混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h,冷却后以12000r/min,4℃离心30min,共收集上清液20ml,用氨水调节pH至7.0,加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml,使其饱和度为80%,4℃下静置盐析过夜,次日12000r/min,4℃离心30min,弃去上清,沉淀用0.01mol/L,pH7.4的PBS液15ml溶解,装入预先处理好的透析袋内,4℃下透析24h,收集透析袋内的液体,此为SPA的粗提品;
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱,上样SPA粗提品,待样品完全进入Sephadex G-200后,加入缓冲液,并与装缓冲液瓶连接,调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离,使此密闭系统中流体静水压是6-12cm,流速调节到4-6ml/h,以1ml/份收集洗脱液,用紫外分光光度计测蛋白浓度,将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图,绘出峰位,收集主峰液各管并合并,收集的样品-20℃保存备用;
3)标记步骤:
(a) 称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中,加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml,室温避光搅拌1小时;
(b) 上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液,继续搅拌30分钟;
(c) 加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时,加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液,4℃透析过夜;
(d) 加入SPA,室温避光轻轻搅拌2小时;
(e) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时;
(f) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,沉淀HRP-SPA除去未结合游离物,或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物;
(g) 加0.02 mol/L pH7.2 PBS,4℃透析去除NH4 +和SO4 2+ ;
(h) 加等量甘油分装低温保存;
所述的狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒由以下方法制备:
a)狂犬病毒抗原RV-Ag和酶标抗体浓度的选择,采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度;
b)包被酶标板,用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液,稀释狂犬病毒纯化液,配制包被液100ml,终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml,酶标板每孔加包被液200μl,用封口膜封好,4℃包被12小时,弃去包被液,加封闭液300μl/孔,再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时,最后倒空板,并作封闭、干燥和密封等处理,保存于2-8℃,对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验,并进行检定,合格后方可使用。
2.一种如权利要求1所述的狂犬病毒IgG抗体酶联免疫检测试剂盒的使用操作方法,其特征在于:
1)平衡:将试剂盒从冷藏环境中取出,置室温平衡30分钟后使用;
2)配洗液:将所述20倍浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用;
3)洗板:每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复4次,拍干;
4)加样:将阴性对照,阳性对照和样品稀释液加入到酶标板内,200μl/孔,均设1孔,取1ml稀释液,加入10μl待检样品,充分混合,按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔,振荡混匀后贴上封口膜,置37℃温育30分钟;
5)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复5次,拍干;
6)加酶结合物:每孔加入200μl酶结合物,加盖封板膜,振荡混匀,置37℃温箱中,温育30分钟;
7)洗板:弃去反应液,每孔加入稀释后的洗液300μl,静置数秒,弃去洗液,重复6次,拍干;
8)显色:每孔依次加入底物A、B液各100μl,加盖封板膜,振荡混匀,37℃避光显色15分钟;
9)终止:每孔加入终止液各50μl,振荡混匀终止反应;
10)测定:用空白对照孔调零,并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值;
11)结果判定
每个试验结果独立使用,通过Cut off值判定结果;
计算临界值:
Cut off(C.0)=0.10+阴性对照平均值(NC)A450值,当阴性平均值A450值小于0.1时,按0.1计算;当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算
阴性结果:标本吸光度值<临界值为阴性
阳性结果:标本吸光度值≥临界值为阳性。
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