CN109810948B - 抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体 - Google Patents

抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体 Download PDF

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本发明公开了一种分泌抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株为6A4，7F5，7G3或其传代细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.16681。由杂交瘤细胞株6A4，7F5，7G3分泌的单克隆抗体分别为MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3。本发明的杂交瘤细胞株能够分泌稳定的非洲猪瘟病毒K205R蛋白抗体，其分泌的单克隆抗体具有高的效价，且亚类单一，能够特异性的和非洲猪瘟K205R蛋白反应，特异性好，可用于检测早期的非洲猪瘟病毒。

Description

抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其 分泌的抗体
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种分泌抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体。
背景技术
非洲猪瘟（Africa Swine Fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒(Africa Swine FeverVirus,ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，属于动物疫病。1921年，Montgomery首次报道在非洲的肯尼亚发生非洲猪瘟疫情，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生扩散流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。
虽然感染非洲猪瘟后能够产生特异性抗体，但由于非洲猪瘟病毒基因型众多，而不同基因型之间的毒株不能产生免疫保护，所以迄今为止，还没有非洲猪瘟病毒的有效疫苗。目前该病的防控主要依靠严格的动物处理实现，因此建立有效快速的诊断方法尤为重要。
研究表明，非洲猪瘟病毒是一种双链DNA虫媒病毒，病毒基因组长170-190kb，有150多个开放阅读框，能够编码150-200个蛋白，其中K205R是一种大约33 kDa的蛋白质，它是在病毒感染4小时后产生的，在感染6h后，K205R蛋白在细胞的细胞质中扩散，这对检测是否存在持续感染提供了重要的依据，为后期建立非洲猪瘟诊断技术提供基础。K205R作为一种感染早期出现的抗体，对非洲猪瘟病毒的早期诊断具有着重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分泌抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于诊断早期非洲猪瘟病毒引起的感染。
本发明采用的技术方案是：
一种分泌抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其能够分泌稳定的非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。所述杂交瘤细胞株为6A4，7F5，7G3或其传代细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体细胞株，保藏日期为：2018年10月11日，保藏号为：CGMCC No.16681，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述的杂交瘤细胞株是由非洲猪瘟病毒K205R蛋白免疫小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得的。
本发明进一步提供了由上述保藏号为CGMCC No.16681的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株6A4，7F5，7G3分泌的单克隆抗体分别为MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3，单抗MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3的效价分别可以达到 1:2900，1:21200和1:21000，实验测得三种单克隆抗体均为IgG1亚类。
选用杂交瘤细胞株7F5分泌的单抗MAb7F5与全病毒抗原反应时，全病毒抗原的稀释倍数为1:1000，MAb7F5的稀释倍数为1:400时，抗体效价达到最高。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明的杂交瘤细胞株6A4，7F5，7G3或其传代细胞株具有稳定分泌非洲猪瘟病毒K205R蛋白抗体的特性，其分泌的单克隆抗体MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3的效价分别可以达到 1:2900，1:21200和1:21000，效价高；单抗亚类均为IgG1，亚类单一；且该单克隆抗体能够特异性的和非洲猪瘟K205R蛋白反应，特异性好。
附图说明
图1是本发明实施例2提供的Western Blot方法测定杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体特异性的结果图。
图2是本发明实施例2提供的单克隆抗体的亚类鉴定结果图。
图3是本发明实施例2提供的间接ELISA方法鉴定单克隆抗体稳定性的结果图。
图4是本发明实施例2提供的间接ELISA方法测定单克隆抗体与全病毒抗原反应性的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
分泌抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的获得及其分泌的单克隆抗体的制备
1、抗原制备
根据NCBI GeneBank登录的ASFV BA71V株K205R的基因序列，登录号为：NC_001659.2 (46092..46709) 长617bp。经武汉金开瑞公司合成后，构建到pET-28a表达载体，经表达纯化得到目的蛋白。蛋白主要以包涵体的形式表达，复性后-20℃保存备用。
2、动物免疫
用纯化且复性后备用的K205R蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠。按照80µg/只的蛋白剂量与弗氏完全佐剂混合，再用乳化器充分乳化后背部皮下三点注射到小鼠体内；两周后选用等剂量的蛋白和弗氏不完全佐剂混合乳化后，采用相同方法注射到小鼠体内；再经过两周后进行第三次免疫实验，所用试剂的剂量和方法与前述相同。
3、细胞融合
融合前3天腹腔注射加强免疫，融合前1天取两只健康小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞板上作为滋养层细胞待用。将SP2/0细胞和免疫后小鼠的脾细胞按照1:3-1:5采用50%PEG1500进行融合。用HAT培养基重悬细胞后，铺到前一天加好滋养层细胞的96孔板中。
4、筛选阳性克隆
细胞融合后第6天用HT培养基半换液，第10天镜检观察记录有融合的细胞孔并选择1-3个细胞克隆的细胞孔，然后通过间接ELISA方法检测挑选出有1-3个克隆的细胞孔的细胞培养上清液。
5、阳性杂交瘤细胞的亚克隆
筛选阳性孔细胞，将其吹起后分别转移至24孔细胞板中，4d后将ELISA检测阳性转移至6孔细胞板中，待细胞生长至细胞孔1/4-1/2时，将ELISA检测阳性孔进行细胞计数后，取100个细胞用DMEM完全培养基稀释，亚克隆至96孔细胞板。同理进行第二次和第三次亚克隆，以保证能够得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选择阳性率为100%的细胞。筛选出高分泌特异性的杂交瘤细胞株6A4，7F5，7G3或其传代细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体细胞株，保藏日期为：2018年10月11日，保藏号为：CGMCC No.16681，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，将6A4，7F5，7G3分泌的单克隆抗体分别命名为MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3。
6、腹水制备
取8周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射300µL灭菌的液体石蜡，7d后按照1×106个/只的剂量腹腔注射杂交瘤细胞。5d后仔细观察小鼠腹部，待其腹部肿大且触摸有波动感后收集腹水，腹水收集后离心除去杂质，然后用450µm滤器过滤，再从1:1000倍开始，2倍稀释测试抗体效价，并于-70℃保存。
实施例2
单克隆抗体鉴定
1、单克隆抗体腹水效价测定
采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的腹水效价，具体测试方法如下：
（1）包被抗原：用ph=9.6的碳酸氢盐缓冲液将重组蛋白进行稀释，终浓度为20µg/mL，取100µL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；
（2）洗板：用PBST溶液洗板，280µL/孔洗5次；
（3）封闭：加入5%的脱脂乳，100µL/孔，37℃温箱封闭1h；
（4）洗板：用PBST溶液洗板，280µL/孔洗5次；
（5）孵一抗：拍干净板后，将腹水从1:1000开始倍比稀释，以免疫后阳性小鼠的血清为阳性对照，以SP2/0细胞上清为阴性对照，37℃温箱孵育1h；
（6）洗板：用PBST溶液洗板，280µL/孔洗5次；
（7）孵二抗：将HRP标记的抗小鼠的二抗1:5000倍稀释后，100µL /孔加入酶标板，37℃温箱孵育1h；
（8）洗板：用PBST溶液洗板，280µL/孔洗5次；
（9）显色：拍干板后，加入100µL/孔TMB底物进行显色，37℃显色8min；
（10）终止：加入50µL/孔的2MH2SO4终止显色；
（11）测OD450值，用酶标仪测定450nm处的吸收光值。
测定结果如表1所示：
表1 单克隆抗体腹水效价测定值
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，单克隆抗体MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3的效价分别可以达到 1:2900，1:21200和1:21000。
2、单克隆抗体的特异性鉴定
分别使用Pet-28a-K205R蛋白和Pet-28a-P30蛋白作为抗原，煮沸变性后，进行SDS-PAGE，电泳完成后取下蛋白胶，使用半干法转移到NC纤维素膜上，用5%的脱脂乳4℃封闭过夜，以单克隆抗体作为一抗，室温震荡孵育2h，以HRP标记的山羊抗小鼠的抗体为二抗，室温震荡孵育1h后用ECL化学发光底物进行孵育，孵育10min后洗去显色液。
结果如图1所示，从图中可以看出，本发明所获得的单克隆抗体与非洲猪瘟病毒Pet-28a-P30蛋白不发生反应，而在非洲猪瘟K205R蛋白处可见到特异性反应条带，说明所获得的单抗可与非洲猪瘟K205R蛋白特异性结合。
3、单克隆抗体的亚类鉴定
使用购自北京博奥龙公司的抗体亚类鉴定试剂盒进行单抗亚类鉴定，将试剂盒恢复室温，每孔先加50μL样品稀释液，然后加50μL细胞培养上清液，每个样本加6个孔，阴阳性对照各6孔，加入100μL样品稀释液，37℃孵育30min；洗板后在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗各100μL，通用阳性、阴性对照的各孔也一样，37℃温育30min；洗板后每孔分别加入显色剂 A 和显色剂 B 各50μL，避光37℃显色20min，每孔加50μL终止液终止反应。结构如图2所示，表明单克隆抗体MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3的亚类均为IgG1。
4、单克隆抗体的稳定性鉴定
将筛选到的阳性杂交瘤在相同条件下培养20代，分别于第1 、5、10、12、14、16、18和第20代使用间接ELISA方法测定其细胞上清OD450值，分析其分泌抗体的稳定性。测定结果如图3所示，图3表明，本发明杂交瘤细胞株分泌的单抗MAb6A4、MAb7F5和MAb7G3均具有良好的稳定性。
、单克隆抗体与全病毒抗原反应性鉴定
选择杂交瘤细胞株7F5单抗腹水与西班牙参考实验室赠送的全病毒抗原进行反应，将全病毒抗原1:1000稀释后，4℃过夜包被；用PBS将7F5单抗作为一抗从1:100开始进行2倍稀释，37℃孵育1h；将HRP标记的山羊抗鼠的二抗1:10000倍稀释，37℃孵育1h；TMB室温显色10min；使用1M H2SO4终止反应后，测定OD450值。测定结果如图4所示，图4表明，选用的杂交瘤细胞株7F5分泌的单抗MAb7F5能够与全病毒抗原发生良好的反应，在1:400倍稀释时，抗体效价达到最高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种分泌抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2018年10月11日，保藏号为：CGMCC No.16681。
2.一种抗非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。
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