CN105218648A - 结核杆菌抗原、核酸序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及12个结核杆菌抗原多肽，与多肽序列具有至少90％相同的抗原表位多肽；抗原多肽或抗原表位多肽，搭配免疫佐剂制成结核杆菌疫苗；利用抗原多肽或抗原表位多肽作为抗原，制备单克隆抗体，来检测样品中是否含有结核杆菌；编码12个结核杆菌抗原多肽的核酸序列，与核酸序列具有至少90％相同的多核苷酸；制备包含核酸或多核苷酸的基因疫苗。本发明的有益效果是：这些多肽可以用于重组疫苗的多肽，或者用于抗原诊断试剂合的开发，以利于肺结核的检测和诊断。

Description

结核杆菌抗原、核酸序列及其应用
技术领域
本发明涉及一种结核杆菌抗原、核酸序列及其应用。
背景技术
结核杆菌是结核病的病原体是一种慢性传染病杀害，每年约有300万人。据估计两个十亿人感染结核分枝杆菌世界范围内，其中包括750万结核病病例活跃。在最近几年出现了一个意想不到的上升结核病例。
在中国，结核病感染者3.3亿，结核病人600万，每年因结核病死亡的病人高达25万，为各类传染病死亡的总和的两倍。因此我国已将结核病由丙类传染病升为乙类传染病，列入严格管理范畴。如何快速尽早地诊断并治疗成为控制结核病扩散和传播的关键环节。
目前，肺结核的诊断除了一般胸部X光检查外，主要是靠取痰液检查，包括抗酸杆菌痰涂片染色镜检与结核杆菌培养，结核杆菌的细菌学检查是确诊肺结核的重要依据。抗酸杆菌涂片检查敏感性低，特异性差。结核杆菌培养通常是将待检标本接种至改良的罗氏培养基，需要三至八周的时间才可以得到结果，耗费时间长，经常延误治疗的时机而且敏感性差。
这说明市场需要快速且准确的检测和诊断结核的方法。微生物的检测法中，检测抗原通常是敏感有效且快速的方法。
目前，肺结核的诊断除了一般胸部X光检查外，主要是靠取痰液检查，包括抗酸杆菌痰涂片染色镜检与结核杆菌培养，结核杆菌的细菌学检查是确诊肺结核的重要依据。抗酸杆菌涂片检查敏感性低，特异性差。结核杆菌培养通常是将待检标本接种至改良的罗氏培养基，需要三至八周的时间才可以得到结果，耗费时间长，经常延误治疗的时机而且敏感性差。
另外，结核病没有有效的疫苗。唯一可用的疫苗为卡介苗，保护效果不可预测，也不稳定。数以百万计的儿童和新生儿已接种过卡介苗，但是这并没有停止了疾病的传播。无论在工业化国家和发展中国家，结核病已在成为传播速度最快的传染病。卡介苗值得怀疑的效果促使了其他种类的疫苗的开发。
传统疫苗技术经常会产生不同程度的免疫原性在不同宿主中的问题。近年来利用特异性抗原的重组疫苗被广泛接受。这种重组疫苗的方法需要鉴定有免役原性的抗原多肽。
本专利包括12个有抗原活性的多肽。这些多肽可以用于重组疫苗的多肽，或者用于抗原诊断试剂合的开发。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：基于上述问题，本发明提供一种结核杆菌抗原、核酸序列及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是：采用体外无细胞蛋白质合成系统高通量表达结核分支杆菌的蛋白质，并结合健康和结核患者血清筛选获得12个可以用于结核分枝杆菌检测、疫苗激发的结核杆菌抗原多肽，多肽序列为SEQIDNO:1～12。得到与任一项或多项多肽序列具有至少90％相同的抗原表位多肽。
抗原多肽或抗原表位多肽，搭配免疫佐剂制成结核杆菌疫苗。
利用抗原多肽或抗原表位多肽作为抗原，制备单克隆抗体，来检测样品中是否含有结核杆菌。
编码12个结核杆菌抗原多肽的核酸序列分别为SEQIDNO:13～24。得到与任一项或多项核酸序列具有至少90％相同的多核苷酸。
制备包含核酸或多核苷酸的基因疫苗。
本发明的有益效果是：包括12个有抗原活性的多肽及编码其的核酸，这些多肽可以用于重组疫苗的多肽，或者用于抗原诊断试剂合的开发，以利于肺结核的检测和诊断。
具体实施方式
现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
一、结核分枝杆菌诊断特异性抗原的分离
(1)检索结核杆菌多肽库，确定在人类发生体液免疫的3200个抗原靶。
(2)采用无细胞蛋白质表达系统表达结核分枝杆菌全多肽库；
(3)采用磁珠法分离表达的结核分枝杆菌多肽，对上述蛋白质进行聚丙烯酰胺电泳和蛋白质印迹转膜；然后分别用健康供体、结核病患者和非结核性分枝杆菌(NTM)患者的血清孵育1h；之后加入碱性磷酸酶缀合的二抗，以筛选可以和结核患者血清发生反应的抗原。结果显示在评价的3200个蛋白中，72个与来自结核病患者混合血清培养阳性。
(4)其中53个与来自健康捐赠者的血清培养阳性。其余19中，有7个与非结核性分枝杆菌(NTM)的患者的血清培养阳性，最后12个代表了特异的结核病抗原(如SEQIDNO:1～12所示)。
SEQIDNO:1
SEQIDNO:2
SEQIDNO:3
1MDFVIQWSCYLLAFLGGSAVAWVVVTLSIKRASRDEGAAEAPSAAETGAQ
SEQIDNO:4
SEQIDNO:5
SEQIDNO:6
SEQIDNO:7
SEQIDNO:8
SEQIDNO:9
SEQIDNO:10
SEQIDNO:11
SEQIDNO:12
12个结核分枝杆菌特异性抗原的核酸序列如SEQIDNO:13～24所示.
SEQIDNO:13
SEQIDNO:14
SEQIDNO:15
SEQIDNO:16
SEQIDNO:17
SEQIDNO:18
SEQIDNO:19
SEQIDNO:20
SEQIDNO:21
SEQIDNO:22
SEQIDNO:23
SEQIDNO:24
二、结核分枝杆菌的重组多肽疫苗的构建
(1)结核分枝杆菌Rv0497(SEQIDNO:13)的真核表达和鉴定
PCR扩增获得Rv0497基因，经筛选和测序鉴定正确后，克隆到pPICZaA表达载体，构建了重组质粒pPICZaA-Rv0497，将其转入毕赤酵母菌GS115。重组菌经甲醇诱导，采用亲和层析的方法纯化酵母培养液上清，SDS-PAGE检测目的蛋白被成功分泌表达。
(2)用Rv0497多肽，搭配弗氏完全佐剂制成多肽疫苗。
(3)采用多肽疫苗免疫小鼠，检测小鼠血清中抗体的生成量和T淋巴细胞响应能力。
为了显示由Rv0497多肽疫苗诱导的免疫反应以及验证其抗肺结核的保护效力，选用经典的结核分枝杆菌感染动物模型对其免疫反应过程和防御结果进行评价。C57Bl/6小鼠是近交系小鼠中对结核分枝杆菌最敏感的动物。对C57Bl/6小鼠老鼠皮下分别接种：1)生理盐水；(2)Rv0497多肽疫苗；10周后，从每一组老鼠取6只老鼠用于免疫效果评价，其余6只接种结核分枝杆菌；尾静脉取血，并和相关抗原进行凝集实验，结果显示免疫组小鼠血清中具有和Rv0497多肽进行反应的抗体。
为检测Rv0497多肽疫苗诱导的细胞免疫反应，摘取对照组和免疫组小鼠脾脏分离T细胞，检测γ干扰素释放结果，结果显示免疫组老鼠T细胞具有更强的响应能力。
(4)给小鼠接种结核杆菌，观察疫苗的抗感染能力，结果显示可以抑制结核杆菌的感染。
对C57Bl/6小鼠老鼠皮下分别接种：1)生理盐水；(2)Rv0497多肽疫苗；10周后，接种结核分枝杆菌；1周后无菌取肺，进行匀浆处理后接种于7H10琼脂平板，对其活菌数进行计数，结果显示免疫组小鼠肺部结核分枝杆菌数量大幅度降低。
三、运用基于上述特异性抗原的抗体诊断结核分枝杆菌
用Rv0497蛋白质免疫小鼠四周，分离脾脏T淋巴细胞进行杂交瘤细胞的制备；
分离单克隆抗体；
采用胶体金标记单克隆单体，制成检测结核病的生物标记物，用于检测患者血液、痰、尿液或其它生物流体中结核杆菌的存在和浓度，结果显示其检测下限可以达到500cfu。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (7)

1.一种结核杆菌抗原，其特征是：包含SEQIDNO:1～12中任一项或多项多肽序列。
2.一种抗原表位多肽，其特征是：包含与权利要求1中任一项或多项多肽序列具有至少90％相同序列。
3.一种核酸，其特征是：包含编码权利要求1所述的结核杆菌抗原的核苷酸序列，SEQIDNO:1～12多肽的核苷酸序列分别为SEQIDNO:13～24。
4.一种多核苷酸，其特征是：包含与权利要求3中任一项或多项核苷酸序列具有至少90％相同序列。
5.一种结核杆菌疫苗，其特征是：采用权利要求1或2所述的多肽或抗原表位多肽，搭配免疫佐剂制成结核杆菌疫苗。
6.一种基因疫苗，其特征是：包含权利要求3或4所述的核酸或多核苷酸。
7.一种结核杆菌的检测方法，其特征是：利用权利要求1或2中所述的多肽或抗原表位多肽作为抗原，制备单克隆抗体，来检测样品中是否含有结核杆菌。
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