CN112481220B

CN112481220B - 抗非洲猪瘟病毒解旋酶d1133l单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

Info

Publication number: CN112481220B
Application number: CN202011206761.4A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 张克山; 侯景; 申超超; 张婷; 冯涛; �田宏; 杨帆; 朱紫祥; 茹毅; 党文; 李丹; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2040-11-03
Also published as: CN112481220A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明采用小鼠腹腔培养和体外细胞培养杂交瘤细胞7D12制备单克隆抗体，效价测定检测结果表明，本发明杂交瘤细胞株7D12所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水抗体效价为10⁷，杂交瘤细胞培养上清的效价达到1:1280。本发明制备的单克隆抗体为研究ASFV解旋酶功能及其分子机制积累了关键性的生物学材料，基于该单克隆抗体本身生物学特性建立的间接免疫荧光抗原检测方法为ASFV精准、快速诊断提供了支撑，本发明制备的单克隆抗体能显著抑制或者阻断ASFV复制为ASFV预防和治疗提供了可能的产品支持。

Description

抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及该杂交瘤细胞株和单克隆抗体的应用。

背景技术

非洲猪瘟(ASF virus)是由非洲猪瘟病毒所致的一种烈性动物传染病，主要感染猪，发病率和死亡率高达100％。其他宿主动物也可携带该病毒(软蜱)。临床上表现为高温、皮肤发绀、结膜出血、腹水，并伴有呼吸障碍和神经症状，发病率、死亡率均达100％；主要的储存宿主为脾脏，发病猪脾脏比正常猪脾脏大很多倍。当病变广泛而严重时，猪群生长受阻，需要进行扑杀，导致严重经济损失。同其他痘病毒一样，ASFV进化而来的免疫逃避机制能帮助病毒在宿主免疫防御条件下生存，形成持续性感染。同时ASFV不同毒株间抗原/免疫靶标多样性促进了病毒能反复感染同一宿主。

ASFV属于非洲猪瘟病毒科，亦是唯一成员，是一种双链线性DNA病毒。电镜下观察负染标本中，病毒粒子大小200nm，外有脂类囊膜，内有双股DNA核心，病毒粒子呈20面体，对应有l892～2172个壳粒(每个壳粒直径为13nm)，中心有1孔，呈六棱镜状，壳粒间的距离为7.4nm～8.1nm。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小170kb～ 190kb。整个基因组含有151个ORF，可以编码150～200种蛋白质，其中包含5个解旋酶，分别被命名为D1133L、B962L、QP509L、Q706L、A589L，均属于解旋酶超家族II家族成员。研究证明ASFV的5个解旋酶当中QP509L和Q706L属于解旋酶超家族IIDEXH/D-box家族中DEAD-box家族成员，并通过基因序列分析间接证明了D1133L为该家族成员。序列分析表明不同ASFV毒株间5个解旋酶的序列相对保守。D1133L基因位于ASFV基因组中心片段上，与BQ96R间隔40kb左右，该基因在病毒DNA开始复制12h后复制，为晚期基因，能够编码产生125.847kDa蛋白。

ASF感染常可通过典型的临床症状和流行情况作出初步诊断。但是ASF常与经典猪瘟临床症状相似而相混淆。在此种情况下，实验室诊断非常必要。因此确诊需要通过电镜负染、血清学方法、病理组织病理学，PCR检测和限制性片段长度多态性分析(RFLP)以及动物接种等方法进行进一步的实验室检验。研究证实了这些方法的可行性，然而，这些检测方法在应用时或多或少会受到一些限制，难以及早检测病原，也不利于大规模的流行病学调查；目前国内外也没有用于血清学检测的免疫检测试剂盒；分子生物学方法特异性高、结果确实，但对实验条件及操作人员的要求较高，因此多用于实验室研究，很难进入临床应用阶段。酶免疫测定技术将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机结合起来，具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备要求不高、成本低、操作简便快捷、无放射性污染、自动化程度高、试剂保存时间长等优点，适用于大批量现地检测工作，将可能成为极具推广价值的诊断方法。随着ASFV对养猪业造成的损失逐年增大，广泛地开展ASFV监测已不可避免，现在还没有适合全世界通用的ASF检测标准。在没有ASFV商品化疫苗的背景下，研制检测非洲猪瘟的 IFA和ELISA诊断试剂盒对该病的疫情监测、流行病学调查及完善免疫策略等都具有重要意义。

发明内容

本发明发现非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L对非洲猪瘟病毒的复制是必须的。本发明采用 crispercas9基因编辑技术敲除了ASFV的D1133L基因，IFA结果表明，D1133L基因敲除以后ASFV无法复制并且不能存活。将针对D1133L基因序列的Si-RNA干扰序列干扰ASFV 的D1133L基因后，Q-RT-PCR结果表明干扰D1133L基因后显著抑制ASFV复制。

另外，本发明过表达D113L蛋白，通过Luciferase和Western blot检测，结果表明D1133L 可抑制宿主天然免疫核因子NF-κB。

上述的解旋酶D1133L的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

基于上述发现，本发明提供了分泌抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L单克隆抗体的杂交瘤细胞株，具体的，采用大肠杆菌表达的非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L蛋白，纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合(5:1)，经筛选获得1株稳定分泌抗D1133L蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株7D12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是：CCTCC NO:C2020180。

本发明将上述的杂交瘤细胞株7D12接种至小鼠腹腔，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，去除上层油脂和沉淀，得到小鼠腹水抗体，该抗体即为抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L单克隆抗体。

本发明将杂交瘤细胞株7D12接种至含有20％的FBS和1％抗生素的DMEM培养基培养，分离细胞，收集细胞培养基上清，得到单克隆抗体，该抗体即为抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L 的单克隆抗体。经检测发现上述该单克隆抗体的亚型为IgG1。

抗体的效价测定结果表明，本发明杂交瘤细胞株诱导小鼠产生的腹水抗体效价为10⁷，杂交瘤细胞培养上清的效价达到1:1280。

本发明的另外一个目的是将杂交瘤细胞株7D12或者上述的单克隆抗体在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒抗原感染试剂中进行应用。

本发明的再一个目的是将上述单克隆抗体在制备ASFV抑制剂中进行应用。

本发明还提供一种包含上述单克隆抗体的试剂盒。

本发明的有益效果：

本发明通过Q-RT-PCR和IFA研究发现，抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L的单克隆抗体可剂量依赖抑制ASFV复制，因此，可将该单克隆抗体可用于制备ASFV抑制剂。

此外，Western blot检测结果表明，本发明单克隆抗体能与ASFV抗原特异性结合。IFA 结果表明，杂交瘤细胞培养上清能与ASFV感染的PAM细胞发生反应，在荧光显微镜下可见到荧光信号，说明本发明获得的McAb能与ASFV发生特异反应。单克隆抗体的特异性试验结果表明，本发明单克隆抗体具有良好的特异性，仅与ASFV发生反应，而与FMDV、SVV、 CSFV不发生反应。因此，可将该单克隆抗体用于制备诊断或检测非洲猪瘟病毒抗原感染试剂，用于检测ASFV。总的来说，本发明制备的单克隆抗体为研究ASFV解旋酶功能及其分子机制积累了关键性的生物学材料，基于该单克隆抗体本身生物学特性建立的间接免疫荧光抗原检测方法为ASFV精准、快速诊断提供了支撑，本发明制备的单克隆抗体能显著抑制或者阻断ASFV复制，为ASFV预防和治疗提供了可能的产品支持。

本发明抗体的效价测定结果表明，本发明杂交瘤细胞株诱导小鼠产生的腹水抗体效价为 10⁷，杂交瘤细胞培养上清的效价达到1:1280。

附图说明

图1为Luciferase和Western blot检测D1133L抑制核因子NF-κB的结果图。图1A为Luciferase 检测结果图，横坐标表示不同蛋白，其中vec表示对照，其中D1133L表示D1133L蛋白，纵坐标表示NF-κB的转化水平；图1B表示Western blot检测结果图。

图2A为crispercas9敲除D1133L示意图，B为间接免疫荧光试验验证结果图。

图3为应用Q-RT-PCR分析Si-RNA干扰D1133L后对ASFV复制的抑制情况图。

图4为D1133L蛋白在大肠杆菌中表达形式检测图。图中1为上清，2为沉淀，3为Marker。

图5为D1133L蛋白的分离纯化结果图。

图6为本发明单克隆抗体亚型鉴定结果图。

图7为Western blot分析ASFV感染PAM细胞后裂解物的单克隆抗体反应性检测结果图； M：预染蛋白质分子量；1：PAM细胞裂解产物，2：ASFV感染PAM细胞后裂解产物。

图8为间接免疫荧光检测单克隆抗体与ASFV临床分离株反应性结果图。A1为7D12杂交瘤细胞培养上清与ASFV感染的PAM细胞混合后，红色荧光标记二抗594nm显色图，A2和B2为PAM细胞的细胞核DAPI染色图；B1为7D12杂交瘤细胞培养上清与正常PAM细胞混合后染色图。

图9为本发明单克隆抗体抑制ASFV复制情况的检测结果图。其中：

图9A为Q-RT-PCR结果图；图9B从左至右依次为Mock、10μM、20μM、40μM、80μM 4个杂交瘤细胞7D12培养上清剂量作用图。第一行为红色荧光标记二抗594nm显色图；第二行为绿色荧光标记二抗488nm显色图，第三行为PAM细胞的细胞核DAPI染色图；第四行Merge为合并图。

保藏信息：

保藏时间：2020年9月20日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:C2020180；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学；

分类命名：杂交瘤细胞株7D12。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细叙述。

本实施例所用毒种、细胞、实验动物和生化试剂的来源：

(1)重组Pet28a-D1133L、SP2/0细胞均由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队保存(制备方法参考：杨旻.恶性骨肿瘤侧群(SP)细胞的分离,鉴定及生物学特性研究[D].2011.Yun-Gang Z,Ju-Lun Y,Li W.Construction of prokaryoticexpression plasmid PET-28a(+)-Ha-Ras and expression and purification ofp21ras[J].The Journal of Practical Medicine,2007.)

(2)ASFV毒株由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队分离并保存于国家非洲猪瘟区域实验室(中国.兰州)；

(3)8周龄实验用雌性BALB/c小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心；

(4)标准胎牛血清、改良型培养基RPMI-1640购于Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、选择性培养基HAT和HT、细胞融合用PEG(MW4000)、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HRP-IgG)购于Sigma公司。HRP标记Alexa 山羊抗鼠IgG二抗(波长594为红色荧光)和HRP标记Alexa山羊抗兔IgG二抗(波长488 为绿色荧光)购自购于Proteintech公司。

实施例1解旋酶D1133L抑制宿主细胞核因子NF-κB

将1×10⁶的293t细胞铺于6孔板当中，37℃，5％CO₂放置2h，用脂质体2000剂量依赖转染的D1133L过表达质粒(该过表达质粒是将D1133L基因插入pCDNA3.1质粒多克隆位点的BamHI和EcoRI之间制备而得)，转染24h后，用TNF-α刺激12h，Luciferase和Western blot常规检测NF-κB。

如图1A所示，与对照vec相比，D1133L蛋白抑制了NF-κB的转化水平；图1B表示在蛋白水平，随着D1133L用量的增加，NF-κB表达量逐渐减小。总的来说，D1133L剂量依赖抑制核因子NF-κB。

实施例2非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L对非洲猪瘟病毒复制的必要性

2.1、敲除解旋酶D1133L基因ASFV无法复制

利用crispercas9内源性敲除D1133L基因，按照图2A所示构建框架，根据同源重组原理，形成缺失D1133L基因的ASFV。

将1×10⁶PAM细胞铺于6孔板，37℃，5％CO₂放置2h，转染1μg D1133L敲除质粒后接入0.1M的ASFV，每2天盲传一代病毒，传至第9代时通过间接免疫荧光试验验证了缺失D1133L基因的ASFV毒株和WT-ASFV。

如图1B所示，间接免疫荧光试验结果显示缺失D1133L基因的ASFV毒株组几乎无荧光，这表明ASFV缺失D1133L基因后ASFV无法复制，不能存活。

2.2、Si-RNA干扰D133L显著抑制ASFV复制

通过NCBI检索D1133L序列，利用snap gene分析软件设计Si-RNA干扰序列 (Si-RNA-negetive control fam:forward primer 5′-UUCUCCGAACGΜGUCACGUTT-3′和R: 5′-ACGΜGACACGUUCGGAGAATT-3′；Si-RNA-1067fam:forward primer 5′-CCAUCAAGGGUCUCCAAUUTT-3′和R:5′-AAUΜGGAGACCCUΜGAΜGGTT-3′)，并在上海吉玛基因公司合成。

将1×10⁶PAM细胞铺于6孔板当中，37℃，5％CO₂放置2h，用Poly Plus原代转染1μg的 Si-RNA后接入0.1M的ASFV，12h后收样，Q-RT-PCR常规检测。检测结果如图2所示，Si-RNA干扰D1133L基因后ASFV的复制被显著抑制。

上述结果表明，解旋酶D1133L基因对于ASFV复制是必须的，不可缺少的。

实施例3单克隆抗体的制备

3.1、重组蛋白的纯化与检测

培养诱导后表达D1133L蛋白的基因工程菌(重组Pet28a-D1133L)，收集细胞，破碎，分别收集上清和沉淀，电泳检测结果如图4所示，收集的沉淀中出现D1133L蛋白条带，说明D1133L蛋白为包涵体表达。

将诱导后表达D1133L蛋白的基因工程菌(重组Pet28a-D1133L)在37℃200rpm振荡培养5h后收获菌液，5000g离心10min，加10mL的PBS。重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解(30％功率)裂解3s、间隔15s、超声40min。然后10000g离心20min，弃上清液，保留细胞沉淀。利用GE公司的镍柱HIS纯化系统对重组蛋白进行纯化，操作过程如下：

①将细胞沉淀用buffer B重悬，室温下小心震荡60min使其裂解至透明清亮，避免泡沫。

②10000g离心30min，弃掉沉淀，将上清转另一离心管中。

③将1ml 50％NI-NTA树脂悬浮加到4ml细胞裂解液中，轻柔混匀，室温结合60min。

④将裂解液与NI-NTA树脂悬浮的混合物小心加入下端封闭的空柱后，除去柱下端封闭盖子，收集流出液，保存用于SDS-PAGE分析。

⑤用4ml buffer C漂洗杂蛋白2次，保存漂洗组分用于SDS-PAGE分析。

⑥以0.5ml buffer D洗脱目的蛋白4次，再以0.5ml buffer E洗4次，收集组分，用于SDS-PAGE 分析。

如图5所示，纯化后的D1133L蛋白具有较高的纯度、蛋白得率比较高。

3.2、免疫小鼠

以纯化的D1133L蛋白作为免疫原，对10周龄雌性BALB/c小鼠进行3次免疫。免疫方案如下：首免，每只小鼠用50μg D1133L蛋白与等量FCA混合制成乳化剂，颈背部皮下多点和腹腔注射；二免，于首免后2周进行，将FCA换成FICA，剂量和方法同上；三免，于二免后 2周进行，剂量和方法同二免。细胞融合前1周进行加强免疫，方法是腹腔注射100μg纯化的D1133L蛋白。

3.3、细胞融合

在免疫小鼠加强免疫后3～5天进行细胞融合结果比较好。细胞融合步骤如下：按照常规方法取BALB/c阴性小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死阳性小鼠，无菌取其脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞5:1的比例用PEG4000进行融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上(Kohler G,Milstein C.Continuous cμLture offused cells secreting antibody of predefined specificity.[J].Nature,1975,256(5517):495-497)。

3.4、细胞株的筛选及亚克隆

取纯化的D1133L蛋白以1μg/孔包被聚苯乙烯板，37℃，3h；PBST(0.01mol/L,pH7.3, PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次，5min/次；加PBST/BSA(0.01mol/L,pH 7.3,PBST+2％BSA)， 200μL/孔，37℃封闭2h或4℃过夜；PBST洗3次，5min/次，拍干，-20℃存放备用。通过方阵试验确定抗原的最佳稀释倍数，即将ASFV D1133L蛋白包被96孔板，进行方阵滴定试验，获得抗原的使用浓度及原核表达蛋白D1133L免疫鼠阳性血清的稀释倍数。同时设置阴性小鼠血清做为阴性对照。根据反应结果选择抗原的最佳包被浓度。按常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清。将酶标板置于ELISA酶标仪上读数，以S/P＞2.1作为阳性判定标准。挑选出抗D1133L蛋白的杂交瘤细胞克隆孔。

按上述筛选方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，亚克隆采用有限稀释法，将原始孔细胞用HT培养基稀释后重新分96孔细胞板，一个原始孔细胞分一块板子。亚克隆完成后注意观察每个孔的细胞个数及状态。取亚克隆后分泌抗体稳定并且尽可能是单个克隆的孔进行第二次亚克隆。经过三次亚克隆后原先是单克隆的亚克隆板子检测结果的阳性率应达到100％。获得了1株能够稳定分泌特异性针对D1133L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株7D12，保藏在中国典型培养物保藏中心，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C2020180。

3.5、单克隆抗体的大量制备

腹水抗体：给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，1w后腹腔注射10⁵个杂交瘤细胞，7～10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水1 000g离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装于-20℃或-70℃保存备用。

杂交瘤细胞培养上清：使用20％的FBS+1％双抗(青霉素和链霉素)+DMEM培养杂交瘤细胞株7D12，待24h后分离细胞，收集细胞培养基上清备用。

实施例4单克隆抗体的生物学特性检测

4.1、抗体的效价测定

腹水抗体：

将纯化的D1133L蛋白用包被液稀释后，1μg/孔加入ELISA反应板中，4℃放置过夜。次日倾去孔内的液体，洗涤3次，每次3min。每孔加200μL封闭液，37℃放置1h，洗涤3 次，每次3min。将实施例3制备的腹水抗体在另一块板上用PBS进行10倍系列稀释，100μL /孔加到已封闭的ELISA板上，每个样品平行做两个重复，PBS做阴性对照，ASFV阳性血清作为阳性对照。于37℃温箱中温育1h，洗涤3次，每次3min。然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1:5000)的抗体，100μL/孔，于37℃温箱中温育1h，洗涤5次，每次3min。加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置15min，再加入50μL/孔终止液，测定OD₄₅₀，以S/P＞2.1为阳性判定标准，

杂交瘤细胞培养上清：

同上，包被D1133L蛋白，将实施例3制备的含有单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清十倍比稀释9个梯度，其他条件和腹水检测相同。

阳性反应的最大稀释度即为腹水抗体效价和阳性杂交瘤细胞培养上清的效价。

检测结果见表1和表2，结果显示，诱导小鼠产生的腹水抗体效价为10⁷，杂交瘤细胞培养上清的效价达到1280。

表1腹水单抗效价

稀释倍数	10<sup>3</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>6</sup>	10<sup>7</sup>	10<sup>8</sup>	阴性对照
								OD<sub>450</sub>值	1.551	1.468	1.363	0.808	0.509	0.373	0.193

表2杂交瘤细胞培养上清效价

4.2、单克隆抗体亚类鉴定

亚类鉴定采用IsoStrip公司的鼠单克隆抗体分型金标试纸试剂盒进行鉴定，具体步骤按试剂盒的说明书操作。主要步骤如下:

A：抗体用1％BμLl Serum Albumin(BSA)或phosphate-buffered salline(PBS)进行稀释 (pH＝7.2～7.6)，杂交瘤细胞培养上清稀释比例为1:10～1:100，稀释后总体积为150μL。

B：将玻璃小管上的乳胶头掀开，把150μL的稀释样品加入小管内和底物充分混匀，室温静置30s，将金标试纸插入玻璃小管中，待样品吸收完全后取出，在室温下静置1min。观察结果。

亚型鉴定结果见图6，结果显示实施例3制备的单克隆抗体亚型为IgG1。

实施例5单克隆抗体的应用

5.1、间接免疫荧光检测ASFV抗原

1、单克隆抗体(McAbs)免疫活性鉴定

Western blot用于分析单克隆抗体的免疫活性，Western blot程序如下：将ASFV细胞裂解产物和预染蛋白Marker进行SDS-PAGE电泳(胶浓度为10％)，电泳产物转印至PVDF膜，剪下每个泳道的蛋白条带及预染蛋白Marker条带(保存备用)，然后将含有全病毒裂解产物的 PVDF膜条带放入去离子水中清洗10min，5％脱脂乳室温封闭1h，封闭后的PVDF膜条带分别与1:2000倍稀释的单克隆抗体诱生小鼠产生的腹水37℃作用1h，PBST(0.01mol/L，pH7.2；含0.05％的Tween-20)洗涤3次，然后与HRP-羊抗鼠IgG(1:4000)37℃作用1h，PBST洗3次，用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液进行显色。

Western blot检测结果如图7所示，结果表明，实施例3制备的单克隆抗体能与ASFV 抗原特异性结合。

2、间接免疫荧光(IFA)检测方法的建立及应用

(1)用于ASFV抗原检测

将ASFV(0.1M)毒株感染的PAM细胞及正常PAM培养2天后，倒掉上清液，经PBS轻洗3次，用4％多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3次，0.1％Triton X-100透化15min后用PBS洗三次，接着1％BSA封闭1h，PBS洗三次后，滴加实施例3制备的杂交瘤细胞培养上清，免疫前小鼠血清作为阴性对照，37℃作用1h；PBS洗涤3次，二抗为HRP标记Alexa山羊抗鼠IgG二抗(波长594nm为红色荧光)或HRP标记Alexa山羊抗兔IgG二抗(波长488nm为绿色荧光)(1:500) 于37℃作用1h；经PBS洗涤3次后，用5μg/ml DAPI染色10min，PBS洗涤三次，荧光显微镜下观察。

IFA结果表明，杂交瘤细胞培养上清能与ASFV感染的PAMs发生反应，在荧光显微镜下可见到荧光信号而正常PAM细胞未见荧光，说明获得的McAb能与ASFV发生反应，IFA方法可用于ASFV抗原检测。

(2)用于D1133L基因的亚细胞定位

亚细胞定位可见D1133L定位在细胞核与细胞浆内，结果见图8，A1表示7D12杂交瘤细胞培养上清与ASFV感染的PAM细胞发生特异性反应，B1表示7D12杂交瘤细胞培养上清与正常PAM细胞没有发生特异性反应，A2和B2为PAM细胞核染色情况图。因此，获得的单克隆抗体 (McAbs)可用于D1133L基因的亚细胞定位。

3、单克隆抗体的特异性试验

采用猪口蹄疫病毒(FMDV)、塞内卡病毒(SVV)、猪瘟(CSFV)和大肠杆菌(E.coli)阳性血清，用ASFV ELISA抗体检测试剂盒对实施例3制备的杂交瘤细胞培养上清进行抗体检测，检验其特异性。

ELISA结果表明，实施例3制备的单克隆抗体仅与ASFV阳性血清发生反应，而与FMDV、 SVV、CSFV阳性血清不发生反应，试验结果见表3，其中-表示未发生反应，+表示发生了反应。

表3单克隆抗体的特异性鉴定

病毒名称	FMDV	SVV	CSFV	E.coil	ASFV
						反应结果	-	-	-	-	+

5.2、单克隆抗体抑制ASFV复制

将ASFV毒株感染的PAM细胞及正常PAM培养2天，设置Mock空白对照。在ASFV 感染组中分别滴加10μM、20μM、40μM、80Μm7D12细胞上清，24h后经PBS轻洗3次，用4％多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3次，0.1％Triton X-100透化15min后用PBS洗三次，接着1％BSA封闭1h，PBS洗三次后，实施例3制备的杂交瘤细胞培养上清，37℃作用1h， Q-RT-PCR检测；PBS洗涤3次，二抗分别为HRP标记Alexa山羊抗鼠IgG二抗(波长594nm 为红色荧光)和HRP标记Alexa山羊抗兔IgG二抗(波长488nm为绿色荧光)(1:500)于室温作用5h；经PBS洗涤3次后，用5μg/ml DAPI染色10min，PBS洗涤三次，荧光显微镜下观察。

Q-RT-PCR结果表明实施例3制备的杂交瘤细胞培养上清会干扰ASFV的D1133L，进而 ASFV的复制被显著抑制，如图9A所示。IFA结果如图9B所示，随着杂交瘤细胞培养上清量的增加，荧光信号逐渐降低，表明ASFV复制受到抑制；其中DAPI的荧光信号逐渐降低，表明随着杂交瘤细胞培养上清量的增加，PAM细胞的量同样降低。该结果表明，7D12杂交瘤细胞培养上清能抑制ASFV复制。

此外，对IFA进行了灰度分析，结果同IFA结果，如图9C所示。

凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明还可有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞

株及应用

<130> 无

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 401

<212> PRT

<213> African swine fever virus

<400> 1

Gly Ser Gly Leu Leu Ile Ala Asp Glu Ile His Asn Val Tyr Asn Ile

1 5 10 15

Gln Glu Arg Asn Asn Tyr Gly Ile Ala Leu Gln Tyr Val Leu Asp Ala

20 25 30

Phe Pro Pro His Gln Ala Pro Arg Ala Val Phe Met Ser Ala Thr Pro

35 40 45

Val Thr Gly Ser Val Met Glu Tyr Val Asp Leu Leu Asn Leu Leu Val

50 55 60

Pro Arg His Glu Leu Pro Asn Gly Gln Pro Leu Gln Arg Gln Gln Leu

65 70 75 80

Phe Asp Ser Ser Gly His Ser Val Lys Trp Lys Lys Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Leu Val Glu Arg Leu Ser Thr Gly Arg Val Ser Phe Leu Leu Asp Thr

100 105 110

Asn Thr Asn Phe Tyr Pro Glu Arg Ile Phe Ala Gly Lys Met Leu Ser

115 120 125

Tyr Lys Asp Glu Thr Leu Pro Tyr Leu His Phe Ile Glu Cys Pro Met

130 135 140

Ser Glu Tyr Gln Leu Glu Thr Leu Lys Gln Leu Gly Pro Asp Pro Lys

145 150 155 160

Ile Ser Ser Asn Ala Tyr Ser Ile Tyr Asp Met Val Phe Pro Asn Pro

165 170 175

Lys Phe Ser Lys Gln Thr Glu Pro Lys Ala Tyr Gly Leu Phe Asn Ser

180 185 190

Thr Glu Thr Pro Thr Ala Leu Ser Met Ala Ser Thr Asp Trp Leu Leu

195 200 205

Glu Asn Gly Val Gln Ile Ile Glu Pro Ser Arg Arg Ala Pro Phe Asn

210 215 220

Val Ser Gly Ser Phe Leu Ser Leu Gln Pro Pro Thr His Ile Ser Gly

225 230 235 240

Leu Ala Phe Tyr Ser Gly Lys Tyr Thr Gln Met Met Lys Asp Ile Leu

245 250 255

Ser Ile Ile Arg Gln Gly Arg Gly Lys Ile Leu Ile Tyr His Asn Arg

260 265 270

Val Arg Met Ser Gly Val Leu Ile Leu Gln Glu Ile Leu Gln Ser Asn

275 280 285

Gly Ile Leu Asn Glu Val Ser Ser Pro Val Gly Thr Thr Arg Cys Ser

290 295 300

Ile Cys Ala Ala Ile Arg Asp Glu His Thr His Ser Asp His Gln Phe

305 310 315 320

Ile Pro Val Arg Phe Thr Ile Leu His Ser Glu Ile Glu Pro Ala Val

325 330 335

Arg Glu Arg Ser Leu Ala Leu Phe Asn Ala Ser Ser Asn Leu Glu Gly

340 345 350

His Gln Leu Arg Ile Leu Ile Gly Ser Lys Val Ile Val Glu Gly Leu

355 360 365

Asn Phe Gln Ala Val Arg Tyr Glu Met Ile Met Ser Leu Pro Leu Asp

370 375 380

Ile Pro Arg Leu Ile Gln Val Phe Gly Arg Val Val Arg Lys Asn Glu

385 390 395 400

Phe

Claims

1.分泌抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为7D12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020180。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株分泌的抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒抗原感染的试剂中的应用。

5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒抑制剂中的应用。

6.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。