CN114736290B - 一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、制备方法和应用 - Google Patents

一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的优选抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV‑BC21，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。通过对比试验证明在PRV检测中纳米抗体PRV‑BC21比商品化的单克隆抗体更灵敏，纳米抗体PRV‑BC21与胶体金标记技术相结合，灵敏度高，检测PRV的检测限可达到1ng/mL。特异性强，交叉反应少。首次开发的胶体金试纸条实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了对PRV快速检测的初步应用。

Description

一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猪伪狂犬病毒(PorcinePseudoraibies Virus，PRV)的特异性检测方法，其活性单元为靶向猪伪狂犬病毒(PorcinePseudoraibies Virus，PRV)gB和gC蛋白的纳米抗体、制备方法和应用。
背景技术
猪伪狂犬病(Porcine Pseudoraibies，PR)是猪的一种急性传染病，又称Aujeszky病，由猪伪狂犬病毒(Porcine Pseudoraibies Virus，PRV)引起。猪作为PRV的天然宿主，对病毒感染更为敏感，是可在急性感染中存活并具有潜伏感染力的唯一动物物种。感染后新生仔猪以高死亡率与神经系统紊乱为特征，怀孕母猪出现流产与繁殖障碍，老年猪以呼吸道疾病为主，以神经症状为特征的仔猪死亡率大于20％，猪感染野生型病毒的几率高达50％，使我国养猪业损失巨大。
PRV属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，α-疱疹病毒亚科(Alpha Herpesvirinae)的成员，基因组为线性双链DNA，大小约150kb。PRV目前已知的只有一种血清型，PRV共编码70多种蛋白，主要蛋白除gG蛋白外，其余10个(gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK、gL、gM、gN)均为囊膜结构蛋白。gB、gH、gL和gM蛋白在疱疹病毒科中比较保守，而且gB、gH和gL对所有疱疹病毒在细胞培养物中的复制都是必需的。gB蛋白能够诱导中和抗体的产生，与免疫保护相关。gE蛋白最早被称为gI蛋白。1960年筛选制备的PRV疫苗株如Bartha株及BUK株等均存在gE基因缺失。20世纪80年代中期，通过DNA重组技术构建了gE基因缺失的PRV突变株；在此基础上，将TK基因进行缺失使PRV病毒得到进一步弱化。许多gE基因缺失疫苗均能够预防攻毒感染或减轻攻毒感染所造成的临床症状，在许多国家允许猪群使用gE基因缺失疫苗。
从敏感性与特异性上来说，病毒的分离与鉴定是检测PRV的黄金标准，但该分耗时长(至少2-3天)，且灵敏度较低，且需要较高的细胞培养水平，病毒培养过程也易出现细节性操作失误而最终影响诊断结果，因此很难在基层兽医单位得到推广。病毒中和试验(VNT)为PRV检测中常用的方法之一，此方法高效且敏感。但是，在感染的急性阶段此方法敏感性低，而且容易使结果呈现假阴性。间接夹心ELISA等免疫学诊断方法虽然具有很高的灵敏性和很强的特异性，但需要较多纯度的蛋白，且需要精细操作且易出现假阳性，尤其依赖敏感性和特异性高的检测抗体，可以说检测抗体的性质就直接决定了检测的准确性和精度。而且上述这些方法虽然可以检测PRV病毒，在实践中也取得一定的效果，但存在实验操作复杂，耗时长，需要相互匹配的检测试剂以及相关的仪器设备来进行，且仅限于在实验室内进行，难以普及推广。因此，研制开发快速、简便的PRV病毒检测方法，对于病毒增殖的实时监测具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒(PorcinePseudoraibies Virus，PRV)的快速特异性检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的优选抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV-BC21，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步的，本发明提供一种纳米抗体PRV-BC21的制备方法，包括以下步骤：
(1)重组真核表达载体的构建：通过PCR扩增、酶切，将编码纳米抗体PRV-BC21的DNA序列连接至表达载体中获得阳性质粒；
(2)将步骤(1)中阳性质粒转化宿主细胞，诱导表达纳米抗体PRV-BC21。
进一步的，所述表达载体可以为真核表达载体或原核表达载体，优选的，所述表达载体为真核表达载体，所述表达载体可选自：pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)、pB SII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET 15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N1(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT Pub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)等。
所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或真核细胞，优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可选自例如：中国仓鼠的卵巢细胞CHO、猴的肾脏细胞COS细胞、人的胚肾细胞HEK-293、人的子宫颈癌细胞HELA等。
进一步的，本发明提供一种猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条，采用纳米抗体PRV-BC21与胶体金试纸条结合方式对猪伪狂犬病毒实现快速检测，实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了纳米抗体PRV-BC21在快速检测方面的初步应用。
进一步的，本发明提供的猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条包括底板、吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，从底板上从上到下依次粘贴吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，其中所述金垫上设置有胶体金标记的纳米抗体PRV-BC21；
所述NC膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区喷涂PRV包被抗原，所述质控区喷涂有与胶体金标记的纳米抗体PRV-BC21特异结合的抗体。
进一步，本发明提供一种猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条的制备方法，
1)纯化纳米抗体PRV-BC21，透析待用；
2)胶体金标记纳米抗体PRV-BC21；
3)BSA封闭反应；
4)离心后用含1％BSA的PBS液洗涤保留沉淀；
5)复溶后喷涂金标垫；
6)包被NC膜；
7)在室温低湿度条件下进行干燥；从底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫、样品层析垫，裁切待用；
8)对胶体金试纸条进行应用测试，得出胶体金试纸条的检测限为10ng/mL级别，能满足快速检测PRV的要求。
有益效果
本发明提供了一种特异性识别PRV的纳米抗体PRV-BC21，并公开了所述纳米抗体的氨基酸序列。本发明提供的特异性纳米抗体，测序结果显示纳米抗体PRV-BC21的序列与人的VH高度相似，ELISA结果显示其具有很高的结合力，推测有可能是骆驼体内自然存在的VH-HcAbs，可能会拥有很大的应用前景。这种纳米抗体可以特异性的识别PRV，可将其作为免疫学检测的材料，具有非常广阔的应用前景。
通过对比试验证明在PRV检测中纳米抗体PRV-BC21比商品化的单克隆抗体更灵敏，纳米抗体PRV-BC21与胶体金标记技术相结合，灵敏度高，检测PRV的检测限可达到1ng/mL。特异性强，交叉反应少，本发明所述的试纸条对猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV抗体阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒TGEV抗体阳性血清、猪流行性腹泻病毒PEDV抗体阳性血清、猪细小病毒PPV抗体阳性血清和猪瘟病毒SFV抗体阳性血清以及鸡新城疫病毒NDV病阳性血清、犬瘟热病毒CDV病阳性血清和兔戊型HEV肝炎病毒病阳性血清的交叉反应都为阴性。首次开发的胶体金试纸条实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了对PRV快速检测的初步应用。
附图说明
图1为PRV的gB和gC抗原表位融合蛋白3D抗原表位模拟图
图2为PRV的gB-gC抗原表位融合蛋白表达与纯化，其中，M为marker，1-4为PET-28a-BC重组阳性质粒SDS-PAGE鉴定图(不同上样孔)，在大约27kD位置都出现与预期分子量相当的特异性阳性条带，证明重组病毒PRV的gB-gC抗原表位融合蛋白表达成功；
图3为ELISA方法检测双峰驼血清效价，其中，阴性对照为免疫前骆驼血清；
图4为3轮淘选后融合蛋白特异性纳米抗体ELISA结果；
图5为试纸条剖面结构，其中1为PVC底板，2为样品层析垫，3为金垫，4为NC膜，5为吸水垫纸；
图6为PRV-BC21胶体金试纸条的不同毒株交叉性反应检测，其中1为阴性对照，2为PRV JS2012株，3为PRV HNB株，4为PRV JL15(2021)株，5为疫苗株Bartha-K61。
图7为PRV-BC21胶体金试纸条的的敏感性实验，其中1-6分别对应1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000，1:1000000稀释度下的检测结果，7为阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1PRV的gB和gC抗原表位筛选和融合蛋白的表达
首先针对猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01、猪伪狂犬病病毒变异株HN1201株、猪伪狂犬病病毒变异株HN1202株、猪伪狂犬病病毒Fa株、猪伪狂犬病病毒Bartha株、猪伪狂犬病病毒Kaplan株、猪伪狂犬病病毒Becker株的gB基因进行同源性分析，并利用生物分析手段筛选抗原片段候选区域，最终确定选择含gB蛋白的第76位至135位氨基酸以及第576位至640位氨基酸所示序列，并根据生物信息学分析对其中的部分氨基酸残基进行替换或者优化(参见图1)，最终确定其gB抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
猪伪狂犬病毒gC蛋白抗原表位多肽片段的优化设计
如上所述，同样对已知猪伪狂犬病毒gC蛋白进行同一性分析和计算机模拟，筛选出的gC蛋白抗原表位多肽为52-113位与401-458位的串联，而且进行了相应的优化，最终确定其gC抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
串联表达盒的构建
利用overlap PCR方法对上述多肽序列进行扩增，将gB、gC序列直接融合串联起来，形成融合蛋白，构建PRVBC融合蛋白表达盒，利用双酶切将其连接到克隆至PET-28a(购自Invitrogen公司，货号A11499)，挑取单克隆鉴定插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，测序正确的质粒命名为PET-28a-BC。将PET-28a-BC重组阳性质粒进行表达，经SDS-PAGE(见图2)验证后经镍柱层析法纯化获得可溶性PRV-BC融合蛋白。
实施例2PRV-BC融合蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定
纯化后的可溶性PRV-BC融合蛋白与结合弗氏佐剂充分乳化后，经颈部皮下注射免疫双峰驼，每两次免疫之间每隔2周的时间，前后共进行共6次免疫。抽取第6次免疫后血液分离血清后以PRV-BC融合蛋白为抗原测定抗体效价，监测免疫效果。阴性对照为免疫前骆驼血清，取免疫结束后离心处理过的血清，ELISA方法检测其抗体效价(图3)，结果显示血清中抗体效价达到1:256000。利用试剂盒(购自Invitrogen公司)提取淋巴细胞RNA，以所提取出的RNA为模板利用Oligo(dT)20引物反转录酶(
Figure BDA0003621008660000061
III)合成cDNA，进一步经过巢式PCR扩增VHH片段。将扩增后的VHH基因片段通过酶切位点克隆入酶切后pCANTAB 5E噬菌体展示载体。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，筛选针对PRV-BC融合蛋白特异性纳米抗体ELISA结果由0.15上升至3.25，表明针对PRV-BC融合蛋白的特异性纳米抗体得到了明显的富集(图4)。将通过ELISA检测结果确定为的阳性(大于阴性值3倍以上)的单克隆菌液，测序。通过软件MegAlign进行对测序结果的比对，并进行分类。根据序列分类结果，ELISA方法检测所筛选出的纳米抗体粗提物按1：2、1:20、1:200、1:2000倍比稀释，再次测定其效价。利用ELISA分析纳米抗体的特异性和亲和力，最终筛选到的针对PRV的PRV-BC融合蛋白的纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。将此纳米抗体命名为PRV-BC21。
纳米抗体PRV-BC21的表达和纯化
1)利用引物F1：5’-CATCGCTAGTTACACGTTATAGC-3’(SEQ ID NO.4)；R1：5’-AAGGCTAAGCTGACCCGATCACG-3’(SEQ ID NO.5)扩增PRV-BC21，回收酶切连接到原核表达载体pET28a(+)中，筛选单菌落测序筛选阳性质粒；
2)将筛选获得的pET28a(+)-BC21质粒转染到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在LB培养基中扩增培养，250rpm、37℃培养至OD600＝0.5～0.8，加入100μL、1.0M的IPTG溶液诱导过夜。
3)4℃、10000rpm离心15min，无菌操作台中小心去除上清，菌体沉淀采用细菌蛋白抽提试剂盒(Clontech Technology)进行周质蛋白提取，得到蛋白粗提液。将蛋白粗提液用平衡缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，20mM咪唑；pH值＝7.4)透析过夜。
4)采用His60镍柱(Clontech Technology)纯化抗体：首先用10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗镍柱，将步骤(3)中透析后的上清蛋白进样His60镍柱(Clontech Technology)进行抗体纯化，用10倍柱体积淋洗缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，40mM咪唑；pH值＝7.4)洗涤柱子，最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，300mM咪唑；pH值＝7.4)洗脱纳米抗体PRV-BC21，收集洗脱液，装入透析袋，用0.01M，pH值＝7.4的磷酸盐缓冲液透析3～4次后浓缩，分装并于-20℃保存备用。
实施例3纳米抗体PRV-BC21的性质检测
采用间接竞争ELISA方法测定纳米抗体PRV-BC21的抗体特异性，具体用交叉反应率描述，测试方法如下：将猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV抗体阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒TGEV抗体阳性血清、猪流行性腹泻病毒PEDV抗体阳性血清、猪细小病毒PPV抗体阳性血清和猪瘟病毒SFV抗体阳性血清以及鸡新城疫病毒NDV病阳性血清、犬瘟热病毒CDV病阳性血清和兔戊型HEV肝炎病毒病阳性血清等八种不同标准品储存液，用10％甲醇/PBS梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制纳米抗体PRV-BC21的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50％时的标准品浓度，用IC50表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率(％)＝(纳米抗体PRV-BC21 IC50/类似物IC50)×100％，得到纳米抗体PRV-BC21对于对PRV的50％抑制浓度IC50为1.03ng/mL；与PRRSV、TGEV、PEDV、PPV、SFV、NDV、CDV、HEV的交叉反应率均小于0.1％。因此，纳米抗体PRV-BC21是一种针对PRV的高特异性纳米抗体，能够应用于特异性识别PRV的检测试剂的研发。
实施例4PRV-BC21胶体金试纸条的装配
(1)取纯化后的纳米抗体PRV-BC21蛋白，用0.01M，pH值＝7.4的磷酸盐缓冲液透析3～4h备用；
(2)制备胶体金，用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5mL 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.2，备用；
(3)将1.5mL离心管用超纯水清洗两遍，吸取1mL胶体金缓慢加入管中，通过磁力搅拌，逐滴加入总量为20μg的纳米抗体PRV-BC21，混匀后反应40min；
(4)加入90μL的8％BSA，进行封闭反应40min；
(5)在14000rpm/min转速下低温离心35min，去掉上清液，用含BSA的质量分数为0.1％～0.5％、蔗糖的质量分数2％～4％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗涤重复此步骤2-3次，保留沉淀，最后用体积为初始胶体金体积1/10的上述缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用；
(6)将金垫浸泡于含0.5％BSA、5％蔗糖、pH 7.4的0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿2h，37℃烘干备用。用Bio dot划膜仪将制备好的胶体金标记物均匀喷涂在金垫上，每1cm金垫喷涂0.01mL胶体金标记物，置于37℃环境(湿度＜20％)中2h后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用；
(7)用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸缓冲液将PRV-BC融合蛋白稀释到1mg/mL，用Biodot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线(T线)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。
(8)根据附图5所示试纸条剖面结构，将吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫依次按顺序粘贴在PVC底板上，其中，金垫从起始端有1/3区域被样品层析垫覆盖，交界面增大可以提高样品扩散效率，样品在重力的作用下有利于从样品层析垫扩散到金垫上；金垫的末端与NC膜的始端相连，NC的末端与吸水垫纸的始端相连，样品层析垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫纸的末端与PVC底板的末端对齐；所述NC膜上有检测线和质控线，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近样品层析垫的末端的一侧；质控线位于远离结合样品层析垫的末端的一侧。其中，样品层析垫为经过磷酸缓冲液处理的玻璃纤维膜，所述磷酸缓冲液为含有1-5％BSA和表面活性剂的磷酸缓冲液。
(9)将试纸条用机器切成合适宽度的小条，装在特制的塑料制卡壳中，卡壳上设有加样孔和观察孔，以铝箔袋密封，4～30℃的环境中贮存，有效期长达12个月。
实施例5PRV-BC21胶体金试纸条的性状检测
1)不同毒株的交叉性验证
为了验证该试纸条能否在猪场等实际应用场合进行相应的检测，同时验证对其他不同来源的PRV毒株是否也能产生交叉反应，对PRV JS2012株、PRV HNB株、PRV JL15(2021)株、疫苗株Bartha-K61感染猪后的血样分别用试纸条进行检测，试验结果如图6所示PRVJS2012株、PRV HNB株、PRV JL15(2021)株、疫苗株Bartha-K61感染后的血清样本均为阳性。上述结果表明，该试纸条可以应用于临床各种PRV病毒株的抗体检测。
2)敏感性试验
为了验证本申请所筛选到的纳米抗体的敏感性，将PRV-BC融合蛋白定容至浓度为1mg/mL，分别以1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000，1:1000000进行倍比稀释，进行检测，重复三次。检测结果表明，当血清稀释比例为1:100000时(即最低检测限为浓度为10ng/mL时)，仍能检测到阳性结果，具有很高的灵敏性(图7)。
3)稳定性测试
4℃贮藏稳定性试验：将制作好的PRV-BC21胶体金试纸条和干燥剂一起用铝箔袋密封包装，至于4℃冰箱内，每两个月取出2条，检测可视检测限浓度的PRV-BC融合蛋白标准系列溶液，观察稳定性测试结果(包括检测线和质控线的有无、条带的清晰度、金标垫放金标记抗体的程度及试纸条的灵敏度等)。结果证实试纸条在4℃保存8个月以上仍能保持良好的检测效果。
4)临床实际检测
从重庆附近猪场送检样品中检测108份灭活临床样品(包括血清样品、器官组织样品，其中器官组织样品利用实验室常规手段用PBS缓冲液匀浆研磨后离心取上清液进行检测)。利用本申请的试纸条进行检测，检测结果显示，108份样品中，89份为阳性样品，19份为阴性血清。参照《GB/T 18641伪狂犬诊断技术》设计引物(由成都康迪生物技术有限公司合成)，序列为上游引物FPRV CAGGAGGACGAGCTGGGGCT(SEQ ID NO.6)，下游引物RPRVGTCCACGCCCC GCTTGAAGCT(SEQ ID NO.7)。反应体系(20μL)：样品1μL，上、下游引物各1μL，DNA-MIX10μL，ddH2O7μL。PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循环；72℃延伸10min。经PCR验证，120份样品中，90份为阳性样品，18份为阴性血清。由此可见，本实验所建立的试纸条可以可靠的应用于临床检测中，虽然并不能达到与PCR检测结果100％的一致性，但是由于其快速高效而且兼具敏感性和可靠性的特点，可以直接的、广泛的、有效的应用于临床样品检测。
经过上述测试可以证明，上述的PRV-BC21胶体金试纸条，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，其检测范围宽、假阳性率低、检测结果可靠。使用PRV-BC21胶体金试纸条时，样品前处理时间短，标准品的检出限为10ng/mL。该检测方法适用于临床样品检测或者猪场的防疫检测；可以在较短时间内检测大量样品，排除大量阴性样品。由于样品处理简便易行，检测又无需昂贵的仪器设备，因此，适合在基层检验检疫单位推广使用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆市动物疫病预防控制中心
<120> 一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、制备方法和应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 125
<212> protein
<213> gB抗原表位多肽
<400> 1
ATPDGFSAEESLEEIDGAVSPGPSDAPDGEEGDLDARTAVRAVATERDRFYRLNPSEVATAALGQRVSARVLADVMAISRCVEVRGAVYVQNSMRVPGERGTCYSRPLVTFEHNGTAVIEGQLGD
<210> 2
<211> 120
<212> protein
<213> gC抗原表位多肽
<400> 2
STPEPVSGTTGAEASTPAAVSTPRVPAPSVSRRKPQRNGNRTRVHGDKATSHGRKPIVCRERAEHAGLLNVRSARPLSDLDGPVDYTCRLEGMPSVLPIFEDTQRYDASPTSESWPVVTS
<210> 3
<211> 136
<212> PROTEIN
<213> 纳米抗体PRV-BC21
<400> 3
EVQLVEAPRGVSPKGSLRLSCEWAGGKRPAMSWISPKPEKRLEYSDAGHPPARKILQETRYYKVGSSNATWYQQKPGGQSPLLAYRFVAPHSWYGVPDWGGQGEDSPAKTGVQQYGSYPLYWGAGQGTQVTVSSAA
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物F1
<400> 4
CATCGCTAGTTACACGTTATAGC
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物R1
<400> 5
AAGGCTAAGCTGACCCGATCACG
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物FPRV
<400> 6
CAGGAGGACGAGCTGGGGCT
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游引物RPRV
<400> 7
GTCCACGCCCC GCTTGAAGCT

Claims (5)

1.一种识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV-BC21，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其制备方法包括以下步骤：
(1)重组真核表达载体的构建：通过PCR扩增、酶切，将编码纳米抗体PRV-BC21的DNA序列连接至表达载体中获得阳性质粒；
(2)将步骤(1)中阳性质粒转化宿主细胞，诱导表达纳米抗体PRV-BC21。
2.一种猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条，其特征在于所述猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条包括底板、吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，从底板上从上到下依次粘贴吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，其中所述金垫上设置有胶体金标记的纳米抗体PRV-BC21；所述NC膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区喷涂PRV包被抗原，所述质控区喷涂有与胶体金标记的纳米抗体PRV-BC21特异结合的抗体，其中纳米抗体PRV-BC21的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条的制备方法，
1)纯化纳米抗体PRV-BC21，透析待用；
2)胶体金标记纳米抗体PRV-BC21；
3)BSA封闭反应；
4)离心后用含1％BSA的PBS液洗涤保留沉淀；
5)复溶后喷涂金标垫；
6)包被NC膜；
7)在室温低湿度条件下进行干燥；从底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫、样品层析垫，裁切待用；
8)对胶体金试纸条进行应用测试，得出胶体金试纸条的检测限为10ng/mL级别，能满足快速检测PRV的要求，其中纳米抗体PRV-BC21的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.权利要求3中所述的猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条在猪伪狂犬病毒的非疾病诊断的快速检测中的应用。
5.权利要求1所述的一种识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体在猪伪狂犬病毒的非疾病诊断的快速检测中的应用。
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