CN117659172A

CN117659172A - 抗PRV gD蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN117659172A
Application number: CN202311411103.2A
Authority: CN
Inventors: 张改平; 陈玉梅; 王爱萍; 刘东民; 周景明; 张勇; 梁超; 丁培阳
Original assignee: Longfor Modern Immunology Laboratory; Zhengzhou University
Current assignee: Longfor Modern Immunology Laboratory; Zhengzhou University
Priority date: 2023-10-28
Filing date: 2023-10-28
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本申请公开了一种抗PRV gD蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用，旨在PRV gD亚型难以特异性识别的问题。所述抗体重链可变区含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO.3所示的DNA序列，轻链可变区含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO.4所示的DNA序列；该抗体可应用于免疫学检测、疫苗制备或抗体检测试剂盒中。本申请通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备获得抗PRV gD蛋白单克隆抗体，该抗体能够特异性识别变异株PRV gD抗原，其灵敏度极高。本申请为进一步改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体和进行PRV的临床检测研究奠定了良好的技术基础。

Description

抗PRV gD蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明申请涉及生物免疫技术领域，具体涉及一种抗PRV gD蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用。

背景技术

伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的，为一种多动物共病的传染病，分布遍及全球。猪是PRV的天然宿主和主要储存宿主，它也可以感染许多哺乳动物和一些灵长类动物。在我国，PRV最早于1957年在猫中被发现，然后在牛，猪和其它家畜中也被发现。1979年后，随着进口疫苗和本地疫苗在国内养猪场的迅速推广，到80年代末，PRV得到了有效控制，不再频繁爆发。但在2011年底，PRV突然在全国各地的养猪场爆发。该高致病性PRV变异株的出现引起了全球生猪健康的关注，而生猪产业是国民经济发展和人们膳食生活较为依赖的重要产业；因此，PRV的日常监测是必要的，因而快速检测PRV对农场集中发现和消除PRV是非常重要的。

PRV基因编码的11种糖蛋白（gB/gC/gD/gE/gI/gH等）通常用作检测的靶抗原。目前，国内外的PRV诊断试验一般使用灭活病毒或gE，gB和gD等单一糖蛋白作为诊断抗原。由于病毒培养和纯化等技术限制，使用灭活病毒的抗原纯度有限，稳定性差，难以大规模生产，易于分散病毒。糖蛋白gE是PRV的非必需蛋白，目前的PRV疫苗大多是gE基因缺失疫苗，将该蛋白作为血清学诊断抗原不能用于疫苗免疫水平抗体监测。gB蛋白是PRV蛋白中最保守的一种，与疱疹病毒科的其他疱疹病毒具有免疫交叉反应性。PRV gD糖蛋白是PRV成熟病毒体胶囊膜表面的主要糖蛋白之一，也是PRV的主要免疫原性蛋白之一，刺激机体产生的抗gD抗体具有中和和保护能力，因此是制备血清学诊断抗原和亚单位疫苗的较好选择，其单克隆抗体的制备及可变区的扩增，有利于PRV 血清学的监测。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明申请总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本申请的目的在于提供一种抗PRV gD蛋白单克隆抗体，该抗体能够应用于免疫学检测，也可为基于PRV gD蛋白的疫苗研制提供物质基础；同时公开了一种简单便捷的制备抗PRV gD蛋白单克隆抗体的方法。

根据本公开的一个方面，筛选得到一种抗PRV gD蛋白单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或

编码其重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码其轻链可变区的DNA序列如SEQID NO.4所示。

在本公开的一些实施例中，所述重链可变区氨基酸排列结构如下：

名称	序列
		R-H1	QVQLQESGAELARPGASVKMSCKASGYTFT
CDR-H1	SYTMH
		FR-H2	WVKQRPGQGLEWIG
CDR-H2	YINPSSGYTNYNQKFKD
		FR-H3	KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCAR
R-H1	FPSIYYDYDDYAMDY
		CDR-H1	WGQGTTVTVSS

在本公开的一些实施例中，所述轻链可变区氨基酸排列结构如下：

名称	序列
		FR-L1	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISY
CDR-L1	RASKSVSTSGYSYMH
		FR-L2	WNQQKPGQPPRLLIY
CDR-L2	LVSNLES
		FR-L3	GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
CDR-L3	QHIR

在本公开的一些实施例中，所述单克隆抗体细胞上清ELISA效价≥1: 12800。

在本公开的一些实施例中，所述单克隆抗体的轻链型为Lambda，亚型为IgG2b。

根据本公开的再一个方面，提供一种抗原或抗体检测试剂盒，含所述抗PRV gD蛋白单克隆抗体。

根据本公开的另一个方面，将所述抗PRV gD蛋白单克隆抗体应用于制备抗体药物、免疫学检测（如ELISA、IFA、Western Blot等）或疫苗制备当中；所述抗PRV gD蛋白单克隆抗体还可应用于抗原或抗体检测试剂盒的制备当中。

根据本公开的又一个方面，提供一种抗PRV gD蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）以纯化后的PRV gD蛋白做抗原免疫小鼠；

（2）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；

（3）采用多次ELISA检测结合及亚克隆的方法得阳性杂交瘤细胞；

（4）提取阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列；

（5）对阳性克隆进行多次克隆化培养，得PRV gD单克隆抗体杂交瘤细胞株；

（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：

1. 本申请抗PRV gD蛋白单克隆抗体能快速特异的识别PRV及其gD蛋白，为PRV gD蛋白快速检测技术的解决奠定基础，在PRV相关的免疫检测中具有广泛的研究应用价值和商业使用价值。

2. 本申请抗PRV gD蛋白单克隆抗体具有高特异性和极高灵敏度，不识别其它疱疹病毒。

3. 本申请抗体制备方法是利用从哺乳动物细胞获得的PRV gD蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗PRV gD蛋白单克隆抗体，能为基于PRV gD蛋白的疫苗研制提供材料。

4. 在本申请所公开的单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列的基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，但仍能够与PRV gD蛋白特异性结合，为进一步改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体打下基础，以进一步提升抗体的特异性和亲和力。

附图说明

图1为本申请一实施例中PRV gD蛋白纯化结果图。

图2为本申请一实施例中PRV gD蛋白与PRV阳性血清反应的Western blot鉴定图。

图3为本申请一实施例中第三次免疫接种14 d后小鼠血清滴度图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本申请的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本申请，并不以任何方式限制本申请的请求保护范围。

需要说明的是，对于本申请中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本申请内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本申请仅描述了优选的方法和材料，但是在本申请的实施或测试中也可以使用与本说明书所述相似或等同的任何方法和材料。本申请说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

实施例一：PRV gD重组蛋白的制备

根据编码PRV gD蛋白的基因序列，在蛋白N段添加His和促溶标签，构建pCAGGS载体，进行密码子优化，交由上海生工生物工程有限公司合成，得到质粒，命名为pCAGGS-gD。

将质粒转染到HEK293F细胞 (密度为3.0×10⁶cells/mL)，培养72 h后以8000 g/min的转速离心10 min取上清，离心后的上清经0.45 um滤膜过滤后，使用Ni-NAT亲和层析柱，经20 mM的咪唑洗杂，200 mM的咪唑洗脱；洗脱所得目的蛋白经PBS缓冲液透析，超滤离心管浓缩获得PRV gD重组蛋白。

取适量PRV gD重组蛋白样品进行SDS-PAGE检测(图1)，纯度达到98％，测定蛋白浓度，浓度为0.65 mg/mL，分装后-80℃保存，用作免疫原。

以PRV阳性血清为一抗，HRP标记羊抗猪二抗，Western blot鉴定结果显示（图2），PRV gD重组蛋白与阳性血清反应，反应性好，进一步证实了重组PRV gD蛋白的成功制备。

实施例二：抗PRV gD蛋白单抗分泌杂交瘤细胞株的获取

1. 主要试剂和材料：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT、PEG-1500、RPMl-1640细胞培养基购自索莱宝公司、胎牛血清购自全式金公司，HRP标记羊抗猪IgG及羊抗鼠IgG购自proteintech公司，超敏ECL化学发光试剂盒购自新赛美公司，单抗亚型测定试剂盒购自北京义翘神州生物技术有限公司，BALB/c小鼠购自郑州大学动物饲养中心。

2. 免疫BALB/c小鼠

①将成分为PRV gD蛋白的抗原分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原，其中PRV gD（20 μg/只）与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂体积比均为1: 1；

②通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠2只，约200 μl/只；

③在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫；

④第三次免疫14 d，尾部采血，测小鼠血清效价；

⑤细胞融合前3～5天，选取血清效价最高的小鼠通过腹腔注射的方法，用不含佐剂的PRV gD蛋白对BALB/c小鼠进行加强免疫，免疫剂量是40 μg/只。

4. 免疫小鼠血清抗体效价测定

ELISA测效价：

①用包被液稀释纯化的PRV gD蛋白至1 µg/mL，每孔加入50 µl包被液，37℃孵育2小时，弃包被液，用PBST洗涤3次；

②用200 µl封闭液（5％脱脂奶粉+PBST）4℃过夜封闭；

③每孔加入用稀释缓冲液（PBST）以2倍倍比稀释的待检血清各50 µl（初始稀释倍数为1: 100），于37℃孵育1 h，弃上清，用PBST洗涤6次；

④向每孔加入用稀释缓冲液以1: 10000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各50 µl，37℃保温1 h后弃上清，用PBST洗涤液洗涤6次；

⑤向每孔中加入50 µl TMB 显色液，室温避光作用6～8 min后加2 M H₂SO₄50 µl终止液终止反应；

⑥用酶标仪测定OD₄₅₀值。

测定结果如图3所示；ELISA结果显示1/2号小鼠血清效价为均可达到1：25600，随机选取一只小鼠用于细胞融合制备单克隆抗体。

5. 细胞融合

①脾细胞制备：取经过超免3 d后的BALB/c小鼠引颈致死，用75%酒精体表消毒。无菌操作取出小鼠脾脏，用37℃预热的GNK溶液洗2次，加少许HAT培养基在无菌的120目尼龙纱布上用小剪刀剪碎脾脏，将脾细胞滤至无菌烧杯并转至无菌细胞离心管中，1000 r/min离心10 min，用GNK溶液洗涤细胞1～2次备用。

②细胞融合及融合细胞培养：采用聚乙二醇法进行细胞融合，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10: 1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养液轻轻混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，200 μl/孔，置37℃、5% CO₂培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，融合后7 d改用HT培养基半量换液，第10d吸取25 µl细胞培养上清，用ELISA进行初筛。

实施例三：分泌抗PRV gD蛋白单抗的杂交瘤细胞株的鉴定

1. 杂交瘤细胞的筛选鉴定及亚克隆

①ELISA筛选

第一轮ELISA筛选选用PRV gD重组蛋白作为包被原，包被ELISA板对杂交瘤细胞培养上清进行初筛；将初步筛选到的7株杂交瘤细胞株转移至24孔细胞板继续培养。

第二轮ELISA筛选分别选用His标签蛋白作为包被原，排除假阳性后共筛出6株阳性杂交瘤细胞株。

②阳性细胞的亚克隆和进一步筛选鉴定

通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。

用1640/10完全培养基稀释上述阳性杂交瘤细胞至约3 cells/ml，每孔100 µl加入到预铺有100µl饲养细胞的96孔板中，置于37℃ 5% CO₂培养箱中培养6～ 5 d后对开始进行ELISA筛选鉴定，随后将阳性单克隆细胞株转入24孔细胞培养板进行扩大培养，如有必要需进行2～3次亚克隆，直到获得稳定分泌抗PRV gD单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即可获得目的杂交瘤细胞7G6，将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×10⁶/管进行冻存。

实施例四：抗PRV gD蛋白单克隆抗体腹水的制备

1. 单克隆细胞上清效价测定

①用CBS液将PRV gD稀释成浓度1 µg/mL包被液包被酶标板，50µl/孔，4℃封闭过夜；

②将7G6单抗用5%的脱脂奶进行倍比稀释，依次加入酶标板中，50 µl/孔，37℃孵育30 min；

③弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；

④将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗）加入反应孔中，50 µl/孔，37℃孵育30min；

⑤用PBST冲洗干净，拍干；

⑥每孔加入现配的TMB显色液50 µl，暗室反应5～10 min；

⑦每孔加入50 µl 2 M H₂SO₄终止反应；

⑧酶标仪读取每孔的OD₄₅₀值。

2. 抗PRV gD蛋白单克隆抗体腹水的制备

将实施例二中单克隆杂交瘤细胞株7G6扩大培养，收集细胞用于大量制备当克隆抗体，具体步骤如下：

①选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500 μl灭菌石蜡，刺激免疫细胞用以促进杂交瘤细胞的增殖；

②观察小鼠状态，7 d后以1×10⁶~ 1×10⁷cell/只的量将单克隆阳性细胞注射至小鼠腹腔，及时观察小鼠状态；

③待小鼠腹腔涨大后抽取腹水，4000 r/min，4℃离心10 min，收取上清，于-80℃保存；

实施例五：抗PRV gD蛋白单克隆抗体分型测定

1. 单克隆抗体亚型鉴定

单抗亚类和型的鉴定按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit 使用说明书操作。测定结果如表1所示。

表1 单克隆抗体亚型鉴定

单抗类型

IgG1

IgG2a

IgG2b

IgG2c

IgG3

IgM

Kappa

Lambda

12E9E7

-

+

-

+

注：+表示阳性，-表示阴性。

单抗亚类和亚型的鉴定结果显示单克隆抗体7G6亚型为IgG2b，轻链型为Lambda型。

实施例五：单克隆抗体可变区序列的测定

提取阳性单克隆杂交瘤细胞株7G6的RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

P1：5’-AGGTSMARCTgDAGSAGTCWGG-3’；

P2：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGgDCCC-3’。

设计轻链可变区引物序列：

P3：5’-ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3’；

P4：5’-CCCAAgDTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’。

通过分子克隆技术分别做的单克隆抗体7G6的可变区序列，送河南尚亚生物技术有限公司测序。测定单克隆抗体7G6的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示，由其推导的7G6重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示，其序列结构见表2、表3。

表2重链可变区氨基酸排列结构

表3轻链可变区氨基酸排列结构

上面结合附图和实施例对本发明申请作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本申请发明构思的前提下，所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的替代方式，从而形成多个具体的实施例，均为本申请的常见变化范围。

Claims

1.一种抗PRV gD蛋白单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种抗PRV gD蛋白单克隆抗体，编码其重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码其轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的抗PRV gD蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区氨基酸排列结构如下：

名称序列 R-H1 QVQLQESGAELARPGASVKMSCKASGYTFT CDR-H1 SYTMH FR-H2 WVKQRPGQGLEWIG CDR-H2 YINPSSGYTNYNQKFKD FR-H3 KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCAR R-H1 FPSIYYDYDDYAMDY CDR-H1 WGQGTTVTVSS

。

4.根据权利要求1或2所述的抗PRV gD蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸排列结构如下：

名称序列 FR-L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISY CDR-L1 RASKSVSTSGYSYMH FR-L2 WNQQKPGQPPRLLIY CDR-L2 LVSNLES FR-L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC CDR-L3 QHIR

。

5.根据权利要求1或2所述的抗PRV gD蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株上清ELISA效价≥1: 12800。

6.根据权利要求1或2所述的抗PRV gD蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链型为Lambda，亚型为IgG2b。

7.权利要求1或2所述抗PRV gD蛋白单克隆抗体在制备PRV检测试剂中的应用。

8.一种抗原或抗体检测试剂盒，含有权利要求1或2所述的抗PRV gD蛋白单克隆抗体。

9.权利要求1或2所述抗PRV gD蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）以纯化后的PRV gD蛋白做抗原免疫小鼠；

（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。