CN113817054B - 一种特异性结合猪轮状病毒vp6蛋白的鼠单克隆抗体5b11及其应用 - Google Patents
一种特异性结合猪轮状病毒vp6蛋白的鼠单克隆抗体5b11及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种特异性结合猪轮状病毒VP6蛋白的鼠单克隆抗体5B11及其应用，单克隆抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID NO:2所示序列编码的氨基酸序列；单克隆抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:3所示序列编码的氨基酸序列，单克隆抗体由杂交瘤细胞5B11株分泌，保藏号为CCTCCNO:C2021191，本发明的单克隆抗体可用于制备间接免疫荧光；本发明的试剂盒能有效检测猪轮状病毒，灵敏度高，检测快速。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及猪轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备以及间接免疫荧光检测方法的建立。
背景技术
猪轮状病毒（Porcine Rotavirus，PoRV或RV）为没有囊膜的双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）。猪轮状病毒感染引起的仔猪病毒性腹泻是指由猪轮状病毒引起的仔猪以呕吐、厌食、脱水、腹泻和酸碱平衡紊乱为主要症状的疾病。由猪轮状病毒所引起的病毒性感染无论是单独感染或者交叉感染在猪群中均普遍存在，由此造成仔猪的患病甚至死亡，给猪养殖业造成了巨大的经济损失。目前没有效果显著的药物用来治疗由猪轮状病毒感染引起的疾病，因此做好对猪轮状病毒感染的预防尤为重要，而接种疫苗能有效防控该疾病的爆发。轮状病毒分为A、B、C、D、E、F、G 七个群，其中A~C群既能感染动物，也可感染人而产生严重的肠道症状。轮状病毒中有4 群可感染猪，其中A群是主要的研究对象。
VP6是RV唯一的内衣蛋白，蛋白由PoRV第6基因片段编码，由387个氨基酸组成，分子量约为40KD；病毒粒子中蛋白含量最高，占病毒蛋白的51%，维持病毒颗粒的整体结构的稳定性。VP6基因在序列上具有高度保守的性质，具有良好的抗原性和免疫原性，是诊断实验中常检测到的主要抗原，并且可以用来分辨轮状病毒的种类。根据VP6含有0、l或几个亚群抗原决定簇，将A群RV分成不同亚群。即距群I、II、I+II和非I非II四个亚群。OSU毒株及我国分离得到的江苏毒株(JS毒株)为I亚类。
据国内外研究报道，猪轮状病毒(PoRV)的成功分离以及体外高效价繁殖是制备疫苗的关键，对于全病毒灭活疫苗，一般采用测定病毒含量来进行半成品检验，但PoRV感染MA104细胞初期病变不明显，这给PoRV病毒含量的测定增加了难度。本方案旨在建立一个准确、敏感的间接免疫荧光（IFA）方法以测定PoRV病毒含量，同时评估该方法用于检测疫苗制造、检验用毒株效价测定和组织样品分离鉴定等方面的可行性。目前还未有猪轮状病毒相关单克隆抗体制备及间接免疫荧光检测方法建立的相关专利。与本方案最接近的现有专利有一个，即一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法（申请号为201410651378.8）。本方案通过制备猪轮状病毒（PoRV）VP6蛋白单克隆抗体，建立了检测猪轮状病毒（PoRV）的间接免疫荧光试验方法，具有良好的特异性，可以更好地检测PoRV毒株效价以及攻毒后组织样品分毒情况，为猪轮状病毒的实验室检测及猪轮状病毒在培养细胞中的定位和动态分布提供有效的手段。
发明内容
本方案提供了一种针对猪轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体，以重组表达的PoRVVP6蛋白为免疫原，免疫Balb/c雌性小鼠，分离高抗体效价小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。通过亚克隆筛选分泌抗PoRV VP6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本方案的另一个目的在于提供了一种利用间接免疫荧光法检测猪轮状病毒的方法，该方法具有良好的特异性，可以更好地检测PoRV毒株效价以及攻毒后组织样品分毒情况，为猪轮状病毒的实验室检测及猪轮状病毒在培养细胞中的定位和动态分布提供有效的手段，为猪轮状病毒的相关疫苗研发工作奠定了基础。
本发明涉及一种特异性结合猪轮状病毒VP6蛋白的鼠单克隆抗体5B11，所述鼠单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID NO:2所示序列编码的氨基酸序列；所述鼠单克隆抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:3 所示序列编码的氨基酸序列。
本发明涉及一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞5B11株或其传代细胞株，杂交瘤细胞5B11株分泌鼠单克隆抗体5B11，所述杂交瘤细胞5B11株的保藏号为CCTCC NO:C2021191。
本发明涉及一种检测猪轮状病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，所述间接免疫荧光检测试剂盒包括有效量的检测抗体，荧光二抗，
其中，所述检测抗体为所述鼠单克隆抗体5B11，所述荧光二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG。
作为发明的一种实施方式，所述的间接免疫荧光检测试剂盒，还包括下列试剂的一种或多种：
1）固定剂；
2）洗涤液；
3）封闭液。
6.权利要求1所述的鼠单克隆抗体5B11或权利要求4所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪轮状病毒检测中的应用，所述试剂盒能够在流行病学分析、对离体组织进行检测等非诊断目的方面应用。
本发明还涉及所述的鼠单克隆抗体5B11在鉴别、检验含猪轮状病毒抗原和其他抗原的组合物中的应用，其中，所述其他抗原为选自猪疱疹病毒Ⅰ型、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒中的一种或多种。
1.本发明所制备的猪轮状病毒单克隆抗体，特异性高，灵敏度好，能广泛而有效地应用于猪轮状病毒的分离、检测、毒力效价测定等相关实验。以纯化的猪轮状病毒（JS01株）VP6蛋白作为包被抗原稀释到80ng/mL包被ELISA酶标板，用酶标仪测定纯化抗体不同稀释度时的OD630nm值，纯化的单克隆抗体效价大于107。
2. 本发明所制备的猪轮状病毒单克隆抗体效价较高，特异性较好，背景色较低。
3. 本发明所建立的间接免疫荧光试验能够广泛而有效地应用于测定猪轮状病毒含量和中和抗体效价等方面。
4. 本发明所建立的间接免疫荧光试验具有特异性高，准确性高，敏感性良好的特点。
本发明的优点：1.除本发明外，国内尚无猪轮状病毒单克隆抗体用于间接免疫荧光方法建立的相关产品和专利。
2.本发明制备的猪轮状病毒单克隆抗体能够有效而广泛地应用与猪轮状病毒的分离、检测等相关实验，特异性良好，灵敏度高。3.本发明所建立的间接免疫荧光试验能够广泛而有效地应用于测定PoRV病毒含量和PoRV中和抗体效价等方面，能用于检测猪轮状病毒疫苗制造、检验用毒株效价测定和中和抗体效价测定等方面，准确而敏感。
附图说明
图1为原核表达质粒pET-28a（+）-VP6基因的酶切鉴定结果；
图2为pET-28a（+）-VP6表达的蛋白纯化前后进行SDS-PAGE垂直电泳的结果；
图3为不同小鼠脾细胞制备的阳性杂交瘤细胞的培养上清的特异性抗体结果；
图4为猪轮状病毒PoRV感染MA104细胞不同时间后进行IFA检测的荧光效果图；
图5为猪轮状病毒PoRV感染MA104细胞用十字交叉法进行IFA检测的荧光效果图；
图6为不同病毒分别感染MA104细胞进行IFA检测特异性的结果图；
图7为猪轮状病毒PoRV感染MA104细胞的空白对照试验IFA检测结果图；
图8为纯化的5B11株腹水单抗样品进行SDS-PAGE垂直电泳的结果，1：蛋白分子质量标准；2：5B11株纯化抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。
首先对本发明所设计的术语解释如下：
术语“pET-28a(+)”是一种常用的融合蛋白类型原核高效表达载体，含有抗卡那霉素基因。表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿主菌：建议克隆用E.coliDH5α或TOP10做受体菌；表达用E.coliBL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS做受体菌。
术语“Balb/c雌性小鼠”是肿瘤、炎症和自身免疫等研究领域最常用的动物，目前用于细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞几乎都来源于Balb/C系小鼠。对矿物油诱导浆细胞瘤敏感，BALB/C小鼠有独特的敏感性，浆细胞瘤诱发率很高，其它纯系小鼠如DBA/2、A/He、A/LN、C57BL/He、C57BL/Ka、C3H/He等，注射矿物油或植入扩散盒仅偶见诱发浆细胞瘤。而至今研究最广泛的、能产生Ig的小鼠肿瘤为浆细胞瘤(骨髓瘤)，几乎每一种浆细胞瘤细胞都只产生一种Ig分子，含有相同的轻链和重链。
术语“SPF级”即无特定病原体动物，是指除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验动物。
术语“EcoR I”（“I”是“1”的意思）是一种限制性核酸内切酶，为从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一种限制酶（E. coli，也是其名称由来），是此种细菌体内参与限制修饰系统的酶。EcoRI限制酶能专一识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开，切割后的小片段端点为5'端突出的黏状末端。
术语“Nhe I”是一种限制性内切酶，携带来自奈瑟氏球菌粘膜的nheIR克隆基因的重组大肠杆菌，该限制性内切酶识别GCTAGC序列，并在G和C之间将这段序列切开，切割后的小片段端点为5'端突出的黏状末端。Nhe I和EcoR I都适用于通用的Single Buffer缓冲液，可在统一反应体系内任意组合，无需多次单酶切或更换酶切缓冲液，方便、稳定、快速、可精准切割载体。
术语“抗核抗体”又称ANA，是一组将自身真核细胞的各种成分作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中。常将抗核抗体的检测在自身免疫疾病的重要初筛试验，间接免疫荧光法(IF)被认为是检测ANA的金标准，目前检测ANA的方法还有酶联免疫吸附试验法(ELISA)，与IF法相比，ELISA法的缺点是无法区分各种核型，且假阳性较多，如Areh Pathol Med，2000，24(12):76-80易受亲和力抗体的干扰。
术语“间接免疫荧光法”是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原-抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原或抗体。
术语“间接酶联免疫吸附试验法”是测定抗体最常用的一种酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，可用目测或用分光光度计定量测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。
术语“HRP-羊抗小鼠IgG”：辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，用于免疫学、分子生物学及临床医学的各个分支学科中的特异、敏感和安全的免疫化学制Chemicalbook剂。目前较为常用的是将辣根过氧化物酶(HRP)，经过碘酸钠氧化而标记在抗体IgG分子上，而制成HRP—抗体结合物。
术语“包被液”即CBS，其成分是无水的1.59 g NaCO3，2.93 g NaHCO3，加三蒸水定容至1000 mL，10磅10min，4℃保存。
术语“PBST洗液”其成分是无水的8.0 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g KH2PO4，0.5 mL 吐温-20 (Tween-20) 加三蒸水定容至1000 mL。Tween-20其浓度可在0.05％～0.2％之间，高于0.2％时，可使包被在同相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
术语“封闭液”及“稀释液”：称5g脱脂奶粉溶于100mLPBST洗液中。术语“PBS缓冲液”：称取8.0 g NaCl，0.20 g KCl，1.42g Na2HPO4，0.27g KH2PO4溶于800mL去离子水中，用浓盐酸将pH调节至7.4，定容至1L，高温高压灭菌后室温保存。
术语“底物显色液A”：称取TMB粉齐200 mg，无水乙醇100 mL，加三蒸水至1 000mL。
术语“底物显色液B”：称取Na2HPO4 14.6 g、柠檬酸9.33 g、0.75％过氧化氢尿素6.4 mL，调节pH 5.0~5.4，加三蒸水至1 000 mL。
术语“终止液”：浓硫酸100 mL缓慢加入800 mL三蒸水中，边加边搅拌。
术语“SP2/0细胞”：是骨髓瘤细胞，一般用来制作单克隆抗体。取特定抗原免疫过的小鼠的脾细胞，与状态良好的SP2/0细胞进行融合。产生的融合细胞兼有两类细胞的优点和特性：即不断产生抗体和无限增殖。
术语“饲养细胞”，也叫滋养细胞，在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞即为饲养细胞。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞。
术语“HAT选择培养液”：98ml完全DMEM培养基加入2ml50倍HAT储存液。在HAT培养基中，未融合的小鼠骨髓瘤细胞中DNA的从头合成途径会被阻止；未融合的骨髓瘤细胞又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPR T)，不能利用补救途径合成DNA；这样未融合小鼠骨髓瘤细胞的两个DNA合成途径都被阻止，骨髓瘤细胞DNA不能复制而死亡。未融合的B淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从B淋巴细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，可以通过补救途径合成DNA，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此，杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和增殖。
术语“不完全DMEM培养基”：134 g DMEM粉剂溶解于10000 mL三蒸水，加入青霉素钠160万单位，硫酸链霉素100万单位，硫酸庆大霉素96万单位，NaHCO3 37 g，用l mol／LHCI调节pH至6.8～7.0，过滤除菌，分装保存。
术语“完全DMEM培养基”：100 mL DMEM不完全培养基加入lO％胎牛血清，1％L-谷氨酰胺液，胰岛素(20 U／mL)0.1mL，丙酮(100 mmol／L)0.5 mL，2-巯基乙醇0.025mL。如果血消质量好，胰岛素、丙酮酸和2-巯基乙醇可省去。
术语“RPMI-1640”，其中含有10%胎牛血清。RPMI1640培养基与其他培养基不同，因为它含有还原剂谷胱甘肽和高浓度的维生素。RPMI1640培养基含有生物素，维生素B12和PABA。
术语“有限稀释法”是指将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1mL的细胞数。常用来筛选融合的动物细胞。操作过程：用HT培养液稀释，使细胞浓度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(5.5个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含半个或一个细胞。培养7～10天后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复3～5次，直至达100%阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。
术语“HT培养液”：含2% HT、10%胎牛血清( FBS)和1%青链双抗的1640培养基。
术语“5%BSA封闭液”: 牛血清白蛋白(BSA)5g，用PBS缓冲液溶解后定容到100毫升,调pH值至7.4后用0.45 um滤膜过滤除菌(较难过滤)，最后放入4℃冰箱保存。5%BSA封闭液适用于Western Blotting、ELISA以及免疫组化实验中非特异性蛋白结合位点的封闭。封闭后，可以减小后续的一抗或二抗等和载体的非特异性结合，降低背景，增强信噪比，以达到理想的显色效果。
术语“Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG”用于免疫荧光染色。488是一种常用的非常明亮的绿色荧光探针。它比绝大部分常用的绿色荧光探针更加明亮，更加不容易淬灭，而且背景更低。
实施例1
具体操作过程如下：
（一）、猪轮状病毒（PoRV）VP6蛋白重组质粒的构建、表达与鉴定
1. 猪轮状病毒VP6原核表达质粒的构建
根据本实验室所分离得到的猪轮状病毒（CH-JS01株）的VP6蛋白的CDS区域(蛋白质编码区)测序结果，设计合成一对特异性引物VP6-NheI-F、VP6-EcoRI-R(核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示)，预扩增片段长大约为1194bp，分别在目的基因上下游引入Nhe I和EcoR I酶切位点。
引物序列如下：
VP6-NheI-F：
5-cggcagccatatggctagcatggaggttctgtactcattgtcaaaaactttgaaggat-3
VP6-EcoRI-R：
5-ccattgtttcaagacatgaattctcacttaatcaacatgcttctaatggaagctactg-3
根据设计的引物进行 PCR 扩增，VP6基因的PCR扩增反应体系如下表：
表1PCR反应体系如下：
将扩增得到的VP6基因片段经Nhe I和EcoR I双酶切后连接到pET-28a（+）载体的相应位点，构建原核表达质粒pET-28a（+）-VP6，经酶切证实质粒构建正确，测序证实无碱基突变，酶切鉴定结果见附图1。将鉴定正确的重组质粒pET-28a（+）-VP6转化E. coli BL21(DE3)中，挑取阳性克隆扩大培养，IPTG诱导表达，28℃摇床培养 8 h，超声破碎后，进行SDS-PAGE 电泳，在预期位置出现特异性蛋白条带，主要以不溶性包涵体形式稳定表达，通过包涵体纯化方法纯化后得到纯度较高的目的蛋白，表达结果见附图2，纯化前后VP6蛋白40KD处有明显的反应条带，说明有良好的免疫活性。
2.猪轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备与验证
①免疫小鼠
将获得的重组VP6蛋白表达后纯化，作为免疫原(又称抗原，是指任何外来的并能刺激机体产生免疫应答的物质)免疫5只SPF级6~8周龄雌性Balb/c小鼠，进行首次免疫，免疫方法如下：选取小鼠的背部及四肢腋下多点免疫，每点约注射弗氏完全佐剂等体积充分乳化后的抗原30μg，每只小鼠免疫抗原的总量约200μg（100μL/只）；后续每间隔2周，进行二次和三次免疫用等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化的抗原100μg/只，免疫方法同一次免疫，每次每只小鼠免疫抗原总量约100μg（100μL/只）。三次免疫后一周对免疫小鼠和空白对照小鼠静脉采血检测血清抗体效价，选取效价超过1：104且效价最高的小鼠(M1~M5)，在细胞融合前3天腹腔注射纯抗原200μg（200μL/只），进行加强免疫。
②间接ELISA方法的建立，确定抗原最佳包被浓度
以加强免疫小鼠血清作为阳性血清，空白小鼠血清作为阴性血清，采用方阵滴定（十字交叉）法确定抗原的最佳包被浓度：
抗原包被：将抗原从20μg/mL开始用包被液分别做2、4、8、16、32倍稀释后包被到96孔聚苯乙烯酶标板中，每孔100μL，设置pET-28a(+)空载体蛋白为阴性对照。4℃包被过夜或37℃孵育2 h。弃孔内液体，用PBST洗液洗涤3次，5 min/次，拍干。
封闭：酶标板每孔加入含5%脱脂奶粉封闭液150μL，置37℃封闭2 h。弃去内孔封闭液，用PBST洗液洗涤3次，5 min/次，拍干。
一抗：将小鼠阳性血清从1:2000 横向倍比稀释到1:8000 倍，同时将小鼠阴性血清稀释相同倍数做阴性对照，37℃孵育1h。甩去液体，PBST洗液洗涤3次，5 min/次，拍干。
二抗：将HRP-羊抗小鼠IgG用PBS缓冲液按1:5000倍稀释，每孔各加入100μL，37℃，孵育1 h。PBST洗液洗涤3次。
显色：每孔分别依次加入50μL底物显色液A和B，室温避光反应15min。
终止：然后加50μL/孔终止液终止反应。
酶标仪测OD630值分析：在10 min内用酶标仪在630nm波长下读取其吸光值。选择OD630nm值接近于1.0，且P/N值接近最大的孔所对应的抗原稀释浓度为重组VP6蛋白的最佳包被浓度。
③细胞融合
免疫小鼠脾细胞的制备：挑选效价满足要求的小鼠(加强免疫的小鼠M1~M5)，处死小鼠；将处死的小鼠用流动清水冲洗后,在75%酒精中浸泡3-5min，固定；消毒后打开腹腔，取出脾脏，并用RPMI-1640培养液进行冲洗；将脾脏放置在筛网上，用无菌注射器推杆研磨；取脾细胞混悬液，离心，取沉淀，用RPMI-1640重悬，细胞计数和活力检测后，取108个脾细胞备用。
SP2/0细胞的预先准备：细胞融合前15d左右，将冻存的SP2/0骨髓瘤细胞复苏，在6孔细胞培养板中培养，用8-氮鸟嘌呤筛选培养，调整细胞浓度为106 个/mL。将细胞瓶中培养的SP2/0细胞，收集起来用0.5 mL RPMI-1640基础液悬浮细胞注射Balb/c小鼠背部皮下。约10-14 d后可见小鼠背部形成实体瘤，择取合适的时间取骨髓瘤细胞。取Balb/c小鼠眼眶放血处死，收集血清，75％酒精浸泡5 min。无菌状态下于超净工作台上分离瘤组织于无菌匀浆器中，加5mL RPMI-1640基础液充分碾磨后，补加10 mL RPMI-1640后静置5 min，吸取上层细胞悬液加入10 mL RPMI-1640静置5 min，用细胞筛网过滤一遍，将细胞悬液1000 r/min 离心8 min 后用 RPMI-1640基础液重悬。在另一个50 mL离心管中加入15 mL淋巴细胞分离液，将细胞悬液轻轻地加于淋巴细胞分离液之上(比例为1:1 -1:2)，1000 r/min 离心10 min，用吸管吸取两种液体界面处的白色细胞层，用RPMI-1640 基础液洗涤2 次，用细胞计数板计数后备用。
饲养细胞的制备：取Balb/c小鼠，眼眶放血后颈椎脱臼处死，75%酒精中浸泡5 min后取出，用无菌的手术剪将皮肤剪开，暴露腹膜。用无菌注射器向小鼠腹腔内注入5-10 mLRPMI-1640，轻揉小鼠腹部，用注射器抽取腹腔内液体，重复两次，每只小鼠可获得3×106-5×106 个腹腔细胞。
细胞融合：将1~2×107个SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠M1~M5的108 个免疫脾细胞按比例 1:10~1:5的比例充分混匀，1000r/min离心10min，弃掉上清后轻敲管底使细胞松动，以细胞将要顺管壁下流为准。将离心管放在37℃水浴中，缓慢加入50% PEG4000(聚乙二醇4000常用于促进细胞融合或原生质体融合) 0.8ml，边加边轻轻搅拌，加完后继续搅拌1min。缓慢加入37℃预温的RPMI-1640 基础液10 mL。具体方法为：第1 min缓慢加入1 mL。第2min 缓慢加入1 mL，第3-4 min 缓慢加入3 mL，第5 min缓慢加入5 mL，最后缓慢加入30mL RPMI-1640基础液，每次加入时都需轻轻晃动离心管。室温1000 r/min，离心10 min，弃掉上清，置于37℃培养箱中静置5-8 min。融合后细胞采用HAT选择培养液重悬，按照每孔1×104个杂交瘤细胞、1×105个饲养细胞量接种96孔板，200μL/孔，置于5% CO2，37℃恒温箱培养。
④阳性杂交瘤细胞的筛选
融合后用HAT选择培养液培养1-2天，第3天开始观察杂交瘤细胞集落，第4天弃去100µL培养基，并补加100µL HAT选择培养基。之后几天连续换液，待杂交瘤细胞集落长至培养孔1/3，培养基略变黄时，即可吸取培养上清用建立的间接ELISA进行特异性抗体的检测，同时用pET-28a(+)空载体蛋白包被到96孔聚苯乙烯酶标板、SP2/0细胞的培养上清同时作为阴性对照。杂交瘤细胞上清OD630nm值大于阴性对照OD630nm值的3倍判为阳性。标出阳性孔，检测结果见附图3。图中M1~5分别对应用同时免疫的5只小鼠的脾细胞制备的阳性杂交瘤细胞。
⑤阳性杂交瘤细胞的亚克隆筛选
对检测确定的阳性孔中的细胞进行单克隆，经过多次有限稀释法克隆: 制备饲养细胞培养基，保证小鼠饲养细胞层密度为1×106个/mL。将阳性孔内细胞从培养孔内轻轻地吹下，计数后，用含有HT培养基稀释使相应的每孔的细胞量分别为1、2、5、10个/100μL，接种至将96孔板中100μL/孔。放入37℃ 5% CO2培养箱中培养。期间不定时的观察细胞及补液，培养第5d换液一次，第7-9d仔细观察各孔内细胞的生长情况，记录，并换培养基。特异性抗体的检测：在克隆后第7-9d，细胞克隆长满培养孔1/3-1/2时，即可通过间接ELISA检测细胞上清，挑选阳性孔继续亚克至所有含有细胞团培养孔的上清均为阳性为止，一般重复克隆3次以上，阳性率达到100%时可以将细胞株命名并扩大培养，命名为杂交瘤细胞株5B11，即M3小鼠的脾细胞制备的阳性杂交瘤细胞。保藏中心保藏号 CCTCC NO:C2021191 保藏日：2021.7.22，地址：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)。
有限稀释法克隆能够保证最终获得单克隆细胞集落，同时也是在筛选能稳定分泌，表达量高，效价高的抗体的细胞，剔除状态差的细胞集落。最终获得了一株综合指标最高的杂交瘤细胞。
6单克隆抗体的制备
挑选8-10周龄Balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5 mL/只，一星期后注射用RPMI-1640重悬的杂交瘤细胞株5B11，细胞量为0.5-1×106个/只，大约7-10 d后见于小鼠腹部明显隆起，便可采集腹水，间隔2-3d后采集。3000 r/min去除腹水中的红细胞后，4℃过夜后，12000 r/min离心10min，去除腹水中的油脂沉淀，收集上清，用建立的间接ELISA方法检测效价，-80℃保存备用。
75B11株腹水单抗的纯化及检测
相关试剂的配制：
填料：Protein A亲和层析填料，购于博格隆（上海）生物技术有限公司。
平衡缓冲液：0.01M PBS，pH7.4。
冲洗缓冲液：100mM甘氨酸盐酸，pH2.7。
洗脱缓冲液：20mM甘氨酸盐酸，pH2.7。
中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0。
样品准备：
在上样前，将步骤6得到的样品8000r/min离心30分钟，取上清用0.45μm滤膜过滤。
纯化步骤：
1.清洗 先用过滤水以1.0 ml/min流速冲洗5个柱体积，冲洗介质中的乙醇。
2.平衡 用平衡缓冲液以1.0 ml/min流速冲洗至少5个柱体积。
3.上样 将处理好的样品以1.0 ml/min流速从层析柱上端加入。
4.冲洗 用冲洗缓冲液以1.0 ml/min流速冲洗至少5个柱体积。
5.洗脱 用洗脱缓冲液以1.0 ml/min流速冲洗至少5个柱体积，分管收取，2ml/管，EP管内提前加入100μl的中和缓冲液，用SDS-PAGE检测收取的样品，将有目的条带的混合到一起，测定浓度。
6.再生 用100mM甘氨酸盐酸洗2个柱体积，接着用去离子水洗5个柱体积。再用20%乙醇洗5个柱体积，置2～8℃保存。
浓度测定
纯化的单抗用超微量紫外分光光度计（Thermo Scientific Nano Drop 2000）测定单克隆抗体浓度：开机启动；纯化水清洗基座，用无尘纸擦干，反复3次；加透析液一滴至基座上，调零，用无尘纸擦干；滴加一滴样品，测定纯化抗体浓度；纯化水清洗基座，用无尘纸擦干，反复3次；关闭电源。
结果：纯化的单抗用超微量紫外分光光度计测定浓度为4.07mg/mL。
纯度测定
用SDS-PAGE电泳检测纯化抗体条带大小，同时经凝胶成像系统分析软件测定其纯度。具体方法如下：
1.样品处理：
取待测样品40μl，加入10μl 5×SDS凝胶加样缓冲液混匀，置100℃沸水中煮10分钟，放置冰上2分钟，5000r/min离心1分钟，用于SDS-PAGE上样。
2.制胶板
夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板，将制好的12%的SDS聚丙烯酰胺分离胶约5ml迅速灌入两玻板的间隙中，留出灌注积层胶所需空间，加入去离子水压平分离胶，分离胶凝固后，倾出去离子，用纸巾吸净残留液体，将刚制好的5%积层胶灌入分离胶上，立即插入梳子，待胶全部凝固后，用于SDS-PAGE电泳。
3.SDS-PAGE电泳
将制备好的SDS-PAGE凝胶板，装入电泳装置，拔掉梳子，每孔加入10μl处理好的纯化的5B11株腹水单抗样品，连接电源，将电压调到80V，待溴酚蓝跑到分离胶时，将电压调到120V～150V，等溴酚蓝跑到分离胶底部时关掉电源，取出聚丙烯酰胺凝胶，置于考马斯亮蓝染料中室温染色2小时以上。取出聚丙烯酰胺凝胶，放入脱色液中进行脱色，每次30～60分钟。取出完全脱色的聚丙烯酰胺凝胶，放置白板上观察蛋白条带特征。
4.纯度分析
蛋白条带观察完毕后，利用凝胶成像系统的分析软件测定蛋白纯度，以Gene tool分析软件为例，步骤如下：
打开凝胶成像系统和控制电脑，进入成像软件Gene tool，选择合适拍摄分辨率，点击“启动”按钮。将蛋白质胶放入凝胶成像系统的白光板中间，关闭反射白光，开启透射白光，然后点击“自动曝光”，并调整聚焦使预览窗口中的样品图像清晰，点击“拍摄”按钮。人工锁定Marker的每个条带和目的带，设定Marker上离目的带最近的条带的质量，点击测定质量，目的带的质量将被输出，整个锁定样品所在泳道各个条带以同样的方式确定样品的质量。目的带质量占整个带型质量的比例即为样品的纯度。
结果：用SDS-PAGE电泳检测单克隆抗体的条带大小，检测结果显示单抗的纯度电泳仅出现两条带，重链50kDa和轻链25kDa，同时经凝胶成像系统分析软件测定其纯度达到95%，具体结果见图8。
85B11单克隆抗体Ig类型的鉴定及可变区序列测定
参照鼠抗体亚型鉴定试剂盒说明书对制备的单抗进行亚类鉴定，5B11单克隆抗体重链IgG2b亚型，轻链为Kappa链。所筛选的5B11单克隆抗体送测序公司进行测序，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码133个氨基酸。试剂盒为：试剂盒单抗亚类鉴定试剂盒，PierceRapid ELISA Mouse mAblsotyping Kit，购自Thermo Fisher Scientific公司。
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示）：
P1：5’-atggratgsagctgkgtmatsctctt-3’
P2：5’-tgcagagacagtgaccagactccc-3’
设计轻链可变区引物序列（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示）：
P3：5’-atggagwcacakwctcaggtctttrta-3’
P4：5’-ccgtttcagctccagcttggtccc-3’
PCR反应程序为：98℃5分钟，56℃30秒，72℃30秒，共35个循环：72℃10分钟，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体5B11的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。测定单克隆抗体5B11的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。将可变区基因翻译成氨基酸序列，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，重链氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
5B11单克隆抗体的效价和鉴定方法
以纯化的猪轮状病毒（JS01株）VP6蛋白（包被液稀释为终浓度80ng/mL）作为包被抗原，包被ELISA酶标板，用于纯化抗体的效价测定。将包被抗原加入酶标板中，100μl/孔，置2~8℃下作用16小时；弃去包被液，每孔加封闭液200μl，置37℃下孵育2小时，拍干；洗涤液洗涤3次，拍干；将步骤7纯化的浓度为4.07mg/mL的单克隆抗体作1:100、1:200、1:400......1:102400两倍比稀释，100μl/孔加入酶标板中，同时设置阴阳性对照（阳性对照为免疫小鼠血清1:100倍稀释，阴性对照为SP2/0细胞培养上清），37℃孵育60分钟；洗涤液洗涤3次，拍干；加入山羊抗鼠IgG-HRP（1:5000稀释），100μl/孔，37℃孵育30 分钟；洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入底物A液、底物B液各50μl，20～25℃反应10分钟，加入终止液50μl终止反应，5分钟内用酶标仪测定各孔OD630nm值。
检测结果显示，当纯化抗体稀释超107时，纯化的单克隆抗体的OD630nm值大于3倍的阴性对照，因此，纯化的单克隆抗体效价大于107。具体结果见下表2：
表2 纯化抗体效价测定结果
（二）、检测猪轮状病毒的间接免疫荧光法的建立
1. MA104细胞的培养
将长满单层的MA104细胞(猴胚胎肾细胞)，用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液，以2~4×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100µL，置于37°C 5% CO2的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。
2. 猪轮状病毒的稀释与接种
①取100µL猪轮状病毒(CH-JS01株)样品用含5.0µg/mL胰酶的无血清DMEM培养基作10倍系列稀释，分别得10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 共5个稀释度的病毒液。
②将长满单层MA104细胞的96孔细胞培养板用无血清DMEM培养基洗三次，弃掉上清后将稀释好的5种病毒液分别加入到96孔细胞培养板中，每个稀释度加一纵排共8孔，每孔加入100µL。同时设不接毒的细胞对照8孔，每孔100µL。置37℃、含5% CO2培养箱中继续培养。
3. 间接免疫荧光试验最佳工作条件的确定
①最佳固定时间的确定：将猪轮状病毒PoRV按照以上的方法感染MA104细胞，同时设立不接毒的细胞培养孔作为阴性对照。置于37°C，含5%CO2培养箱中分别培养1日、2日、3日和4日。
洗涤：弃去细胞培养液，用灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤3次，每次5min；
固定：用预冷的80%丙酮溶液进行固定，每孔加入固定液100µL，-20°C固定30min，弃去固定液，PBS洗涤3次，每次5min；
封闭：用PBS配制的5%BSA封闭液进行封闭，每孔加入100µL，置于37°C温箱中孵育1h，弃去封闭液，PBS洗涤3次，每次5min；
一抗孵育：将上述制备的猪轮状病毒VP6单克隆抗体(4.07mg/mL)分别用PBS进行1：500、1：1000、1：2000稀释，每孔加入100µL，置于37°C温箱中孵育1h，弃去一抗，PBS洗涤3次，每次5min；
二抗孵育：将Alexa FluorTM 488标记的羊抗鼠IgG荧光二抗(HRP-羊抗小鼠IgG)分别用PBS进行1:100，1:500，1:1000稀释，每孔加入100µL置于37°C温箱中孵育1h，弃去二抗，PBS洗涤3次，每次5min；
结果判定：将96孔板放在倒置荧光显微镜下观察，出现特异性的绿色荧光即为阳性，根据试验孔中荧光强弱来确定病毒最适培养时间。检测结果见附图4，MA104细胞接毒1日、2日、3日和4日后细胞孔中均能看到不同亮度、数量的绿色荧光。其中MA104细胞接毒培养时间达4日时，大部分细胞由于死亡脱落，绿色荧光的亮度和数量大幅减少；当MA104细胞接毒培养3日时，相比其它三个时间节点，镜检荧光明亮清晰，荧光最强。因此，确定MA104细胞接毒后最佳培养时间为3日。
②抗体最适工作浓度的确立：将猪轮状病毒PoRV按照以上的方法感染MA104细胞，同时设立不接毒的细胞培养孔作为阴性对照。置于37°C，含5%CO2培养箱中分别培养3日。用十字交叉法，即一抗设立的稀释梯度为1:500，1:1000，1:2000；二抗设立的稀释梯度为1:100，1:500，1:1000，进行IFA检测，选择荧光清晰、明亮且稀释度最大的抗体稀释度，即为一抗和二抗的最适工作浓度。
检测结果见附图5，在一抗稀释度为1:1000，二抗稀释度为1:500时，荧光最强，因此，确定一抗稀释度为1:1000、二抗稀释度为1:500为最佳工作浓度。
（三）、间接免疫荧光特异性试验
①特异性：将PoRV、PRV(猪疱疹病毒Ⅰ型)、PCV2(猪圆环病毒2型)、BVDV(牛病毒性腹泻病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)和CSFV(猪瘟病毒)的病毒液稀释10倍后分别加入长满单层MA104细胞的96孔细胞培养板中，一种病毒加一纵排共8孔，每孔加入100µL，同时设置不接毒的细胞对照。置于37°C，含5%CO2培养箱中培养3日。进行间接免疫荧光检测，观察本发明制备的PoRV特异性抗体能否与其他病毒反应产生荧光，以此确定该方法的特异性。检测结果见附图6，除猪轮状病毒PoRV出现特异性荧光外，PRV、PCV2、BVDV、PEDV和CSFV五种病毒与不接毒的细胞对照均无特异性荧光，证明该方法的特异性较强。②空白对照试验：猪轮状病毒PoRV按照上述方法感染MA104细胞，同时设立不接毒细胞对照孔。进行两组实验，第一组实验：在IF法进行到一抗孵育时分别滴加100µL PBS但不加一抗直接进行二抗孵育置于荧光显微镜下观察，观察是否存在自发荧光。第二组实验：通过IF法先进行一抗孵育再进行二抗孵育置于荧光显微镜下观察，观察是否存在自发荧光。检测结果见附图7，以PBS代替一抗进行间接免疫荧光试验，没有发现特异性荧光或弱荧光，而阳性对照(第二组实验)有明显的特异性荧光，不接毒的MA104细胞对照置于荧光显微镜下观察，亦无特异性荧光，表明PoRV抗原与特异性二抗之间无反应，不产生荧光且细胞样本自身并不发荧光。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种特异性结合猪轮状病毒VP6蛋白的鼠单克隆抗体5B11及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Val Leu Tyr Val Ser Cys Gln Asn Phe Glu Asp Ala Arg Asp
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asn Leu Ile Gln
20 25 30
Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr
35 40 45
Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Thr Phe Asp Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn
65 70 75 80
Ala Arg Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys
85 90 95
Met Asp Glu Ile Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln
100 105 110
Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn
115 120 125
Phe Asp Asn Ser Ser Asp Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg
130 135 140
Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Leu Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu
165 170 175
Met Gly Thr Met Trp Ile Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly
180 185 190
Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Phe Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe
195 200 205
Glu His Val Val Pro Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser
225 230 235 240
Ala Asp Gly Thr Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro
245 250 255
Ser Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr
260 265 270
Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile
275 280 285
Arg Leu Ser Phe Gln Leu Val Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val
290 295 300
Ala Asn Leu Phe Pro Gln Ala Pro Pro Phe Ile Phe His Ala Thr Val
305 310 315 320
Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala
325 330 335
Asp Ala Ser Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu
340 345 350
Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr
355 360 365
Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg
370 375 380
Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys
385 390 395
<210> 2
<211> 397
<212> DNA
<213> 人工序列重链可变区(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaatgca gctgggtaat gctcttcttg gtatcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60
gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactt gtgaagcctg gggcttcagt taagctgtcc 120
tgcaaggctt ctggctccac ctacaccaac tactggatgc actggatgaa acagaggcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat cggagagatt gatctttctg ataattatac taactacaat 240
caaaagttca aggacaaggc cacgttgact attgacaaat cctccaagac agcctacttg 300
cagctcacca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atctaagttg 360
ggctggggcc gagggagtct ggtcactgtc tctgcag 397
<210> 3
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列轻链可变区(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagtcac agactcaggt ctttgtatac atgttgctgt ggttgtctgg tgttcatgga 60
gacattgtga tgacccagtc tcaaaagttc atgtccacat cactacgaga cagggtcagc 120
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actagtgttg cctggtatca aaagaaacca 180
gggcaatctc ccaaaccact gatttactcg gcatcctacc gttacagtgg agtccctgat 240
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 300
gaagacttgg cagagtattt ctgtcaacaa tataacagct atcctctcac gttcggtgct 360
gggaccaagc tggagctgaa acgg 384
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列轻链可变区(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val His Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Leu Arg Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn
35 40 45
Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
<210> 5
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列重链可变区(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Glu Cys Ser Trp Val Met Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Tyr
35 40 45
Thr Asn Tyr Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Lys
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Lys Leu Gly Trp Gly Arg Gly Ser Leu Val
115 120 125
Thr Val Ser Ala
130
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggcagccat atggctagca tggaggttct gtactcattg tcaaaaactt tgaaggat 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccattgtttc aagacatgaa ttctcactta atcaacatgc ttctaatgga agctactg 58
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggratgsa gctgkgtmat sctctt 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcagagaca gtgaccagac tccc 24
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggagwcac akwctcaggt ctttrta 27
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgtttcagc tccagcttgg tccc 24
Claims (6)
1.一种特异性结合猪轮状病毒 VP6 蛋白的鼠单克隆抗体 5B11，其特征在于，所述鼠单克隆抗体的重链可变区为 SEQ ID NO:2 所示序列编码的氨基酸序列；所述鼠单克隆抗体的轻链可变区为 SEQ ID NO:3 所示序列编码的氨基酸序列。
2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞 5B11 株或其传代细胞株，杂交瘤细胞 5B11 株分泌鼠单克隆抗体 5B11，所述杂交瘤细胞 5B11 株的保藏号为 CCTCC NO:C2021191。
3.一种检测猪轮状病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述间接免疫荧光(IFA) 检测试剂盒包括有效量的检测抗体，荧光二抗，其中，所述检测抗体为权利要求 1所述鼠单克隆抗体 5B11，所述荧光二抗为 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG。
4.根据权利要求3所述的间接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，还包括下列试剂的一种或多种：
1）固定剂；
2）洗涤液；
3）封闭液。
5.权利要求 1 所述的鼠单克隆抗体 5B11 或权利要求 4 所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪轮状病毒检测中的应用，所述试剂盒能够在流行病学分析、对离体组织进行检测的非诊断目的方面应用。
6.权利要求 1 所述的鼠单克隆抗体 5B11 在非诊断目的鉴别、检验含猪轮状病毒抗原和其他抗原的组合物中的应用，其中，所述其他抗原为选自猪疱疹病毒Ⅰ型、猪圆环病毒2 型、牛病毒性腹泻病毒、猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒中的一种或多种。
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