CN112175071A - 一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：抗原制备、动物免疫、细胞融合、筛选检测、稳定细胞株建立、单克隆抗体生产，刺突蛋白是SARS‑CoV‑2的表面膜蛋白，包含两个亚基S1和S2，S1主要包含一个受体结合域，负责识别细胞表面受体，S2包含膜融合所需的基本元素，S蛋白在诱导中与抗体和T细胞反应以及保护性免疫中起关键作用，因此刺突蛋白单克隆抗体能够很好的与刺突蛋白进行结合形成复合物，该复合物能够被消化或降解，进而使得SARS‑CoV‑2病毒失活，达到杀死SARS‑CoV‑2病毒的效果。
Description
技术领域
本发明属于单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术
2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。基于目前的流行病学调查，潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。此次疫情临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。世界卫生组织将本次引起病毒性肺炎病例的病原体命名为2019新型冠状病毒，即为SARS-CoV-2病毒，刺突蛋白是SARS-CoV-2的表面膜蛋白，包含两个亚基，S1和S2，S1主要包含一个受体结合域，负责识别细胞表面受体，S2包含膜融合所需的基本元素。
现阶段出现的SARS-CoV-2病毒感染能力极强，且未出现有效的药物，能够将SARS-CoV-2病毒进行消除，使得患者仅能凭借自身抵抗力治愈，大大降低了SARS-CoV-2病毒的治愈率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法。
本发明要解决的技术问题：
现阶段出现的SARS-CoV-2病毒感染能力极强，且未出现有效的药物，能够将SARS-CoV-2病毒进行消除，使得患者仅能凭借自身抵抗力治愈，大大降低了SARS-CoV-2病毒的治愈率。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
1抗原制备：将Skipe蛋白RBD区域序列，进行全基因合成，亚克隆至真核表达载体，并将表达载体C端添加8*His标签，表达纯化出的刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His；
2动物免疫：用刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His对Balb/c小鼠进行免疫，每只Balb/c小鼠每次免疫50μg，免疫3次，每次间隔时间两周；
3细胞融合：取第三次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾细胞分离成单细胞悬液，与处于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:1比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；
4筛选检测：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His包被至酶标板中，对融合后的细胞上清进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；
5稳定细胞株建立：对阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，得到杂交瘤稳定细胞株；
6单克隆抗体生产：采用无血清发酵培养杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用Prontein A亲和纯化单克隆抗体，制得刺突蛋白单克隆抗体。
进一步，所述的Skipe蛋白RBD区域序列：RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNHHHHHHHH。
进一步，动物免疫的具体步骤如下：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His和弗氏完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第一混合液，用混合液对6-8周龄的Balb/c小鼠进行皮下注射，每次注射位点个数为6-8个，每次注射量为50μg，得到初次免疫小鼠，将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His和弗氏不完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第二混合液，用第二混合液对初次免疫两周后的小鼠重复免疫2次，每次间隔两周。
进一步，细胞融合的具体步骤如下：取三次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，将脾脏夹碎，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液，将单细胞悬液和对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞液以体积比1:1的比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液。
进一步，筛选检测的具体步骤如下：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His包被至酶标板中，在温度为4℃的条件下，进行过夜培养后，用pH7.4的PBST洗涤三次，加封闭液37℃封闭2个小时后弃掉封闭液37℃烘干，将融合细胞的上清液每孔100μL加入酶标板中，在温度为36-37℃的条件下，进行温育60min后，将质量分数为0.5‰的羊抗小鼠IgG酶标二抗每孔100μL加入酶标板中，在温度为36-37℃的条件下，进行温育60min后，将TMB单组份显色液每孔100μL加入酶标板中，室温作用15-20min后，每孔加入50μL终止液，进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆。
进一步，稳定细胞株建立的具体步骤如下：将阳性克隆采用有限稀释法对检测阳性的杂交瘤细胞及时进行克隆化培养筛选阳性亚克隆，直至阳性检出率为100％，得到杂交瘤稳定细胞株。
进一步，单克隆抗体生产的具体步骤如下：采用无血清发酵培养杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清液，将上清液、Prontein A、pH为7.4的磷酸缓冲液进行混合后，加入层析柱中，用pH为7.4的磷酸缓冲液作为平衡液，用pH为4.0的柠檬酸溶液脱洗抗体，再用pH为9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH值为7.0，收集抗体，得到刺突蛋白单克隆抗体。
本发明的有益效果：本发明首先通过Skipe蛋白RBD区域序列，进行全基因合成，再以真核细胞为载体，将基因亚克隆至载体上，并将载体C端添加8*His标签，制得刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His，以刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His为抗原对6-8周龄的Balb/c小鼠进行免疫，进行3次免疫后，取小鼠免疫一周后的脾脏，制得脾脏单细胞悬浮液，并与小鼠对数期骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，进而对融合细胞进行培养，再对融合细胞进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆后，再对阳性克隆进行亚克隆，使得阳性检出率为100％，得到稳定的杂交瘤细胞株，通过对杂交瘤细胞株培养，并通过Prontein A亲和纯化，得到刺突蛋白单克隆抗体，刺突蛋白是SARS-CoV-2的表面膜蛋白，包含两个亚基S1和S2，S1主要包含一个受体结合域，负责识别细胞表面受体，S2包含膜融合所需的基本元素，S蛋白在诱导中与抗体和T细胞反应以及保护性免疫中起关键作用，因此刺突蛋白单克隆抗体能够很好的与刺突蛋白进行结合形成复合物，该复合物能够被消化或降解，进而使得SARS-CoV-2病毒失活，达到杀死SARS-CoV-2病毒的效果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
1抗原制备：将Skipe蛋白RBD区域序列，进行全基因合成，亚克隆至真核表达载体，并将表达载体C端添加8*His标签，表达纯化出的刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His；
2动物免疫：用刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His对Balb/c小鼠进行免疫，每只Balb/c小鼠每次免疫50μg，免疫3次，每次间隔时间两周；
3细胞融合：取三次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，将脾脏夹碎，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液，将单细胞悬液和对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞液以体积比1:1的比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；
4筛选检测：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His包被至酶标板中，在温度为4℃的条件下，进行过夜培养后，用pH7.4的PBST洗涤三次，加封闭液37℃封闭2个小时后弃掉封闭液37℃烘干，将融合细胞的上清液每孔100μL加入酶标板中，在温度为36℃的条件下，进行温育60min后，将质量分数为0.5‰的羊抗小鼠IgG酶标二抗每孔100μL加入酶标板中，在温度为36℃的条件下，进行温育60min后，将TMB单组份显色液每孔100μL加入酶标板中，室温作用15min后，每孔加入50μL终止液，进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；
5稳定细胞株建立：稳定细胞株建立的具体步骤如下：将阳性克隆采用有限稀释法对检测阳性的杂交瘤细胞及时进行克隆化培养筛选阳性亚克隆，直至阳性检出率为100％，得到杂交瘤稳定细胞株；
6单克隆抗体生产：采用无血清发酵培养杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清液，将上清液、Prontein A、pH为7.4的磷酸缓冲液进行混合后，加入层析柱中，用pH为7.4的磷酸缓冲液作为平衡液，用pH为4.0的柠檬酸溶液脱洗抗体，再用pH为9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH值为7.0，收集抗体，得到刺突蛋白单克隆抗体。
实施例2
一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
1抗原制备：将Skipe蛋白RBD区域序列，进行全基因合成，亚克隆至真核表达载体，并将表达载体C端添加8*His标签，表达纯化出的刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His；
2动物免疫：用刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His对Balb/c小鼠进行免疫，每只Balb/c小鼠每次免疫50μg，免疫3次，每次间隔时间两周；
3细胞融合：取三次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，将脾脏夹碎，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液，将单细胞悬液和对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞液以体积比1:1的比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；
4筛选检测：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His包被至酶标板中，在温度为4℃的条件下，进行过夜培养后，用pH7.4的PBST洗涤三次，加封闭液37℃封闭2个小时后弃掉封闭液37℃烘干，将融合细胞的上清液每孔100μL加入酶标板中，在温度为36.5℃的条件下，进行温育60min后，将质量分数为0.5‰的羊抗小鼠IgG酶标二抗每孔100μL加入酶标板中，在温度为36.5℃的条件下，进行温育60min后，将TMB单组份显色液每孔100μL加入酶标板中，室温作用18min后，每孔加入50μL终止液，进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；
5稳定细胞株建立：稳定细胞株建立的具体步骤如下：将阳性克隆采用有限稀释法对检测阳性的杂交瘤细胞及时进行克隆化培养筛选阳性亚克隆，直至阳性检出率为100％，得到杂交瘤稳定细胞株；
6单克隆抗体生产：采用无血清发酵培养杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清液，将上清液、Prontein A、pH为7.4的磷酸缓冲液进行混合后，加入层析柱中，用pH为7.4的磷酸缓冲液作为平衡液，用pH为4.0的柠檬酸溶液脱洗抗体，再用pH为9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH值为7.0，收集抗体，得到刺突蛋白单克隆抗体。
实施例3
一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
1抗原制备：将Skipe蛋白RBD区域序列，进行全基因合成，亚克隆至真核表达载体，并将表达载体C端添加8*His标签，表达纯化出的刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His；
2动物免疫：用刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His对Balb/c小鼠进行免疫，每只Balb/c小鼠每次免疫50μg，免疫3次，每次间隔时间两周；
3细胞融合：取三次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，将脾脏夹碎，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液，将单细胞悬液和对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞液以体积比1:1的比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；
4筛选检测：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His包被至酶标板中，在温度为4℃的条件下，进行过夜培养后，用pH7.4的PBST洗涤三次，加封闭液37℃封闭2个小时后弃掉封闭液37℃烘干，将融合细胞的上清液每孔100μL加入酶标板中，在温度为37℃的条件下，进行温育60min后，将质量分数为0.5‰的羊抗小鼠IgG酶标二抗每孔100μL加入酶标板中，在温度为37℃的条件下，进行温育60min后，将TMB单组份显色液每孔100μL加入酶标板中，室温作用20min后，每孔加入50μL终止液，进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；
5稳定细胞株建立：稳定细胞株建立的具体步骤如下：将阳性克隆采用有限稀释法对检测阳性的杂交瘤细胞及时进行克隆化培养筛选阳性亚克隆，直至阳性检出率为100％，得到杂交瘤稳定细胞株；
6单克隆抗体生产：采用无血清发酵培养杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清液，将上清液、Prontein A、pH为7.4的磷酸缓冲液进行混合后，加入层析柱中，用pH为7.4的磷酸缓冲液作为平衡液，用pH为4.0的柠檬酸溶液脱洗抗体，再用pH为9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH值为7.0，收集抗体，得到刺突蛋白单克隆抗体。
实施例4
将实施例1获得的毒刺突蛋白单克隆抗体名称与对应杂交瘤细胞株保持一致，具体如下表1所示；
表1
| 细胞株编号 | 细胞株编号 | 细胞株编号 | 细胞株编号 | 细胞株编号 |
| 1B7 | 3F12 | 8F5 | 32B10 | 38E4 |
| 1F2 | 4D5 | 9D10 | 32D12 | 38G1 |
| 1G11 | 4F10 | 9D9 | 32E9 | 39B6 |
| 2B4 | 5G3 | 9H3 | 32F3 | 39E8 |
| 2D1 | 5G8 | 9H8 | 36B12 | 39F4 |
| 2E10 | 6F2 | 10B2 | 36B5 | 39G1 |
| 3E11 | 7F11 | 11D2 | 36C9 | 40G8 |
实施例5
刺突蛋白单克隆抗体与辣根过氧化物酶的偶联，采用简易过碘酸钠法将单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，偶联后抗体以“细胞株编号-HRP”命名，具体步骤如下：
步骤A1：将5mg辣根过氧化物酶溶于1mL去离子束中，制得辣根过氧化物酶溶液，将241mg高碘酸钠溶于10mL去离子水中，制得高碘酸钠溶液，将辣根过氧化物酶溶液加入高碘酸钠溶液中，在转速为200r/min，避光的室温条件下，进行搅拌20min后，得到混合液a，将混合液a加入透析袋中，对1mM，pH值4.4的醋酸钠缓冲液，在温度为4℃的条件下，进行过夜透析，得到混合液b；
步骤A2：向步骤A1制得的混合液b加入20μL，0.2M,pH值9.5的碳酸盐缓冲液，使得醛化桯RP的pH值为9.5后，加入刺突蛋白单克隆抗体，在1mL，0.01M碳酸盐缓冲液中，在转速为60r/min，避光的室温条件下，进行搅拌2h，制得混合液c；
步骤A3：将4mg硼氢化钠溶于1mL去离子水中，制得硼氢化钠溶液，将硼氢化钠溶液加入混合液c中，搅拌均匀后，在温度为4℃的条件下，保温2h后，装入透析袋中，对0.15M，pH值7.4的PBS缓冲液，在温度为4℃的条件下，进行过夜透析，得到混合液d；
步骤A4：向混合液d中加入等体的饱和硫酸铵水溶液，在温度为4℃的条件下，静置1h后，在转速为3000r/min的条件下，进行离心，去除上清液，将底物用半饱和硫酸铵水溶液进行洗涤两次，将底物溶于0.15M，pH值7.4的PBS中，制得混合液e，将混合液e装入透析袋中，对0.15M，pH值为7.4的PB缓冲盐水进行透析，去除铵离子后，在转速为10000r/min的条件下，进行离心30min，去除沉淀物，将上清液进行冻干保存。
实施例6
将未标记抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后浓度为以10ng/ml的SP-RBD-His加入酶标板中37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的SP-RBD-His，在酶标板加入HRP标记后的抗体作为检测抗体，37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的标记抗体，在酶标板加入100ul的TMB显色液37℃孵育5分钟，在酶标板加入50ul的2M的硫酸终止液，用酶标仪测定OD450读数，选择阳性孔，记录对应的抗体对，此抗体对可作为检测新型冠状病毒检测试剂盒的抗体原料以及中和新型冠状病的潜在药物原料，筛选获得阳性抗体对OD450结果如下表2所示。
表2
实施例7
抗体对的检测灵敏度测试：将抗体6F2按2ug/ml包被至酶标板中作为捕获抗体，将SP-RBD-His稀释成不同浓度梯度，加入酶标板中，每孔100ul，37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的SP-RBD-His，在酶标板加入检测抗体32D12-HRP，37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的标记抗体，在酶标板加入100ul的TMB显色液37℃孵育5分钟，在酶标板加入50ul的2M的硫酸终止液，用酶标仪测定OD450读数，结果显示该抗体对利用ELISA检测灵敏度可以达到0.5ng/ml，OD450结果如下表3所示；
表3
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
1抗原制备：将Skipe蛋白RBD区域序列，进行全基因合成，亚克隆至真核表达载体，并将表达载体C端添加8*His标签，表达纯化出的刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His；
2动物免疫：用刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His对Balb/c小鼠进行免疫，每只Balb/c小鼠每次免疫50μg，免疫3次，每次间隔时间两周；
3细胞融合：取第三次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾细胞分离成单细胞悬液，与处于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:1比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液；
4筛选检测：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His包被至酶标板中，对融合后的细胞上清进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆；
5稳定细胞株建立：对阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，得到杂交瘤稳定细胞株；
6单克隆抗体生产：采用无血清发酵培养杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用Prontein A亲和纯化单克隆抗体，制得刺突蛋白单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的Skipe蛋白RBD区域序列：RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNHHHHHHHH。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：动物免疫的具体步骤如下：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His和弗氏完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第一混合液，用混合液对6-8周龄的Balb/c小鼠进行皮下注射，每次注射位点个数为6-8个，每次注射量为50μg，得到初次免疫小鼠，将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His和弗氏不完全佐剂以质量比1:1的比例进行混合，制得第二混合液，用第二混合液对初次免疫两周后的小鼠重复免疫2次，每次间隔两周。
4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：细胞融合的具体步骤如下：取三次免疫后1周的小鼠脾脏，将小鼠脾脏放入盛有5mLDMEM液的培养皿中，将脾脏夹碎，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液，将单细胞悬液和对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞液以体积比1:1的比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合，融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液。
5.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：筛选检测的具体步骤如下：将刺突蛋白受体结合域SP-RBD-His包被至酶标板中，在温度为4℃的条件下，进行过夜培养后，用pH7.4的PBST洗涤三次，加封闭液37℃封闭2个小时后弃掉封闭液37℃烘干，将融合细胞的上清液每孔100μL加入酶标板中，在温度为36-37℃的条件下，进行温育60min后，将质量分数为0.5‰的羊抗小鼠IgG酶标二抗每孔100μL加入酶标板中，在温度为36-37℃的条件下，进行温育60min后，将TMB单组份显色液每孔100μL加入酶标板中，室温作用15-20min后，每孔加入50μL终止液，进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆。
6.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：稳定细胞株建立的具体步骤如下：将阳性克隆采用有限稀释法对检测阳性的杂交瘤细胞及时进行克隆化培养筛选阳性亚克隆，直至阳性检出率为100％，得到杂交瘤稳定细胞株。
7.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：单克隆抗体生产的具体步骤如下：采用无血清发酵培养杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清液，将上清液、Prontein A、pH为7.4的磷酸缓冲液进行混合后，加入层析柱中，用pH为7.4的磷酸缓冲液作为平衡液，用pH为4.0的柠檬酸溶液脱洗抗体，再用pH为9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH值为7.0，收集抗体，得到刺突蛋白单克隆抗体。
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