CN111366728A

CN111366728A - 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试剂盒

Info

Publication number: CN111366728A
Application number: CN202010231001.2A
Authority: CN
Inventors: 胡川闽; 王江明; 范舒; 李斌; 徐淞
Original assignee: Chongqing Biomean Technology Co ltd
Current assignee: Chongqing Biomean Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2020-07-03

Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的免疫层析试剂盒，包括测试条，其中测试条包括对应粘贴层压的样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，结合垫上包被有由胶体金标记的新蝶呤抗体偶合物、新冠病毒N蛋白偶合物、新冠病毒S1蛋白偶合物、DNP‑BSA偶合物；NC膜上设有质控线C线和检测线，C线包被有兔抗DNP抗体，检测线包括T1线、T2线和T3线，T1线和T2线分别包被有抗人IgG抗体或抗人IgM抗体中的一种，T3线包被有Neo‑BSA抗原，C线、T1线、T2线呈与试纸条长边垂直的三条平行带。本发明提供的试剂盒能够有利于新型冠状病毒感染的早期诊断快速确认，灵敏度高。

Description

一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试剂盒

技术领域

本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒 SARS-CoV-2的免疫层析试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒，即“SARS-CoV-2”， 2020年1月12日被世界卫生组织命名，其与2002年的SARS冠状病毒以及2012年的中东呼吸综合症冠状病毒（MERS）同属于冠状病毒科β属。SARS-CoV-2与2002年“非典”SARS-CoV比对，有约70%序列相似性，与MERS-CoV有40%的序列相似性。世界卫生组织总干事谭德塞2020年2月11日宣布，将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”(Corona Virus Disease 2019)。与此同时，国际病毒分类委员会声明，将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus2）；并认定这种病毒是SARS冠状病毒的姊妹病毒，其是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，分子结构是呈球形、上有突起、直径75～160nm，病毒基因组为连续线型单链RNA，分子量通常为(5.5～6.1)×10⁶。病毒基因组依次编码棘突蛋白(spike protein)、包膜蛋白(envelope protein)、膜蛋白(membrane protein)和核蛋白(nucleoprotein)。

确定诊断的金标准就是能在患者体内找到SARS-CoV-2的存在，故对临床诊断病例或疑似病例，具备以下病原学证据之一者可确诊，1)呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；2)呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。此外核酸检测需要专业的设备，检测要求在生物安全P2级别以上的实验室进行。故迫切需要开发适合基层医疗机构使用，且能进行大量人群同时检测的快速筛查检测产品。

目前也有检测新型冠状病毒抗体IgM和IgG的试剂问世，部分医生也开始呼吁对新型冠状病毒疑似病例开展IgM筛查。新型冠状病毒感染机体后，病毒的遗传物质—RNA是最先能被检测到的标志物。随着感染后病程的发展，人体免疫系统会针对病毒的结构蛋白产生特异性抗体，其中IgM是机体感染后产生的早期抗体，提示现阶段被感染的状态；而IgG则提示存在既往感染史。但是无论是IgM还是IgG，从病毒感染到抗体产生均存在窗口期，因此其检测往往滞后于核酸检测，普遍认为特异性抗体检测敏感度上也低于核酸检测，但Zheng等于2005年报告了对129例SARS冠状病毒感染病例的研究，发现其核酸荧光PCR 检测的阳性率只有60.5％(78/129)，而特异性抗体的检测阳性率为100％ (129/129)，目前爆发的疫情也是冠状病毒感染，应当积极开展特异性抗体检测的研究以弥补核酸检测的不足。

新蝶呤(Neopterin)最早由Rembold H.和Buschmann L.于1963年发现的三磷酸鸟苷(GTP)的代谢产物，分子量253，后续逐渐发现，其由巨噬细胞在干扰素因子-γ刺激T淋巴细胞分泌产生，且在血液、尿液、脑脊液及胸腹水等体液中较稳定的存在，持续时间长，且不易在体内灭活或降解，是反映“淋巴细胞-巨噬细胞”所介导的细胞免疫状态的较好标志物。

在病毒感染时其体液中的新蝶呤含量会增加，2002年SARS爆发及后续的研究发现，新蝶呤早在症状出现的首日已经开始升高，其急性期血清新蝶呤含量是恢复期血清含量的5倍，是健康人血清含量的4倍以上，然而SARS患者急性血清中CRP(C反应蛋白、目前比较好的反映病毒感染临床检测指标之一，在多数新冠肺炎的患者中也增加)浓度稍低于参考值，且恢复期血清CRP浓度与健康对照也无明显差别，提示新蝶呤比CRP能更灵敏的反应病毒感染的存在，新蝶呤对SARS-CoV-2感染检测有重大临床应用价值。

发明内容

为了填补市场上缺少新型冠状病毒感染快速检测试剂盒的空白，本发明旨在提供一种准确、快速、方便的检测新型冠状病毒感染的试剂盒。

本发明的技术方案具体如下：

一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，包括测试条，其中所述测试条包括对应粘贴层压的样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，所述结合垫上包被有由胶体金标记的新蝶呤抗体偶合物、新冠病毒N蛋白偶合物、新冠病毒S1蛋白偶合物、DNP-BSA偶合物；

所述层析膜上设有质控线C线和检测线，所述C线包被有兔抗DNP抗体，所述检测线包括T1线、T2线和T3线，所述T1线和T2线分别包被有抗人IgG抗体或抗人IgM抗体中的一种，所述T3线包被有Neo-BSA抗原，所述C线、T1线、 T2线呈与试纸条长边垂直的三条平行带。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的样品垫为玻璃纤维膜经浸渍处理后烘干得到。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的层析膜为硝酸纤维素膜。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的吸水垫为滤纸。

在根据本发明的一个实施方案中，所述新蝶呤抗体为新蝶呤单克隆抗体。

在根据本发明的一个实施方案中，所述新蝶呤单克隆抗体由包括下述步骤的方法制备得到的：

1)将新蝶呤与BSA蛋白交联，得到交联BSA蛋白的新蝶呤抗原(Neo-BSA)；

2)将步骤1得到的Neo-BSA与佐剂混合乳化后免疫小鼠；

3)筛选抗血清效价最高的小鼠，将筛选出的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养并筛选得到阳性杂交瘤细胞；

4)将所述阳性杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，10-14天后收集腹水；

5)将腹水亲和层析纯化，即得新蝶呤抗体。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中包括：

将适量新蝶呤20mg溶解于二甲基亚砜，并调节pH至7.5，搅拌至完全溶解，得到新蝶呤溶液；然后称取适量并SMCC溶解于二甲基亚砜后，加入到完全溶解的新蝶呤溶液中，搅拌混匀后，加入以交联缓冲液溶解的BSA溶液中，继续搅拌，然后用pH 7.4的10mM PBS透析浓缩，得到的浓缩液即为交联BSA蛋白的新蝶呤抗原；其中，所述交联缓冲液为pH7.2的PBS和NaCl的混合溶液，PBS 终浓度为0.1mol/L，NaCl终浓度为0.15mol/L；优选的，所述BSA溶液浓度为 5mg/ml。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)包括：

将Neo-BSA与等量的弗氏完全佐剂乳化后，对Balb/c小鼠进行基础免疫；2 周后再将Neo-BSA与等量的弗氏不完全佐剂乳化，对小鼠进行追加免疫；2周后，再次追加免疫。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中细胞融合时，所述脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为5:1。

本发明的另一方面还包括上述用于检测新型冠状病毒感染的免疫层析试剂盒在检测新型冠状病毒SARS-CoV-2中的应用。

本申请具有如下优点：

本发明能够通过血液样品快速准确的检测出新型冠状病毒SARS-CoV-2的早期感染者，有利于及早进行隔离和治疗。

附图说明

图1为新型冠状病毒N蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图；

图2为新型冠状病毒S蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图；

图3为新蝶呤单克隆抗体的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图；

图4为检测阳性结果条带示意图；

图5为检测阴性结果条带示意图；

图6为检测无效结果示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如无特别说明，本发明所使用的细胞株与各种试剂均可通过合法途径商购获得。

如无特别说明，本发明中所使用的室温均为“25℃”。

(1)材料和设备

实施例1新蝶呤抗原和新型冠状病毒N抗原的制备

(1)新蝶呤抗原的制备

交联缓冲液配制：0.1mol/L PBS,0.15mol/L NaCl,pH7.2；

称取新蝶呤20mg，加入5ml二甲基亚砜，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.5，37℃搅拌至完全溶解。称取SMCC 20mg，溶解于5ml二甲基亚砜后，加入到完全溶解的新蝶呤溶液中，37℃搅拌30min后，加入到8ml浓度为5mg/ml 的用交联缓冲液溶解的BSA溶液中，37℃继续搅拌30min，然后用1L体积的pH 7.4的10mM PBS透析4次后浓缩至体积为8ml左右，得到的浓缩液即为交联BSA 蛋白的新蝶呤抗原(Neo-BSA)，加0.1％的防腐剂后冻存备用。

同理可以得到交联KLH蛋白的新蝶呤抗原(Neo-KLH)；

(2)新型冠状病毒N蛋白的制备

首先配制N蛋白纯化所需缓冲液(所用试剂均为分析纯)：平衡缓冲液：10mM 磷酸盐缓冲液，0.5M氯化钠，pH 7.4；洗脱缓冲液：10mM磷酸盐缓冲液，0.5M 氯化钠，0.5M咪唑，pH 7.4。

将带有N蛋白基因的BL21菌株在含有卡那霉素抗性的LB平板上划线，37℃ 放置过夜。挑取单克隆，接种于含有卡那抗性的液体LB培养基中，37℃，200rpm 过夜。将过夜培养的菌液1:100接种于含有卡那抗性的1L液体LB培养基中，37℃，200rpm培养。测定培养的菌液OD600，待生长到OD600在0.6左右，加入1mM IPTG诱导表达，然后继续培养6小时。5000rpm，10min，收集诱导表达的菌液，弃上清，留沉淀。用PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎。12000rpm，15min， 4℃离心，取上清，弃沉淀。上清使用Ni sepharose Excel(GE)纯化。将含有目的蛋白的溶液透析到PBS缓冲液中，得到新型冠状病毒N蛋白抗原。通过用 SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证重组蛋白的分子量和纯度，结果如图1所示,N蛋白泳道只有一条主条带，无其他杂条带，说明N蛋白纯度很高。

(3)新型冠状病毒S1蛋白的制备

新型冠状病毒S1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

新型冠状病毒S1蛋白序列(SEQ ID NO:1):

GenBank:QHD43416.1

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFC NDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIY SKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQP RTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGE VFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVR QIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAG STPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFN GLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLY QDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNS PRRAR

编码新型冠状病毒S1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)

ATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAGTGCGTGAACCTGACCACCAGGACCCAGCTGCCCCCCGCCTACACCAACAGCTTCACCAGGGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGGAGCA GCGTGCTGCACAGCACCCAGGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATC CACGTGAGCGGCACCAACGGCACCAAGAGGTTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTA CTTCGCCAGCACCGAGAAGAGCAACATCATCAGGGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGCAAGA CCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGC AACGACCCCTTCCTGGGCGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTCAGGGT GTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGAGCCAGCCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCA AGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTAC AGCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGAGGGACCTGCCCCAGGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCCCTGGT GGACCTGCCCATCGGCATCAACATCACCAGGTTCCAGACCCTGCTGGCCCTGCACAGGAGCTACCTGA CCCCCGGCGACAGCAGCAGCGGCTGGACCGCCGGCGCCGCCGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCC AGGACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCC CCTGAGCGAGACCAAGTGCACCCTGAAGAGCTTCACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACT TCAGGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAG GTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGC CGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCA AGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGG CAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGG CTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACA GGCTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGC AGCACCCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCC CACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCG CCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAAC GGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTCCAGCAGTTCGGCAG GGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGAGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCCT GCAGCTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACCCCCGGCACCAACACCAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTAC CAGGACGTGAACTGCACCGAGGTGCCCGTGGCCATCCACGCCGACCAGCTGACCCCCACCTGGAGGGT GTACAGCACCGGCAGCAACGTGTTCCAGACCAGGGCCGGCTGCCTGATCGGCGCCGAGCACGTGAACA ACAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGCGCCAGCTACCAGACCCAGACCAACAGC CCCAGGAGGGCCAGG

设计的表达形式为C端融合His标签；

基因通过HindIII和XhoI连接到pcdna3.1+C6H，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

合成的质粒应用高效真核表达系统Expi293F^TM Expression System Kit(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)说明书进行表达，3天后收集细胞，将细胞上清加入离心瓶，2000转离心10分钟，去沉淀，留上清进行纯化。

首先配制抗原纯化所需缓冲液(所用试剂均为分析纯)：平衡缓冲液：10mM 磷酸盐缓冲液，0.5M氯化钠，pH 7.4；洗脱缓冲液：10mM磷酸盐缓冲液，0.5M 氯化钠，0.5M咪唑，pH7.4。

上清使用Ni sepharose Excel(GE)纯化。将含有目的蛋白的溶液透析到 PBS缓冲液中，得到新型冠状病毒S蛋白抗原。通过用SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证重组蛋白的分子量和纯度，结果如图2所示，S1蛋白泳道只有一条主条带，无其他杂条带，说明S1蛋白纯度很高。

实施例2新蝶呤单克隆抗体的制备及鉴定

(1)新蝶呤单克隆抗体的制备

将实例1制备的Neo-BSA与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对4只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100μg/ml，每只小鼠200μl)。2周后，将Neo-BSA与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100μg/ml，每只小鼠200μl)；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后取小鼠尾静脉采血进行间接ELISA法检测抗血清效价，ELISA抗血清效价达到1：50000，说明免疫合格。选择效价最高的小鼠处死，取出小鼠脾脏进行融合筛选。

融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以5:1混合，用细胞融合仪 (CFB16-HB，购自BEX公司)进行融合。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液(购自Gibco公司)中，并置于5％CO₂中在37℃培养。

用间接ELISA法进行筛选。筛选时，以Neo-KLH为筛选原包被酶标版，封闭后加入杂交瘤细胞培养上清，孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG，孵育后洗涤，加入底物TAB显色。对检出的阳性克隆孔细胞采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于5％CO₂中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行杂交瘤细胞的扩大培养。

采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取成年雌性Balb/c 小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL。1周后，用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4×10⁵个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞。10～14天后收集腹水。

(2)新蝶呤单克隆抗体的纯化

收集腹水后对其进行亲和纯化，具体方案简述如下。配制抗体纯化所需缓冲液(所用试剂均为分析纯)：结合缓冲液(A液)20mmol/L磷酸钠， 0.8mol/L硫酸铵，pH 7.5；洗脱缓冲液(B液)20mmol/L磷酸钠， pH 7.5；再生缓冲液(C液)20mmol/L磷酸钠，pH 7.5，并按体积比30％加入异丙醇。在含有单克隆抗体的腹水中加入硫酸铵，使其终浓度与A液中硫酸铵浓度一致，0.45μm滤膜过滤等待上样；选用 HiTrap IgG Purification HP柱(购自GEHealthcare)接入AKTA prime 蛋白纯化仪，先后A、B液和C液对柱子进行充分洗涤；用A液进行充分平衡后，将准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，去除杂蛋白，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0，将抗体分装冷冻于-20℃ 保存；用Regeneration Buffer使填料进行再生，然后用Binding Buffer进行平衡。最终纯化出的抗体即为新蝶呤抗体。

(3)ELISA鉴定抗新蝶呤抗体

将Neo-BSA和相关对照抗原用包被稀释液稀释至2μg/mL，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体稀释成10ug/ml，然后按1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000...... 稀释至1：10240000，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。 37℃孵育1h，洗板，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG(酶标二抗，1:5000)，按100μl/ 孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/ 孔，避光显色3min，加入终止液50μl/孔。在450nm处测定吸光度值。

(4)新蝶呤抗体的免疫印迹鉴定

①将蛋白质分子量Marker3μl、新蝶呤抗体20μl、相关对照抗原20μl 行SDS-PAGE。

②电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10min。

③将0.22μm PVDF膜先用无水甲醇处理20s，再用ddH₂O洗涤5min。然后再浸入转印缓冲液超过5min。同时将滤纸浸入转印缓冲液中。

④转膜：从下至上依次排列：滤纸—PVDF膜—胶—滤纸，排出气泡，放入转膜仪，18V恒压电转移1.5h。

⑤转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，双蒸水清洗两遍，TBST 洗5min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2h。

⑥弃去封闭液，用1×TBST漂洗膜3次，每次15min。

⑦加入以1:1000稀释的纯化抗体，4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次，每次15min。

⑧加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育3h。

⑨1×TBST洗涤3次，每次15min。

⑩用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。在新蝶呤对应分子量处可见新蝶呤抗体结合清晰条带，说明这株抗体具有很高的特异性。

实施例3用于检测新冠病毒感染的胶体金免疫层析检测试剂盒的制备

1)缓冲溶液

样品垫处理液(50mM Tris，3.6mM EDTA-Na2，3％海藻糖，0.1％BSA，0.4％ Tween-20，pH8.6)；

结合垫处理液(50mM Tris-HCl，3％海藻糖，0.5％BSA，pH9.0)；

胶体金稀释液(50mM Tris-HCl，0.5％酪蛋白，3％海藻糖，pH8.0)；

包被缓冲液(10mM PBS，3％海藻糖，0.5％甲醇，pH7.4)；

样本稀释液(10mM PBS，0.1％曲拉通，pH 7.4)。

2)胶体金制备

量取200ml超纯水加入到500ml锥形瓶中，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器加热板上，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度，缓慢搅拌加热至超纯水沸腾。当超纯水沸腾后，用移液器吸取2mL 1％四氯金酸溶液和1mL 1％柠檬酸三钠加入超纯水中，继续加热搅拌10min，关闭加热旋钮，适当速度搅拌至室温，定容至200mL。

3)胶体金偶合物制备

打开高速冷冻离心机，按规程设置参数：温度4℃，离心力12000g，时间 8分钟，进行预冷；量取胶体金溶液100mL，使用0.1M碳酸钾调节pH值至7.5；搅拌下缓慢加入标记蛋白0.5mg至胶体金溶液中，计时15分钟，15分钟反应完成后加入10％BSA 2mL，计时30分钟；30分钟反应完成后放入离心机进行离心，离心完成后取出去上清液，加入2mM硼酸/0.1％PEG溶液恢复体积并混匀后再次离心。重复离心操作两次，最后一次保留标记体积的1％；

4)测试条的制备

测试条由五个组成部分组成：样品垫，结合垫，NC膜，吸收垫和PVC板。

将样品垫和结合垫分别在室温下浸入样品垫处理液和结合垫处理液中0.5h, 放入37℃干燥24h。

将胶体金标记的新蝶呤抗体偶合物、新冠病毒N蛋白偶合物、新冠病毒S1 蛋白偶合物、DNP-BSA偶合物用胶体金稀释液稀释至一定体积，然后通过喷金划膜仪以4μL/mm的参数将混合物包被到预处理的结合物垫上，放入37℃干燥 24小时。

用包被缓冲液将抗人IgG、抗人IgM、新蝶呤抗原-BSA和兔抗DNP稀释至 1mg/mL，通过喷金划膜仪包被到对应检测线(T1、T2、T3)和质控线(C)的 NC膜上，放入45℃干燥持续24小时。

将已干燥完成的结合物垫、样品垫、吸收垫分别粘贴在已层压NC膜的PVC 底板上相应位置，分别按压使其紧贴在PVC底板上，然后用切割机将大板垫切成4mm宽的试纸条，将试纸条装入卡壳中压紧，储存于铝箔袋中封口。

实施例4胶体金免疫层析检测试剂盒的使用方法及临床检测结果

1)检测原理

采用抗原-抗体特异性结合反应及胶体金免疫层析技术原理，新冠病毒S1蛋白H和新冠病毒S1蛋白可以特异性结合人血清中的新冠病毒特异性IgG和IgM抗体，新蝶呤抗体可以特异性结合血清中的新蝶呤，所以可以通过竞争抑制法检测新蝶呤、间接法进行检测人血清中的新冠病毒特异性IgG和IgM抗体。

在试剂硝酸纤维素膜的检测线(T1)包被有抗人IgG抗体，检测线(T2)包被有抗人IgM抗体，检测线(T3)包被有新蝶呤抗原-BSA偶联物，质控线(C) 包被有兔抗DNP多克隆抗体。检测时，样本中的新冠病毒IgG、IgM抗体先与胶体金标记新冠病毒N蛋白结合，该免疫复合物依靠膜的层析作用移动至硝酸纤维素膜上，被在硝酸纤维素膜检测线上的抗人IgG抗体(T1)、抗人IgM抗体(T2)捕获，从而呈现相应的红色条带。而样本中的新蝶呤先与胶体金标记的新蝶呤单克隆抗体偶合物结合，并占据新蝶呤抗体的抗原结合位点，该免疫复合物依靠膜的层析作用移动至硝酸纤维素膜上，从而使检测线(T3)的新蝶呤抗原不能捕获到胶体金偶合物，如果样本中没有新蝶呤或新蝶呤浓度低于阈值浓度，则胶体金偶合物上的新蝶呤抗体完全或部分没有结合，从而使检测线(T3)捕获到胶体金偶合物呈现红色条带。同时，胶体金标记的DNP-BSA偶合物也随层析作用沿着硝酸纤维素膜前移，与质控线(C)包被的兔抗DNP多克隆抗体结合，在质控区形成一条肉眼可见的红色条带。

2)检测方法及结果判读

从铝箔袋中取出检测卡→放在水平工作台面上平置并做好样本标记→取10 μl血清、血浆或20μl全血样本直接加入到加样孔中，再加入70μl(约2滴) 样本稀释液→10～15分钟内判读结果，15分钟后检测结果无效。

3)检验结果的判定

阳性结果：如图4所示

IgG阳性：检测线G线出现红色条带。

IgM阳性：检测线M线出现红色条带。

新蝶呤阳性：检测线N线显色比质控线(C)浅，或者不显色。

IgG/IgM/新蝶呤阳性：检测线G线、M线出现红色条带，检测线N线显色比质控线(C)浅，或者不显色。

阴性结果：在质控线(C)位置和新蝶呤(N)出现两条红色条带，且新蝶呤(N)红色条带显色与质控线一致，检测线(G)、检测线(M)无红色条带。如图5所示。

无效结果：质控线(C)不出现红色条带。如图6所示。

4)临床检测结果

利用胶体金技术快速做出了血清检测新冠病毒感染的胶体金快速检测试剂卡，并于合作单位重庆公共医疗救治中心合作，选择了45例正常健康对照(男24例，年龄20-65岁；女性21例，年龄16-75岁)；新型冠状病毒感染确诊病例 34例(男19例，年龄27-68，女15例，年龄23-76岁)，核酸检测阳性和CT确诊肺部炎症性病变影像)；普通流感患者未发烧15例(男8例，女7例，有流鼻涕、咽喉不适、咳嗽)；普通严重流感发烧病例5例(男4例，女1例)。通过该胶体金快速检测试剂卡检测结果显示，34例新冠确诊病例为强阳性，而45例正常健康对照和5例未发烧的普通流感以及1例发烧的病情较重的流感为阴性。证明新型冠状病毒感染检测试剂盒准确度很高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

<110> 重庆探生科技有限公司

<120> 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试剂盒

<141> 2020-03-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 685

<212> PRT

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg

675 680 685

<210> 2

<211> 2055

<212> DNA

<213> 2019新型冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 2

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

aggacccagc tgccccccgc ctacaccaac agcttcacca ggggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttca ggagcagcgt gctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc cttcttcagc 180

aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca acggcaccaa gaggttcgac 240

aaccccgtgc tgcccttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gagcaacatc 300

atcaggggct ggatcttcgg caccaccctg gacagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360

aacaacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420

ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag agctggatgg agagcgagtt cagggtgtac 480

agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgagccagc ccttcctgat ggacctggag 540

ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgagg gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600

ttcaagatct acagcaagca cacccccatc aacctggtga gggacctgcc ccagggcttc 660

agcgccctgg agcccctggt ggacctgccc atcggcatca acatcaccag gttccagacc 720

ctgctggccc tgcacaggag ctacctgacc cccggcgaca gcagcagcgg ctggaccgcc 780

ggcgccgccg cctactacgt gggctacctg cagcccagga ccttcctgct gaagtacaac 840

gagaacggca ccatcaccga cgccgtggac tgcgccctgg accccctgag cgagaccaag 900

tgcaccctga agagcttcac cgtggagaag ggcatctacc agaccagcaa cttcagggtg 960

cagcccaccg agagcatcgt gaggttcccc aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag 1020

gtgttcaacg ccaccaggtt cgccagcgtg tacgcctgga acaggaagag gatcagcaac 1080

tgcgtggccg actacagcgt gctgtacaac agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140

ggcgtgagcc ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgacagcttc 1200

gtgatcaggg gcgacgaggt gaggcagatc gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260

tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 1320

ctggacagca aggtgggcgg caactacaac tacctgtaca ggctgttcag gaagagcaac 1380

ctgaagccct tcgagaggga catcagcacc gagatctacc aggccggcag caccccctgc 1440

aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc cccctgcaga gctacggctt ccagcccacc 1500

aacggcgtgg gctaccagcc ctacagggtg gtggtgctga gcttcgagct gctgcacgcc 1560

cccgccaccg tgtgcggccc caagaagagc accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggcctgac cggcaccggc gtgctgaccg agagcaacaa gaagttcctg 1680

cccttccagc agttcggcag ggacatcgcc gacaccaccg acgccgtgag ggacccccag 1740

accctggaga tcctggacat caccccctgc agcttcggcg gcgtgagcgt gatcaccccc 1800

ggcaccaaca ccagcaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg 1860

cccgtggcca tccacgccga ccagctgacc cccacctgga gggtgtacag caccggcagc 1920

aacgtgttcc agaccagggc cggctgcctg atcggcgccg agcacgtgaa caacagctac 1980

gagtgcgaca tccccatcgg cgccggcatc tgcgccagct accagaccca gaccaacagc 2040

cccaggaggg ccagg 2055

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，包括测试条，其中所述测试条包括对应粘贴层压的样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，其特征在于，包括：所述结合垫上包被有由胶体金标记的新蝶呤抗体偶合物、新冠病毒N蛋白偶合物、新冠病毒S1蛋白偶合物、DNP-BSA偶合物；

所述层析膜上设有质控线C线和检测线，所述C线包被有兔抗DNP抗体，所述检测线包括T1线、T2线和T3线，所述T1线和T2线分别包被有抗人IgG抗体或抗人IgM抗体中的一种，所述T3线包被有新蝶呤-BSA抗原，所述C线、T1线、T2线呈与试纸条长边垂直的三条平行带。

2.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的样品垫为玻璃纤维膜经浸渍处理后烘干得到。

3.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的层析膜为硝酸纤维素膜。

4.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的吸水垫为滤纸。

5.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述新蝶呤抗体为新蝶呤单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述新蝶呤单克隆抗体由包括下述步骤的方法制备得到的：

2)将步骤1得到的Neo-BSA与佐剂混合乳化后免疫小鼠；

5)将腹水亲和层析纯化，即得新蝶呤抗体。

7.如权利要求6所述的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，步骤1)中包括：

将适量新蝶呤20mg溶解于二甲基亚砜，并调节pH至7.5，搅拌至完全溶解，得到新蝶呤溶液；然后称取适量并琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯溶解于二甲基亚砜后，加入到完全溶解的新蝶呤溶液中，搅拌混匀后，加入以交联缓冲液溶解的BSA溶液中，继续搅拌，然后用pH 7.4的10mM PBS透析浓缩，得到的浓缩液即为交联BSA蛋白的新蝶呤抗原；其中，所述交联缓冲液为pH7.2的PBS和NaCl的混合溶液，PBS终浓度为0.1mol/L，NaCl终浓度为0.15mol/L；优选的，所述BSA溶液浓度为5mg/ml。

8.如权利要求6或7所述的用于检测新型冠状病毒感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，步骤2)包括：

将Neo-BSA与等量的弗氏完全佐剂乳化后，对Balb/c小鼠进行基础免疫；2周后再将Neo-BSA与等量的弗氏不完全佐剂乳化，对小鼠进行追加免疫；2周后，再次追加免疫。

9.如权利要求8所述的用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的免疫层析试剂盒，其特征在于，步骤3)中细胞融合时，所述脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为5:1。

10.如权利要求1-9中任一项所述的用于检测新型冠状病毒感染的免疫层析试剂盒在检测新型冠状病毒SARS-CoV-2中的应用。