CN101914563A - 一种结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结核分枝杆菌38Kd-11Kd-CFP10重组融合蛋白及其应用。本发明提供了一种结核分枝杆菌38Kd-11Kd-CFP10重组融合蛋白，还提供了该重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片中的应用。采用本发明提供的结核分枝杆菌38Kd-11Kd-CFP10重组融合蛋白制备的结核分枝杆菌诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了结核(TB)感染临床诊断的需要。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种结核分枝杆菌重组融合蛋白及其应用。
背景技术
结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)感染所致的人类疾病，是分支杆菌病的主要类型，主要通过呼吸道传播。自1882年德国科学家Rrobert Koch发现TB以来，全球约有两亿人死于TB，且疫情发展日趋严重。据WHO预计，全球现有TB病人2000万，如不控制今后10年还将有9000万人发病。我国现有3.3亿结核菌感染者，肺结核病人600多万，其中有严重传染性的病人150万，每年死于结核病的达25万人。因此，结核病的预防、早期诊断和及时治疗是高度关注的课题。MTB有H37Rv与H37Ra两种标准菌株，前者为毒力株而后者为减毒突变株，它们均来源于1934年的人肺H37分离株。与一些临床分离株不同的是，H37Rv对药物敏感、利于基因工程操作并在TB动物模型中保留了完整毒力，因而该菌株被广泛应用于TB相关的生物医药研究(MTb H37Rv project at Sanger Institute，NCBI)。目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查(AFP)和培养法，以及分子生物学和血清学检查，这些方法多基于高特异性的抗原建立。
本发明提供了一种用基因工程方法生产的结核重组融合蛋白作为抗原，与常用抗原相比特异性更强，用其作为抗原制备的免疫诊断试剂盒，可为结核病感染的检测提供更为特异、准确的工具。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组融合蛋白，并提供该结核分枝杆菌重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒、蛋白芯片和疫苗中的应用。
(二)技术方案
本发明提供了一种编码结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白，该重组融合蛋白由所述融合基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供了一种结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的表达载体，该表达载体是将所述融合基因插入到质粒pET-28b上得到的重组质粒pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其质粒图谱如附图1所示。
本发明又提供了一种表达结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的工程菌株，该工程菌株含有表达载体pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。
本发明还提供了一种结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测试剂盒，它包括前述的38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白和酶标二抗。所述38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的包被量为2.0μg/孔，酶标二抗工作浓度为4.0mg/mL。
本发明提供了一种结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒，它包括TB抗原、胶体金标记TB抗原和质控线包被兔抗TB抗体，其中所述TB抗原和胶体金标记TB抗原均是由前述的结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白制得。
本发明所述的结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒，TB抗原喷点浓度为0.25-2.0mg/mL，胶体金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值50.0-100.0，TB抗原喷点量为0.5-1.75μL/cm，胶体金标记TB抗原喷点量为0.5-1.75μL/cm，质控线包被兔抗TB抗体包被浓度为0.5-2.0mg/mL，反应膜封闭时间为45-75分钟，反应膜干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥30-75分钟，胶体金标记TB抗原垫干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥3-5小时，标本检测反应时间为15℃～30℃下反应10-30分钟，温度低于15℃时标本检测反应时间为40-50分钟。
优选地，TB抗原喷点浓度为1.0mg/mL，胶体金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值80.0，TB抗原喷点量为1.0μL/cm，胶体金标记TB抗原喷点量为1.0μL/cm，质控线包被兔抗TB抗体包被浓度为1.0mg/mL，反应膜封闭时间为60分钟，反应膜干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥60分钟，胶体金标记TB抗原垫干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥4小时，标本检测反应时间为15℃～30℃下反应25-30分钟。
本发明还公开了所述的结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片和疫苗研制中的应用。
(三)有益效果
采用本发明提供的结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了TB感染临床诊断的需要。
附图说明
图1是表达载体pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10的构建流程图；
图2是表达载体pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10酶切产物电泳图，其中1表示DNA Marker，2、3、4分别表示酶切后的三个阳性菌，5表示酶切前的重组质粒；
图3是结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白纯化电泳图，其中1表示细胞裂解后的上清，2表示细胞裂解后的沉淀，3表示纯化的TB蛋白；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的制备
1.1基因融合
通过计算机分析TB H37Rv基因组全序列，选择其强抗原表位38kDa蛋白(GENEBANK locus：YP_177770)、16kDa(GENEBANK locus：NP_214765)和CFP10(GENEBANK locus：BX842584)的DNA序列为模板，设计扩增引物为：
38kD扩增引物：
38-16-CFa：atcgCATATGtgtggctcgaaaccaccgagc 54.8％Tm：79.6
38-16-CFb：GATTGTTCATACCACCACCACCGCTGGAAATCGTCGCGATC GC 55.8％ Tm：86
16kD扩增引物：
38-16-CFc：ggtggtggtggtATGAACAATCTCGCATTG 50％ Tm：76
38-16-CFd：TCCGCAATCACCACCACCACCCTACTTCGTATGGCGATGCG 58.5％ Tm：89
CFP10扩增引物：
38-16-CFe：ggtggtggtggtATGGCAGAGATGAAGACCGATG 50％Tm：61.4
38-16-CFf：atcgCTCGAGTCAGAAGCCCATTTGCGAGG 55％Tm：64.3
50mL扩增体系：ddH2O 31.5mL，10×buffer 5.0mL，4×dNTP 4.0mL，上、下游引物混液4.0mL，DNA 1.5mL，Taqplus 0.2mL(1U)。
取结核分支杆菌H37RV的菌体，加100mL蛋白酶K(10mg/mL)，置56℃水浴消化4小时，用常规酚/氯仿法纯化，用上述引物进行PCR扩增。其中，38Kd上游引物和CFP10下游引物分别增加了Nde I和Xho I酶切位点。
将克隆片段进行修饰，产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后切割，将含DNA条带的胶块按DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARA MiniBEST Plasmid purification)说明回收DNA。然后再以38kDa、16kDa和CFP10基因片段为模板用连接PCR扩增38kDa、16kDa和CFP10融合基因，中间以4个Gly(ggtggtggtggt)连接。
质粒DNA和38Kd-16Kd-CFP10均经内切酶切，50mL体系：10 x buffer5.0mL，DNA 12mL，Xho I和Nde I各15U，ddH2O补至50mL；37℃水浴6h。50mL酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切割DNA条带琼脂块，并按DNA快速纯化试剂盒说明回收DNA。
将融合基因片段克隆至pET-28b质粒(具有Xho I和Nde I酶切位点，购自华美生物公司)，20mL连接体系：ddH2O15.0mL，10 x buffer 2.0mL，PET-28b 2.0mL，Pab 1.0mL，T4DNA连接酶20U。质粒自身连接对照，20mL连接反应体系：ddH2O 16.0mL，10 x buffer 2.0mL，PET-28b 2.0mL，T4DNA连接酶20U。按上述加样后，混匀、稍离心，14℃-16℃连接过夜。转化E.coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固体培养基)并挑克隆提质粒测序，确定序列正确的克隆。重组质粒的酶切(NdeI/XhoI)电泳图如附图2所示。
1.2产物测序
测序引物为：S38-16-CF(TCAACAACCGCAAAAGGACGC)及T7promoter和T7 terminator的通用引物。所有扩增引物和测序引物的合成以及重组质粒序列pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10的测定都由华大基因公司提供服务。测得目的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
1.3目的蛋白的表达、纯化
将验证正确克隆的重组质粒(pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10)，转化大肠杆菌BL21(DE3，购自华美生物公司)宿主菌，目的蛋白在包含体内进行表达：将含有38K-16K-CFP10基因的BL21(DE3)宿主菌培养到OD 0.6，用终浓度1mM IPTG诱导表达，4小时之后收集菌体、超声破碎、高速离心、收集沉淀。对收集的沉淀用Ni柱(Pharmcia公司chelating sephrose fast flow)进行纯化，用如下溶液洗脱：300mM咪唑，20mM Tris，500Mm NaCl，8M Urea。38kDa、16kDa和CFP10融合基因表达蛋白共614个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
1.4融合蛋白检定
1.4.1纯度和分子量的测定：经SDS-PAGE电泳检测(蛋白上样量10μg)，为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95.4％。分子量约为78.6kD，检测结果见附图3。
1.4.2浓度测定：经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为3.5±0.12mg/mL。
1.4.3活性测定：用间接ELISA方法测定。包被量2.0μg/孔，使用内部质控血清测定OD值，结果见表1。
表1抗原活性测定结果
抗原抗体反应：采用蛋白印记技术(Western Blot)，以抗人结核IgG抗体阳性人血清测试TB融合抗原，可见阳性反应，SDS-PAGE并证实抗原的分子量为78.6KD。结果见附图3。
1.4.4融合蛋白稳定性测定：
蛋白质浓度的稳定性测定，分三次测定保存的结核抗原溶液的蛋白质浓度的稳定性，结果见表2.
表2结核蛋白的浓度测定
测试结果显示，-85℃保存的结核抗原溶液的蛋白质浓度非常稳定。
结核抗原活性的稳定性测定，分三次喷点-85℃保存的结核抗原并制成胶体金试剂盒，以企业质控参比品进行测定结果见表3.
表3结核抗体企业质控参比品的考核结果
测定结果显示，-85℃保存的结核抗原的免疫活性稳定。
注：本发明所用样本由全军结核病研究所提供。由临床细菌学检查及临床X线等临床确诊的结核病患者血清结核抗体IgG阳性的感染者及阴性血清、血浆制成。30支样品，其中15支抗人结核抗体IgG阴性参考品(N)；15支抗人结核抗体IgG阳性参考品(P)。
实施例2酶联免疫法(ELISA)检测结核分枝杆菌抗体IgG的建立
采用间接ELISA方法检测结核分枝杆菌抗体IgG，可用于TB抗原活性的检定和TB感染的辅助诊断。
根据测试结果，在38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的包被量为2.0μg/孔，酶标二抗使用浓度为4mg/ml时，检测结果最佳，故以38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的包被量为2.0μg/孔，酶标二抗工作浓度为4mg/ml，建立结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测试剂盒。
实施例3结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒(胶体金法)的制备及性能检定
2.1试剂盒组成及制备
本发明试剂盒以纯化的结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白制得的TB抗原和胶体金标记TB抗原作为抗原，采用双抗原夹心法。使用时加入待检血清，如样品中含有抗TB特异性抗体，则先与胶体金标记TB抗原结合，前行再与膜表面的相应TB抗原结合形成复合物而呈现紫红颜色。如样品中无抗TB特异性抗体，则只有质控线颜色，其颜色强度直接与样品中存在的抗TB特异性抗体IgG的量呈正比。
试剂盒主要组成成分为测试板，包括加样区、胶体金标记TB抗原包被膜区、TB抗原包被检测区、质控区和吸水垫区。
2.1.1质控线包被兔抗TB抗体：(购自北京赛蒂克生物技术公司，蛋白浓度为4.0±0.15mg/mL，免疫琼脂双扩散效价≥1∶16)。
2.1.2胶体金标记TB抗原：胶体金直径30nm胶体金颗粒，原液光密度OD不小于10.0。
2.1.3条件优化
2.1.3.1TB抗原和胶体金标记TB抗原包被浓度的确定：采用方阵滴定选择最佳TB抗原包被浓度和相应的胶体金标记TB抗原工作浓度，见下表4。
表4最佳抗原和相应的金标记抗原工作浓度的选择
注：以阳性和阴性血清质控参比品为测试样品，阴性参考品出现任何一份阳性即判断出现假阳性结果，在表中即以“+/”表示；阳性参考品出现任何一份阴性即判定出现假阴性结果，在表中即以“-/”表示。
根据测试结果，在TB抗原喷点量为1.0μL/cm和胶体金标记TB抗原喷点量为1.0μL/cm的条件下，选定最佳TB抗原喷点浓度为1.0mg/mL，胶体金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值80.0。
2.1.3.2最佳TB抗原喷点量的确定：在已确定最佳TB抗原喷点浓度为1.0mg/mL和最佳胶体金标记TB抗原喷点浓度为OD值80.0的基础上，采用方阵滴定选择最佳TB抗原喷点量(见表5)
表5最佳抗原喷点量的确定
根据测试结果，选定最佳TB抗原喷点量为1.0μL/cm.
2.1.3.3最佳胶体金标记TB抗原喷点量的确定；在已确定最佳TB抗原喷点浓度为1.0mg/mL，喷点量为1.0μL/cm和最佳胶体金标记TB抗原喷点浓度为OD值80.0的基础上，采用方阵滴定选择最佳胶体金标记TB抗原喷点量(见表6)。
表6最佳胶体金标记TB抗原喷点量的确定
根据测试结果，选定最佳胶体金标记TB抗原喷点量为1.0μL/cm。
2.1.3.4质控线包被兔抗TB抗体包被浓度的选择
抗TB抗体包被量为1μL/cm。质控线包被兔抗TB包被浓度选择的实验结果见表7。
表7质控线包被兔抗TB包被浓度的选择
-：未出现对照线；+：对照线清晰；+++：对照线线清晰粗大。
表7显示，兔抗TB抗体与本试验中所用胶体金标记TB抗原有较好的反应性。1.0mg/mL浓度的抗TB包被基本上能够较好地显示对照效果，继续提高抗体浓度未能明显提高反应强度。因而选择1.0mg/mL抗TB的浓度作为质控线包被兔抗TB抗原的浓度。
2.1.3.5反应膜封闭时间的选择
硝酸纤维素膜包被TB抗原和抗TB抗体后，经封闭液封闭可以有效地降低非特异性反应。对反应膜封闭时间的选择实验结果见表8。
表8反应膜封闭时间(37℃)的选择实验结果
| 反应时间 | 15分 | 30分 | 45分 | 60分 | 75分 |
| 阴性血清 | × | × | - | - | - |
| 阳性血清 | × | + | ++ | ++ | ++ |
-：阴性反应；±：可疑阳性；++阳性反应；×：反应膜背景模糊表8表明，封闭时间不同对正确反映实验结果有一定的影响。封闭时间过短会造成反应膜背景模糊，影响结果判读。本实验的结果表明封闭45分钟-75分钟，封闭效果较好，有助于提高实验结果的准确性。选择封闭60分钟为生产控制条件。
2.1.3.6反应膜干燥条件的选择
表9反应膜干燥条件选择的实验结果
反应膜适宜的干燥条件不仅与试剂的灵敏度有关，而且与试剂的稳定性关系更为密切。表9的结果表明，在相对湿度为20％环境下，干燥时间短则试剂的稳定性差，干燥时间长则影响反应结果的准确性。在相对湿度为25％、30％的环境下干燥时间为45分钟、60分钟、75分钟时，反应结果比较接近，都有较好的敏感度和稳定性。考虑到在生产过程中的可控性，采用相对湿度25％-30％、干燥60分钟的条件为生产中的干燥条件。
2.1.3.7金标记抗原垫干燥时间的选择
表10胶体金标记TB抗原垫干燥时间选择的实验结果
胶体金标记TB抗原垫干燥在37℃条件下。表10显示，干燥环境相对湿度过低可能影响反应强度。在比较适宜的干燥环境下，干燥时间3小时、4小时、5小时干燥效果比较接近，试剂的反应敏感性及稳定性均较好。故选用相对湿度25％-30％、干燥4小时为生产控制条件。
2.1.3.8标本检测反应时间的选择
表11标本检测反应时间的选择实验结果(A)
表12标本检测反应时间的选择实验结果(B)
表11和表12表明，在通常室温条件下(15℃～30℃)，抗TB阳性或强阳性反应血清在反应后5-10分钟即可出现明确的阳性反应结果。抗TB弱阳性反应血清在常温下反应时，需要较长的反应时间，在反应25-30分钟时可获得明确的阳性反应结果。抗TB阴性血清在通常室温条件下(15℃～30℃)，反应在30分钟内，基本能正确反映测定血清性质。反应时间过长有可能造成假阳性。因此，将结果判定时间确定在反应25-30分钟时判定反应结果。考虑到特殊情况下，可能实际工作的室温低于15℃，影响反应结果，采取延长10分钟反应时间的措施，也可获得比较满意的结果。
2.1.4试剂盒的制造
1)检测板的包被：NC膜的预切割、粘贴，将TB抗原以pH7.2、0.02mol/LPBS缓冲液稀释至1.0mg/mL，质控线包被兔抗TB抗体以pH7.2、0.02mol/LPBS缓冲液稀释至1.0mg/mL，分别以优化条件喷点于NC膜上，干燥、封闭、干燥；
封闭液配方：0.02mol/L PBS缓冲液(pH7.2，含0.25％脱脂奶粉)。
2)胶体金标记TB抗原的粘贴：以0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)配制胶体金标记TB抗原溶液，包被于玻璃纤维模上，干燥后粘贴于包被好的检测板；
3)组装：检测板切割成测试条，装配、密封包装。
2.1.5检测方法及结果分析
1)取出测试板，置于一平面操作台上，平衡至室温。
2)加样：微量加样器于加样孔加入未稀释的待测血清100μl。
3)15-20分钟内观察并记录结果。强阳性结果可在5分钟出现，弱阳性和阴性结果需等待20分钟观察。阳性：判读窗口(C和T位置)出现两条紫红色线条；阴性：判读窗口仅出现一条紫红色线条(C位置)；无效：判读窗口无紫红色线条。
2.2试剂盒性能评价
2.2.1对30份TB参考品的检测结果
应用本发明制备的试剂盒，对TB抗体参考品进行了检测，检测结果见表13。
表13对30份TB抗体参考品检测结果
-：阴性反应；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++：强阳性反应。
从试验的结果可以看出，阴性、阳性符合率均达100％。因此我们认为采用这一检测系统是可行的。
2.2.2对HBV、HCV、HAV和梅毒等抗体阳性血清的交叉反应测试
采用本发明试剂盒对HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)、HAV(甲型肝炎)、癌症和非结核病呼吸系统患者血清的交叉反应，以进一步评价其特异性，对上述确认患者血样进行了测试，结果见下表。
表14HBV、HCV、HAV和梅毒等抗体阳性血清的交叉反应测试结果
结果显示该试剂盒与上述患者血样无交叉反应发生。
2.2.3对梅毒(RF)阳性血清、血脂、胆红素和血红蛋白等干扰物的交叉反应检测
表15对梅毒(RF)阳性血清、血脂、胆红素和血红蛋白等干扰物的测试结果
结果显示该试剂盒与RF阳性血清、血脂、胆红素和血红蛋白等干扰物的交叉反应未超过正常人血清样品的假阳性率。
2.2.4与国外同类产品比较等试验资料
以本发明试剂盒与北京现代高达生物技术有限责任公司生产的新一代结核抗体快速诊断试剂盒作比较。对200份阳性血清和230阴性血清进行了比较检测，结果见下表
表16与现代高达结核抗体试剂盒的比较测试结果
真实性和预示值计算分析：
表17真实性和预示值计算分析
| 计算方法 | 计算结果 |
| 灵敏度＝A/(A+C)*100％ | 181/(181+19)＝90.5％ |
| 特异度＝D/(B+D)*100％ | 227/(3+227)＝98.7％ |
| 假阳性率＝B/B+D)*100％ | 3/(3+227)＝1.3％ |
| 假阴性率＝C/B+D)*100％ | 19/(3+227)＝8.3％ |
| 粗-致＝(A+D)/(A+B+C+D)*100％ | (181+227)/(181+3+19+227)＝94.9％ |
| 阳性试验的预示值＝A/(A+B)*100％ | 181/(181+3)＝97.8％ |
| 阴性试验的预示值＝D/(C+D)*100％ | 227/(19+227)＝92.3％ |
本发明试剂盒与参比品北京现代高达生物技术有限责任公司结核抗体试剂盒的检测符合率为94.9％。
2.2.5临床考核
沈阳市胸科医院，安徽省肺科医院和解放军三零九医院三家的临床考核结果如下：
表18结核抗体IgG检测结果
经沈阳市胸科医院，安徽省肺科医院和解放军三零九医院三家的临床考核结果，本发明试剂盒(胶体金法)已经达到国家规定的质量要求，并与国内外同类产品无统计学意义上的质量差异。
Claims (10)
1.一种编码结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的融合基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白，其特征在于：它由权利要求1所述的融合基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的表达载体，其特征在于：它是将权利要求1所述的融合基因按照如图1所示的构建方式插入到质粒pET-28b上得到的重组质粒pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10。
4.一种表达结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的工程菌株，其特征在于：它含有权利要求3所述的表达载体pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。
5.一种结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：它包括权利要求2所述的38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白和酶标二抗。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白的包被量为2.0μg/孔，酶标二抗工作浓度为4.0mg/mL。
7.一种结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒，它包括TB抗原、胶体金标记TB抗原和质控线包被兔抗TB抗体，其特征在于：所述TB抗原和胶体金标记TB抗原均是由根据权利要求2所述的38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白制得。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：TB抗原喷点浓度为0.25-2.0mg/mL，胶体金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值50.0-100.0，TB抗原喷点量为0.5-1.75μL/cm，胶体金标记TB抗原喷点量为0.5-1.75μL/cm，质控线包被兔抗TB抗体包被浓度为0.5-2.0mg/mL，反应膜封闭时间为45-75分钟，反应膜干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥30-75分钟，胶体金标记TB抗原垫干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥3-5小时，标本检测反应时间为15℃～30℃下反应10-30分钟，温度低于15℃时标本检测反应时间40-50分钟。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：TB抗原喷点浓度为1.0mg/mL，胶体金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值80.0，TB抗原喷点量为1.0μL/cm，胶体金标记TB抗原喷点量为1.0μL/cm，质控线包被兔抗TB抗体包被浓度为1.0mg/mL，反应膜封闭时间为60分钟，反应膜干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥60分钟，胶体金标记TB抗原垫干燥条件为相对湿度25％-30％下干燥4小时，标本检测反应时间为15℃～30℃下反应25-30分钟。
10.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌38Kd-16Kd-CFP10重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒、蛋白芯片和疫苗中的应用。
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