CN105925538B - 杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用。该杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株3G8.1，保藏编号为C201635。抗合成大麻单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。抗合成大麻单克隆抗体在制备合成大麻检测试剂盒中的应用；或上述抗合成大麻单克隆抗体在制备检测合成大麻的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。本发明利用合成大麻免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗合成大麻的单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对合成大麻进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及抗合成大麻的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。
背景技术
合成大麻为一种新型毒品，名为K2的合成草药也被称为“香料”、“精灵”和“佐海”(Zohai)，在吸食后会产生与大麻相若的兴奋反应。
目前市面上主要有4种合成大麻成分：JWH-018、JWH-073、HU-210、CP47,497等共4种。香港、台湾报道查获的以JWH-018为主。
JWH-018中文名称1-戊基-3-(1-萘甲酰基)吲哚，英文名称1-Pentyl--3-(1-naphthoyl)indole，分子式C24H23NO，分子量341.4455，CAS RN 209414-07-3。所述JWH-018的分子结构式如式(Ⅰ)所示，大麻的结构如式(II)所示。
Figure BDA0000991805530000011
JWH-018最初是由Clemson University的John W.Huffman合成的大麻同型物。JWH-018(类似于THC)，可以使人兴奋，开心以及全身放松等效果。比起传统四氢大麻酚(THC)，JWH-018在作用于CB1的同時，更能刺激CB2，因此不但能比四氢麻酚(THC)快速4倍起作用，强度更能加强4-10倍。2008年12月15日，德国著名药物公司THC Phram将JWH-018与其他草药混合作为焚香销往全球。
JWH-073中文名称：1-丁基-3-(1-萘甲酰基)吲哚，英文名称：1-Butyl-3-(1-naphthoyl)indole or(1-Butyl-1H-indol-3-yl)-1-naphthalenylmethanone分子式：C23H21NO,分子量：327.42,CAS RN 208987-48-8。所述JWH-073的分子结构式如式(III)所示。
Figure BDA0000991805530000021
作为JHW家族之一，它与JHW-018一样，作用于大麻受体CB1、CB2(其中作用于CB2约是CB1的5倍)起到致幻作用。
通过杂交瘤技术可以制备抗合成大麻抗原杂交瘤细胞株。通过此杂交瘤细胞株制备出的抗体可以用于制备胶体金免疫诊断试纸条,实现了在现场对吸毒人员快速检测的要求。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种抗合成大麻的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗合成大麻的抗体，能够特异结合JHW-018和JWH-073。
一种分泌抗合成大麻的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株3G8.1，已于2016年3月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.C201635；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。
本发明采用小剂量肌肉注射免疫方法和尾静脉免疫相结合的方法，用合成大麻抗原JWH-018-BGG注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，用JWH-018筛选从而获得所述杂交瘤细胞株。
JWH-018本身的分子量太小，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对JWH-018进行化学修饰，偶联BGG(牛血清丙种球蛋白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原。
每次注射时，JWH-018-BGG的用量为10μg。
采用小剂量肌肉注射免疫方法和尾静脉免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价高。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测合成大麻的试纸条中的应用。
本发明的第二个目的是提供了一种抗合成大麻单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。该抗体为IgG1型,轻链为kappa型。
本发明的第三个目的是提供了所述抗合成大麻单克隆抗体在制备合成大麻检测试剂盒中的应用；或上述抗合成大麻单克隆抗体在制备检测合成大麻的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。
进一步地，所述的用于检测合成大麻的胶体金免疫诊断试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗合成大麻的单克隆抗体，所述反应膜的检测线(T线)处包被有合成大麻-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。
本发明的试纸条也是以竞争抑制原理制备的，合成大麻-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗合成大麻单克隆抗体对合成大麻的检测限为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有JWH-018或JWH-073且检测合成大麻的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中JWH-018和JWH-073的含量低于检测限，或待测样品中无JWH-018和JWH-073；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明利用JWH-018-BGG免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗合成大麻的单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对JWH-018和JWH-073进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
说明书附图
图1为本发明一种合成大麻胶体金检测试纸条的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1杂交瘤细胞株的制备
(1)小鼠免疫
选择8周龄的BALB/c雌鼠用JWH-018-BGG 10μg与quick antibody-5w佐剂等体积混合成100μl，注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；两周后同样方式注射第2针；再2周后，用10μg抗原进行腹腔注射。
(2)制备淋巴细胞
取经步骤(1)处理的BALB/c雌鼠的脾脏，研磨脾脏细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入含有15％胎牛血清的IMDM培养基，调整淋巴细胞至10ml。
(3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合：
(3-1)饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75％酒精中消毒10min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL 37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；1500rpm下离心3min，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。
(3-2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10％的FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代，以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。
(3-3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL 37℃预温的1mL PEG 1450，边加边轻微摇动；加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤(3-1)制备的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(4).杂交瘤细胞的融合筛选
(4-1)初筛：
步骤(3-3)中融合细胞在5％CO2培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液，继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
间接ELISA方法的操作步骤是：
①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释JWH-018-BGG至1μg/mL，96孔酶标板每孔中分别加入100μl稀释后的抗原，4℃包被过夜，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
④每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；
⑤加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，以融合细胞培养上清液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步地用竞争抑制ELISA方法进行复筛。
(4-2)复筛：
竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：
①将50μl浓度为50ng/ml的JWH-018标准品加入酶标孔中，再加入阳性克隆培养上清液同时设计空白对照，即先加入50μl PBS缓冲液再加入50μl阳性克隆培养上清液到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃下孵育30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
③每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；
④加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，计算竞争抑制率，结果如表1所示。
竞争抑制率的计算式为：
Figure BDA0000991805530000061
表1各杂交瘤细胞株的竞争抑制ELISA结果
细胞株 对照OD值 竞争抑制OD值 竞争抑制率
1A3 0.961 0.626 34.86％
1B12 0.275 0.057 79.27％
1D5 0.887 0.476 46.34％
1G7 0.554 0.054 90.25％
2B5 0.586 0.044 92.49％
2C1 0.553 0.067 87.88％
2H10 0.871 0.631 27.55％
3C2 0.732 0.068 90.71％
3F8 0.762 0.116 84.78％
3G8 1.417 0.059 95.84％
4B5 0.465 0.061 86.88％
5B9 0.735 0.087 88.16％
6F11 1.033 0.709 31.36％
7H1 0.607 0.085 86.00％
8A6 0.859 0.046 94.64％
由表1可见，杂交瘤细胞株3G8的竞争抑制率最高，故挑取杂交瘤细胞株3G8做克隆培养。
(4-3)杂交瘤细胞株3G8的克隆化
杂交瘤细胞株3G8的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15％的FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，再次做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100％；然后挑取单克隆细胞，命名为3G8.1，扩大培养后进行抗合成大麻单克隆抗体纯化。
(5)抗合成大麻单克隆抗体纯化
取扩大培养后的杂交瘤细胞株3G8.1，接种1×106细胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取12ml腹水，用2倍体积的PBS稀释，再加入3倍体积的饱和硫酸铵，将得到混合液离心，取沉淀。沉淀用pH7.4的PBS溶解，然后用pH7.4的PBS透析过夜4次。收集抗体溶液，过滤。用OD280测定蛋白含量,蛋白浓度为4.85mg/ml。
实施例2抗合成大麻单克隆抗体的反应活性测试
采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗合成大麻单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释JWH-018-BGG抗原至50ng/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的抗原，4℃包被过夜；
②用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗合成大麻单克隆抗体溶液，做1:3稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB 37℃反应8分钟后，浓度为2M的H2SO4终止反应，450nm测定其OD值，以抗合成大麻的单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值；检测结果见表2。
表2不同浓度下抗合成大麻单克隆抗体的OD450值
Figure BDA0000991805530000071
Figure BDA0000991805530000081
由表2可见，实施例1制备的抗合成大麻单克隆抗体反应活性可以到达0.0003μg/ml。
实施例3
如图1所示，本实施例一种合成大大麻胶体金检测试纸条，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接在底板上。其中，胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例1制备的抗合成大麻单克隆抗体，硝酸纤维素膜的检测线(T)处包被有合成大麻-牛血清白蛋白复合物，质控线(C)处包被有羊抗鼠IgG。试纸条的制备方法为本领域的常规方法。
检测时，室温下将试纸条样品垫的一端插入待测样品中，注意待测样品的液面不要超过试纸条上的MAX线；肉眼观察，并记录C线和T线的显色情况。
若只有C线显色，表示待测样品中含有JWH-018或JWH-073且检测合成大麻的含量高于50ng/ml；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测JWH-018或JWH-073的含量低于50ng/ml；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种抗合成大麻单克隆抗体在制备用于检测JWH-018和JWH-073试剂盒中的应用，上述抗合成大麻单克隆抗体由杂交瘤细胞株3G8.1或其传代细胞株分泌产生,该杂交瘤细胞株3G8.1保藏编号为 CCTCC No.C201635；在制备杂交瘤细胞株过程中采用的抗原是合成大麻抗原JWH-018-BGG。
2.一种抗合成大麻单克隆抗体在制备用于检测JWH-018和JWH-073胶体金免疫诊断试纸条中的应用，上述抗合成大麻单克隆抗体由杂交瘤细胞株3G8.1或其传代细胞株分泌产生,该杂交瘤细胞株3G8.1保藏编号为 CCTCC No.C201635；在制备杂交瘤细胞株过程中采用的抗原是合成大麻抗原JWH-018-BGG。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于检测阈值均能达到50ng/ml以下。
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