CN102807980A - 猪瘟抗体ppa-elisa检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒及制备方法，该试剂盒的制备是采用RT-PCR扩增E2基因包含A、B、C、D共4个中和抗原区在内的550bp基因片段，将扩增的E2基因片段克隆到pMD18-T载体上，鉴定正确后，将目的片段进一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表达载体，转化BL21表达菌，经IPTG诱导表达，获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法分离纯化重组蛋白，免疫印迹检测纯化蛋白的抗原性和特异性。以该重组蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)为二抗，经过间接ELISA反应条件的优化，建立检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA检测方法，并组装猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒。

Description

猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪瘟抗原重组E2蛋白的制备方法及用这种重组蛋白制备猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒的方法。 

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，临床上主要以稽留高热、皮肤和粘膜出现大量出血点为主要特征。猪瘟具有高度传染性，主要通过呼吸道和消化道传染，不分季节，传播速度快，发病率和死亡率高，流行广泛，给养猪业造成了巨大的经济损失，是严重危害我国养猪业的最重要的疫病之一。世界动物卫生组织将其列为A类传染病，我国也将其列为一类传染病。 

猪瘟病毒E2囊膜蛋白参与病毒对细胞的感染过程，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，是CSFV的主要保护性抗原蛋白，可诱导动物机体产生保护性的中和抗体。因此，E2被作为CSFV特异性抗原研究的首选蛋白。 

目前，猪瘟的诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定、血清学方法及分子生物学检测方法。其中，血清学检测方法是检测CSFV血清抗体重要手段之一，在CSFV的早期检测、流行病学调查和监测等方面有着重要的作用，也是免疫猪群抗体水平监测的主要方法。ELISA诊断方法具有敏感性和特异性强、操作简单、检测快速、重复性好、高通量、无辐射、价格低廉等特点，在病毒学、免疫学、血清学、寄生虫学、细菌学等领域得到了广泛的应用，是当前动物传染病检疫、流行病学调查和免疫监测广泛采用的血清学诊断技术。但目前ELISA检测所用的抗原为细胞培养的病毒，猪瘟病毒在细胞培养上浓度低，导致该法生产的猪瘟抗原产量有限，成本较高，难以满足国内猪瘟诊断和免疫检测的需要。 

发明内容

本发明提供一种制备猪瘟抗原重组蛋白的方法，同时提供利用这种猪瘟抗原重组蛋白作为包被抗原研制猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒的方法。 

本发明的猪瘟抗原重组蛋白的制备方法是参照已发表的猪瘟病毒C株基因组序列，利用Oligo6.0和DNAstar生物学软件对E2基因的抗原区进行分析，选取了E2基因的包含A、B、C、D共4个中和抗原区在内的基因片段，设计了一对扩增E2基因片段的引物，并引入酶切位点扩增去掉E2基因的跨膜区及疏水区后550bp的目的基因片段。将扩增的E2基因片段克隆到pMD18-T载体上，鉴定正确后，将目的片段进一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表达载体，转化BL21表达菌。取转化菌培养，用IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后，经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。 

本发明的猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒的制备方法是利用前述重组猪瘟抗原重组蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)为二抗，经过间接ELISA反应条件的优化，建立检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，并组装检测猪瘟抗体的PPA-ELISA试剂盒。通过与正向间接血凝试验盒(IHA)和IDEXXELISA试剂盒的比较对本发明的猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒进行评价。 

本发明的优越性包括以下方面： 

本发明中所用的抗原为基因工程方法表达出的重组抗原，具有很强的特异性，能真实准确地反应猪群中猪瘟的抗体水平。 

本发明中所用的表达载体为PGEX-6p-1高效原核表达载体，该表达载体具有GST标签，易于融合表达后重组蛋白的分离纯化。 

本发明中所用的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，表达性能稳定，且具有成本低廉，操作简单，易于培养，生产周期短等优点。 

本发明中用重组抗原(包含E2蛋白A、B、C、D共4个中和抗原区)作为试剂盒的包被抗原，比已有的用纯化的猪瘟全病毒做为包被抗原，具有易于制备、成分均一的优点，适合于规模化生产制备。 

本发明中试剂盒所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，SPA不仅与猪的血清IgG的Fc段有很强的结合力，同时还能与血清中少量的IgM和IgA结合，使本试剂盒很高的敏感性。 

本发明中试剂盒所用酶标二抗SPA与用辣根过氧化物酶标记IgG作为二抗相比，具有制备容易、性质稳定、易纯化、与抗原结合力强、易于被辣根过氧化物酶标记等优点，有助于提高试剂盒的保存期和利于其规模化组装生产。 

本发明中试剂盒特异性检测针对猪瘟病毒保护性结构蛋白的E2蛋白的抗体，其检测结果对各种猪瘟疫苗免疫效果评价具有重要的参考价值。 

本发明中试剂盒在符合率试验中，与正向间接血凝试验盒(IHA)和IDEXX ELISA试剂盒相比较，使本试剂盒具有极高的准确性和权威性。 

本发明中的试剂盒可局限性的诊断猪瘟野毒感染。出生后超过50日龄，未免疫过猪瘟弱毒疫苗，用本发明中的试剂盒检测出猪瘟抗体阳性可诊断为猪瘟野毒感染。 

本发明的试剂盒具有操作简单，检测快速、成本低廉等特点，适合于大量动物血清的普查，可在实际生产中广泛推广使用。 

附图说明

图1为E2基因PCR扩增产物结果，泳道1为DL2000marker，泳道2为PCR扩增产物，泳道3为阴性对照。 

图2为E2基因与pMD18-T载体连接的PCR及酶切鉴定结果，泳道1为PCR阴性对照，泳道2为pMD18-T-E2PCR扩增产物，泳道3为DL2000marker，泳道4为pMD18-T-E2EcoRI/XhoI双酶切，泳道5为DL15000marker 

图3为E2基因与PGEX-6p-1载体连接的PCR及酶切鉴定结果，泳道1为PCR阴性对照，泳道2为PGEX-E2PCR扩增产物，泳道3为DL2000marker，泳道4为PGEX-E2EcoRI/XhoI双酶切，泳道5为PGEX-6p-1载体双酶切，泳道6为DL15000marker 

图4为E2重组蛋白的SDS-PAGE分析，泳道1为PGEX-E2未诱导菌对照，泳道2为PGEX-6P-1诱导菌对照，泳道3为PGEX-E2诱导菌，泳道4为超生破碎后上清，泳道5为超生破碎后沉淀，泳道6为蛋白marker，泳道7纯化蛋白 

图5为表达产物的免疫印迹分析，泳道1为PGEX-E2重组蛋白与阳性血清反应，泳道2为PGEX-6P-1诱导菌与阳性血清反应 

具体实施方式

1、病毒基因组RNA的提取猪瘟病毒的病毒液200μl，加TRIzol试剂1ml，按TRIzol试剂说明提取病毒基因组RNA。TRIzol购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 

2、反转录合成cDNA以提取的病毒基因组RNA为模板，首先反转录为cDNA。反转录反应按20μl体系操作，取提取的10μl RNA，2.5μl下游引物(5’-CGGAATTCGAAGATTACAGGTATGCGATA-3’)，4μl 5×M-MLV Buffer，0.5μlRibonuclease Inhibitor，2μl 2.5mM dNTP，1μl M-MLV反转录酶，42℃作用50min后，95℃5min灭活反应。M-MLV反转录酶、Ribonuclease Inhibitor、dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司。 

3、PCR扩增以cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系为：0.5μl Ex Taq(5U/μl)、5μl 10×Ex Taq Buffer、4μl dNTP(2.5mmol/L)、1.0μl上游引物 (5’-CGGAATTCGAAGATTACAGGTATGCGATA-3’)、1.0μl下游引物(5’-GGCCCTCGAGTTCCACACATGTCCAAT-3’)、10μl cDNA，加水至50μl。PCR反应条件为：94℃4min；94℃45s，54℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min，4℃终止反应。Ex Taq酶、dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司。 

4、E2基因克隆载体的构建与鉴定PCR产物纯化后与pMD18-T载体于4℃过夜连接，然后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，碱裂解法提取质粒，EcoRI/XhoI双酶切鉴定得到阳性重组质粒pMD 18-T-E2。 

5、E2基因表达载体的构建与鉴定阳性重组质粒pMD18-T-E2用EcoRI/XhoI双酶切，回收目的片段，将其定向克隆到经EcoRI/XhoI双酶切的PGEX-6P-1表达载体中，转化感受态细菌DH5α，碱裂解法提取质粒，EcoRI/XhoI双酶切鉴定得到阳性重组质粒PGEX-E2。 

6、PGEX-E2重组蛋白的表达将鉴定正确的PGEX-E2重组质粒转化表达菌BL21(DE3)感受态细胞，取转化的BL21(DE3)单菌落接种于5ml含卡那霉素的LB中，37℃培养过夜。1％接种于3ml含卡那霉素的LB中培养至OD600值至0.6-0.7，加诱导剂异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为1.0mmol/L。37℃继续培养4h，取1ml菌液，离心收集细菌加入2×SDS-PAGE样品处理液，煮沸5min，取10μl进行SDS-PAGE分析。 

7、PGEX-E2重组蛋白表达形式的鉴定以最佳条件诱导表达后，超声波破碎细胞，12000r/min离心15min，分别收集上清及沉淀进行SDS-PAGE，鉴定目的蛋白是以可溶性形式存在于上清中还是以包涵体形式存在于沉淀中。 

8、PGEX-E2重组蛋白的纯化对以包涵体形式表达的重组蛋白按蛋白质纯化试剂GSTrapTM HP的使用说明书进行纯化。蛋白质纯化试剂GSTrapTM HP购自GE Healthcare公司。 

9、重组蛋白的免疫印迹检测纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE后，转印至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，加CSFV阳性血清(1∶100稀释)37℃作用1h，TBST缓冲液洗3次，加入兔抗猪IgG辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(1∶5000稀释)37℃作用50min，TBST缓冲液洗3次，在二氨基联苯胺(DAB)缓冲溶液中显色10min。 

10、猪瘟抗体的PPA-ELISA检测方法的建立在相同的反应条件下，分别将重组抗原的不同包被浓度与待检样品的不同稀释倍数、不同封闭液与不同封闭时间、二抗不同稀释倍数与不同作用时间组成方阵，经方阵滴定试验分别确定重组抗原最佳包被浓度与待检样品最佳稀释倍数、最佳封闭液与最佳封闭时间、二抗最佳稀释倍数与最佳作用时间，原则是阳性血清OD_450nm≈1.0，阴性血清OD_450nm＜0.2，选取P/N值最大的各个组合。在相同反应条件下，与待检样品分别作用30、60、90、120min，底物分别显色5、10、15、20min，选择阳性血清OD_450nm≈1.0，阴性血清OD_450nm＜0.2，P/N值最大的一抗浓度、底物作用时间。 

11、猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒的组装试剂盒由抗原包被板、阳性对照血清、阴性对照血清、10×SPA酶标抗体、10×样品稀释液、20×浓缩洗涤液、TMB底物溶液、终止液、使用说明书组成。 

12、试剂盒使用方法示例： 

①在A1和A2孔中分别加入100μl阴性对照血清；在A3和A4孔中分别加入100μl阳性对照血清； 

②取100μl经1∶100稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；室温或37℃孵育1h； 

③将各孔的液体弃入废液桶。每孔再加约300μl的洗涤液(试剂盒内20×浓缩洗涤液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释。)进行洗板，重复3～5次，每次2～3min； 

④每孔加入100μl使用样品稀释液1∶10稀释好的酶标抗体；室温或37℃孵育1h； 

⑤重复步骤④； 

⑥每孔加100μl底物溶液； 

⑦室温孵育5min(尽量避开强光照射)； 

⑧每孔加100μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD_450nm值。 

⑨临界值(C.O.)的计算正常情况下，阳性对照孔OD₄₅₀值≥0.4；阴性对照孔OD₄₅₀值≤0.2；临界值＝0.19+阴性对照孔均值；阴性对照孔OD₄₅₀值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔OD₄₅₀值都大于0.2时须重复实验；阴性对照孔低于0.05时以0.05计算。 

⑩结果判定检测样品OD₄₅₀值≥临界值判定该检测样品为阳性；检测样品OD₄₅₀值＜临界值判定该检测样品为阴性。依据农业部猪瘟免疫和监测方案，免疫21天后，猪瘟抗体PPA-ELISA检测试验抗体阳性判定为免疫合格。 

13、交叉反应试验用本发明的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清，结果均无交叉反应，试剂盒具有极高的特异性。 

14、重复性试验用本发明的试剂盒检测8份CSFV抗体水平不同的血清，每份血清样本平行做8个重复，得出批内重复性试验的变异系数为2.00％～4.44％，均小于5％(见表1)。用4个批次的本试剂盒检测8份CSFV抗体水平不同的血清，得出批间重复性试验的变异系数为3.51％～8.36％，均小于10％(见表2)。说明本发明的PPA-ELISA试剂盒具有良好的重复性。 

表1批内重复性试验结果 

表2批间重复性试验结果 

15、符合性试验 用本发明的试剂盒和正向间接血凝试验盒(IHA)同时检测174份血清样品，结果本发明的试剂盒与正向间接血凝试验盒(IHA)的符合率为86.2％(150/174，见表3)。本发明的试剂盒和IDEXX ELISA试剂盒同时检测150份血清样品，结果本发明的试剂盒与IDEXX ELISA试剂盒的符合率为91.3％(137/150，见表4)。说明本试剂盒的符合率良好，可在实际生产中使用。 

16、检测田间血清样品 

应用本发明的猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒检测了来自山东、河南、河北等地的412份血清样本，检出阳性339份，阴性73份，血清抗体阳性率为82.3％。 

表3.本发明的试剂盒(PPA-ELISA试剂盒)与CSFV-IHA试剂盒的检测结果比较 

注：本次试验中，PPA-ELISA检测试剂盒检测样品OD₄₅₀值≥0.35判定该检测样品为阳性，OD₄₅₀值＜0.35判定该检测样品为阴性，CSFV-IHA的检测样品的≥2⁵判定为阳性，＜2⁵判定为阴性；仅有两种检测结果均为阳性的判定样品为阳性(+)，两种试剂盒检测的样品均为阴性判定为阴性(-)；符合率的计算方法为{检测结果相同的阳性样品总数(82)+阴性样品总数(68)}/检测样品总数(174)×100％＝86.2％。 

表4.本发明的试剂盒(PPA-ELISA试剂盒)与IDEXXELISA试剂盒的检测结果比较 

注：本次试验中，PPA-ELISA检测试剂盒检测样品OD₄₅₀值≥0.35判定该检测样品为阳性，OD₄₅₀值＜0.35判定该检测样品为阴性，IDEXX-ELISA试剂盒的检测样品的抗体阻断率≥40％(0.4)判定为阳性，≤30％(0.3)判定为阴性；仅有两种检测结果均为阳性的判定样品为阳性(+)，两种试剂盒检测的样品均为阴性判定为阴性(-)；符合率的计算方法为{检测结果相同的阳性样品总数(82)+阴性样品总数(55)}/检测样品总数(150)×100％＝91.3％。 

Claims (10)

1.一对用于扩增猪瘟病毒(CSFV)部分E2基因的特异性引物，其特征在于所述引物的序列为：

CSFV上游引物：5’-CGGAATTCGAAGATTACAGGTA TGCGATA-3’

CSFV下游引物：5’-GGCCCTCGAGTTCCACACATGTCCAAT-3’

扩增目的片段大小为550bp。

2.一种用于猪瘟抗体ELISA检测试剂盒包被抗原的制备方法，其特征是用权利要求1所述引物从猪瘟病毒(CSFV)E2基因中扩增包含A、B、C、D共4个中和抗原区：

A中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-SVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPFDTSPVVK

GKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTTIVENEDL-3’；B中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-RLACKEDYRYAIS STDEIGLLGAGGLTTT

WKEYNHDLQLNDGTVKAS CVAGSFK VTALNVVSRRYLASLHKKALPT SVTFELLF-3’；C中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-RLACKEDYRYAIS STDEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDL

QLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPFDTSPVV-3’；D中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-SVTFELLFDGTNPSTEEMGD

DFRSGLCPFDTSPVV-3’在内的550bp基因片段，将扩增的E2基因片段克隆到pMD18-T载体上，鉴定正确后，将目的片段进一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表达载体，转化BL21表达菌，经IPTG诱导表达，采用亲和层析法从表达产物中分离纯化重组蛋白，免疫印迹检测纯化蛋白的抗原性和特异性。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为PGEX-6p-1高效原核表达载体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯化方法采用亲和层析法。

6.一种猪瘟抗体PPA-ELISA检测方法，其特征是以权利要求2-6中任一项的纯化重组蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)为二抗，经过间接ELISA反应条件的优化，建立检测猪瘟抗体的间接ELISA方法。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所用的包被抗原采用权利要求2所述的制备方法制备。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所用的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，并用其对各种猪瘟病毒E2蛋白(A、B、C、D共4个中和抗原区)产生的抗体进行特异性检测。

9.一种猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中要有：抗原包被板、阳性对照血清、阴性对照血清、10×SPA酶标抗体、10×样品稀释液、20×浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、使用说明书。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，用正向间接血凝试验盒(IHA)和IDEXX ELISA试剂盒进行符合率试验。

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