CN111378628B

CN111378628B - 一种分泌结核分枝杆菌esat6蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及应用

Info

Publication number: CN111378628B
Application number: CN202010289562.8A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 王海宁; 陈祥; 李昕; 徐正中; 解晓莉; 孟闯; 顾丹
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2040-04-08
Also published as: CN111378628A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗早期分泌抗原靶6（ESAT6）单克隆抗体的杂交瘤细胞株8G4、单克隆抗体MAb 8G4及其应用。所述结核分枝杆菌ESAT6单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。该单克隆抗体MAb 8G4具有效价高、特异性好的优势，基于此建立的竞争ELISA检测试剂盒方法具有良好的灵敏度和特异性，可同时检测针对多种宿主的结核分枝杆菌复合群感染引起的结核病，操作简便，具有应用于结核病检测的价值。

Description

一种分泌结核分枝杆菌ESAT6蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及应用

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种分泌结核分枝杆菌ESAT6蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTC)感染引起的一种慢性、消耗性传染疾病，同时也是一种可以引起动物和人类共同感染的人兽共患疾病。结核分枝杆菌复合群主要包括：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)等，其中结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是重要人类病原体，可引起结核病；麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)引起麻风病；鸟分枝杆菌(M.avium)和其他非典型分枝杆菌经常感染艾滋病人，是免疫抑制病人的致病菌；牛分枝杆菌则是令人类和家畜感染结核病的主要源头，其不仅可以使牛患病，也可以让人患结核病。近年来，世界范围内艾滋病的流行及其耐药性的日益严重，结核病流行趋势又有所回升。结核病仍是一个全球性的需要高度重视的公共卫生和社会问题。

结核分枝杆菌早期分泌性6kDa靶抗原(ESAT6)是从结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白中分离出的一种小分子量蛋白，仅存在于牛分枝杆菌和结核分枝杆菌中，在所有BCG菌株中均缺失，是与结核分枝杆菌毒力和致病力相关的一种分泌性蛋白。ESAT6蛋白可刺激机体产生强烈的T细胞免疫应答并释放高水平的IFN-γ，是结核分枝杆菌感染早期阶段宿主细胞识别的主要靶抗原，可影响宿主的信号通路作用。鉴于以上特性，ESAT6蛋白已经成为结核病预防与控制研究的热点，有望发展成为结核病预防和诊断的最佳候选疫苗和特异性试剂。

结核菌素皮肤试验(TST)是目前检测结核分枝杆菌感染的主要手段，但是这种方法缺乏一定的特异性，易受到其他分枝杆菌抗原间交叉反应的影响，还会受到BCG接种的影响而使得检测结果呈现假阳性。结核分枝杆菌特异性抗原介导的IFN-γ释放试验具有较高的特异性，但此方法特异性的高低与所选用的刺激原即结核分枝杆菌相关抗原有关，且检测结果存在一定的假阳性，检测的准确性不强。

现有方法的缺陷及不足，以及各种免疫学检测诊断方法的建立和应用，都需要应用到高特异性、高亲和力的单克隆抗体。因此，ESAT6的研究及其抗体的研制具有较高的价值。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌ESAT6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。

所述杂交瘤细胞株分泌的抗ESAT6的单克隆抗体效价高，其试剂盒可单独用于结核病检测，也可以作为一种补充检测方法与其它方法联合使用，1小时内即可获得检测结果，用于多种宿主结核病的检测。

本发明第一方面提供了一种分泌ESAT6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞8G4或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株8G4保藏号为CCTCC NO:C2019287。

本发明第二方面提供一种ESAT6单克隆抗体8G4，其由上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。

本发明第三方面提供一种抗ESAT6抗体，所述抗ESAT6抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR-L2、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR-L3，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR-H2、氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的CDR-H3。

本发明第四方面提供一种多核苷酸，编码前述的抗ESAT6抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

本发明第五方面提供一种构建体，含有所述的多核苷酸。

本发明第六方面提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有前述的构建体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。

本发明第七方面提供前述抗ESAT6抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养前述抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体；和/或，由保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。

本发明第八方面提供前述抗ESAT6抗体在制备结核病的检测试剂中的用途。

本发明第九方面提供一种用于快速检测结核病的cELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如前述抗ESAT6抗体。

本发明提出由前述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。

本发明的试剂盒，试剂或药剂中，其所述的单克隆抗体，其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的。

本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原的亲和力强的优势，可用于结核病的检测。

基于此建立的竞争ELISA检测试剂盒，可以直接对结核分枝杆菌感染的血清样品进行检测，具有较好的灵敏度及特异性。

采用本发明的检测试剂盒操作简便，极大地缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研究，用作结核分枝杆菌样品的检测及结核病的临床诊断和流行病学的调查。

附图说明

图1：cELISA灵敏度实验。

图2：cELISA检测方法截止值的确定。

图3：cELISA检测方法的约登指数。

图4：cELISA检测试剂盒检测兔血清结果。

图5：cELISA检测试剂盒检测牛血清结果。

图6：cELISA检测试剂盒检测人血清结果。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗ESAT6抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测方面的应用。

本发明的杂交瘤细胞株或其传代细胞株，申请人于2019年10月31日在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)(湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学，保藏中心)对其进行了保藏，保藏号CCTCCNO:C2019287。

分类命名为B细胞杂交瘤8G4。

本发明的抗ESAT6抗体，由保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。

本发明涉及一种本发明所述的杂交瘤细胞株8G4或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体MAb 8G4。本发明的单克隆抗体MAb 8G4具有很高的效价，效价达1:81920000。

本发明提供的抗ESAT6抗体，所述抗ESAT6抗体包括重链可变区和轻链可变区。CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。其中重链可变区通常包括三个互补决定区，即CD R-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CD R-L1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR-L2、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR-L3，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR-H2、氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的CDR-H3。

所述抗ESAT6抗体中，所述抗ESAT6抗体的轻链可变区的氨基酸序列可以包括：

a)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或

b)与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有80％以上同源性、且具有a)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。具体的，所述b)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列功能的氨基酸序列。所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID NO.4具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

所述抗ESAT6抗体中，所述抗ESAT6抗体的重链可变区的氨基酸序列包括：

c)如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；或

d)与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具有80％以上同源性、且具有c)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列；具体的，所述d)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列功能的氨基酸序列。所述d)中的氨基酸序列可与SEQ ID NO.9具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

所述抗ESAT6抗体可为单克隆抗体。

进一步的，所述单克隆抗体为结核分枝杆菌ESAT6单克隆抗体。

一种实施方式中，所述抗ESAT6抗体，其轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。

其重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

一种实施方式中，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.14或其保守型变异序列，所述重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.19或其保守型变异序列。

一种实施方式中，所述单克隆抗体是鼠源性的。

一种实施方式中，所述单克隆抗体亚类为IgG1。

本发明的多核苷酸，可编码前述的抗ESAT6抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

本发明的构建体，含有前述的多核苷酸。

所述构建体可以由所述分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。

本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。具体可采用的表达载体包括但不限于：pET系列表达载体、pGEX系列表达载体、pcDNA系列、pCMV系列表达载体等。

本发明的抗体的表达系统，所述表达系统含有前述的构建体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。具体的，可以为例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可采用的细胞系包括但不限于：中国仓鼠的卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠的肾脏细胞(BHK,ATCC CCL 10)、幼鼠的塞尔托利细胞(Sertoli cells)、猴的肾脏细胞(COS细胞)、通过SV40(COS-7,ATCC CRL165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞、人的胚肾细胞(HEK-293)、猴肾脏细胞(CVI，ATCC CCL-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人的子宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL-2)等。

前述的抗ESAT6抗体的制备方法，可以包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养前述抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。

合适的表达所述抗体的条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

所述抗ESAT6抗体也可以由保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤产生，制备方法可以包括如下步骤：采用体内诱生腹水法进行制备。合适的利用杂交瘤体内诱生腹水以提供单克隆抗体的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验将杂交瘤细胞对小鼠进行腹腔接种，收集腹水。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

前述的抗ESAT6抗体、多核苷酸、构建体或抗体的表达系统可用于制备结核病检测试剂盒。

本发明的用于快速检测结核病的cELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包括前述抗ESAT6抗体。

进一步的，所述结核病的cELISA检测试剂盒，包括：

(1)选自以下任一：

1)支持介质和包被抗原；

2)包被有包被抗原的支持介质；

所述包被抗原为结核分枝杆菌ESAT6蛋白；

(2)酶标抗体；

所述酶标抗体为经过标记的前述抗ESAT6抗体；

本发明所述试剂盒中，所述包被抗原与所述酶标抗体能发生抗原抗体结合作用。

一种实施方式中，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗ESAT6抗体。

所述抗ESAT6抗体可为单克隆抗体。

辣根过氧化物酶标记单克隆抗体的方法采用常规。

一种实施方式中，所述捕获抗原，为前述的ESAT6蛋白。

所述试剂盒中，所述支持介质可以事先包被有包被抗原，也可以只提供空白支持介质与包被抗原，在检测前由操作者自行采用常规方法在支持介质上包被包被抗原。

进一步地，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：

1)洗涤液；

2)底物显色液；

3)稀释液；

4)封闭液；

5)阳性对照；

6)阴性对照；

7)终止液。

上述试剂均为ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。

为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括底物显示液、终止液和洗涤液。

所述底物液可为ELISA检测试剂盒中常用的通用底物显示液，如TMB底物显示液。

所述洗涤液可为ELISA检测试剂盒中常用的洗涤液，如PBST等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。

所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如脱脂奶粉、FBS、BSA或酪蛋白等。

进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISA检测所需通用试剂，如细胞培养液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。

所述阴性对照为健康兔血清。

所述阳性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但兔血清为实验兔制备的结核分枝杆菌免疫兔血清。

所述终止液可为ELISA检测试剂盒中常用的通用终止液，如2M H₂SO₄终止液。

通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。

使用该试剂盒能对人和牛结核病及其他动物结核病进行高效率检测。

本发明进一步基于上述cELISA检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的结核病的cELISA检测试剂盒，用于检测人结核病以及动物结核病，从而进行机体免疫状态评价及疾病检测方面的研究。

利用本发明的试剂盒血清样品的检测方法包括下列步骤：

(1)包被抗原包被支持介质(例如酶标板)；

(2)制备检测样品血清；

(3)血清中ESAT6抗体的检测。

1)取上述包被抗体包被的支持介质(酶标板)，将50μL血清和50μL酶标抗体混合加入酶标板，使用微量振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀；

2)贴上封板膜，37℃孵育0.5h；

3)用洗液洗涤每个板孔，用力甩干并在吸水纸上拍打，尽量除去残留的洗液。在加入下一个试剂前，避免孔壁变干；

4)洗板后，每孔中加入100μL底物显色液，贴上封板膜，37℃避光显色5min；

5)按加入底物显色液的顺序和间隔，在每孔中加入50μL终止液；

6)15min内在酶标仪上测定OD₄₅₀。

前述cELISA检测试剂盒可用于结核分枝杆菌感染检测。所述检测为诊断目的的检测。

其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验结核分枝杆菌抗原特异的ESAT6蛋白。

实施例1杂交瘤细胞株的获得

保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株的获得。

1.免疫原rHis-CFP10-ESAT6蛋白的表达纯化与鉴定

复苏重组菌pET-30a-CE/BL21(DE3)，进行蛋白的表达纯化与鉴定。取甘油冻存的细菌pET-30a-CE/BL21(DE3)(实验室构建并保存)三区划线于卡那霉素LB(Kan/LB)平板上，置于37℃培养16-24h。挑取单菌落于37℃恒温摇床中过夜培养，以1:100比例接种于新鲜Kan/LB液体培养基中，37℃培养2-3h至菌液OD₆₀₀值达到0.4-0.6，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，置于低温低速(30℃，180rpm)中诱导表达5-6h。将诱导的菌液离心后弃上清；沉淀用无菌PBS重悬后置于冰水混合物中进行超声波裂解(30W，裂解3s，间隔5s)；收集裂解上清，用His-Bind Purification Kit对上清蛋白进行纯化，并进行SDS-PAGE和Westernblotting鉴定。将纯化的rHis-CFP10-ESAT6蛋白进行浓度测定，分装保存于-70℃超低温冰箱。

2.检测原rGST-ESAT6蛋白的表达纯化与鉴定

复苏重组菌pGEX-6P-1-ESAT6/BL21(实验室构建并保存)，进行蛋白的表达纯化与鉴定。表达步骤参照上述免疫原的表达步骤。上清蛋白纯化采用Redipack GSTpurification module，并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。将纯化的rGST-ESAT6蛋白进行浓度测定，分装保存于-70℃超低温冰箱。

3.重组真核质粒pCMV-HA-ESAT6的制备与鉴定

根据GenBank公布的结核分枝杆菌H37Rv中ESAT6基因序列(NC_000962)，结合pCMV-HA载体的酶切位点的特点，利用Primer Premier 5.0软件设计扩增ESAT6基因的特异性引物：

F：5′-CAGGTACCATGACAGAGCAGCAGTGGAAT-3′SEQ ID NO.21

R：5′-TAGCGGCCGCCTATGCGAACATCCCAGTGAC-3′SEQ ID NO.22

PCR反应条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，50s；退火55℃，50s；延伸72℃，30s；再延伸72℃，10min，其中变性、退火和延伸这三步循环30次。以结核分枝杆菌H37Rv为模板扩增ESAT6基因，预计扩增目的片段长度为288bp。

连接、转化、质粒提取、电泳鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pCMV-HA-ESAT6。

4.动物免疫

以纯化的rHis-CFP10-ESAT6融合蛋白作为免疫原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，每两周免疫一次。具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射80μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组rHis-CE蛋白，第二次免疫时将80μg纯化的rHis-CFP10-ESAT6蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化混匀后免疫小鼠，免疫途径和方式均与首次免疫相同。二免7天后采血收集免疫小鼠血清，检测免疫效果。免疫效果如若明显则一周后进行加强免疫，准备融合；若不明显则需进行第三次免疫。第三次免疫的免疫剂量、所用佐剂以及免疫途径和方式均与第二次免疫相同。三免一周后采血收集免疫小鼠血清检测免疫效果；三免两周后进行融合前的加强免疫，尾静脉注射80μg纯化的rHis-CFP10-ESAT6蛋白，加强免疫三天后进行细胞融合。

5.细胞融合

具体步骤如下：尾静脉加强免疫3d后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。无菌取免疫鼠脾脏细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。5d后加入新鲜HAT培养基，10d后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

6.间接ELISA检测方法的建立

以rGST-ESAT6蛋白作为检测原，利用间接ELISA方法检测能够特异性分泌ESAT6抗体的细胞株。通过方阵实验来确定检测原rGST-ESAT6蛋白的最佳包被浓度：用包被缓冲液(pH 9.6碳酸盐缓冲液)将检测原rGST-ESAT6分别稀释成16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL等梯度，100μL/孔加入96孔酶标板内，每个稀释度12个孔，4℃包被14-18h；弃包被液，用含有0.5％吐温20的PBS洗涤3次，将液体尽量拍干，加入含有10％小牛血清的PBS，200μL/孔，37℃封闭2h；洗涤后加入100μL/孔用PBS或PBST稀释的免疫小鼠血清，从1:50开始倍比稀释，共11个稀释度，最后一孔加入稀释液PBS或PBST作为空白对照，37℃孵育2h；洗涤后加入100μL/孔用PBST稀释至工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；洗涤后加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育5min后加入2mol/L的H₂SO₄，50μL/孔终止反应。测定OD₄₅₀值，根据所得结果绘制曲线，确定检测原rGST-ESAT6的最佳包被浓度。

7.筛选阳性克隆

根据方阵实验所确定的检测原rGST-ESAT6的最佳包被浓度包被96孔酶标板，用含10％小牛血清的PBS 37℃封闭2h后，PBST洗涤3次，将液体拍干。取100μL细胞培养上清加入到包被和封闭好的ELISA酶标板中，同时加入免疫小鼠血清和SP2/0细胞培养上清分别作为阳性和阴性对照，37℃孵育2h；洗涤后加入100μL/孔用PBST稀释至工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；PBST洗涤5次，将液体尽量拍干，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育5min后加入2mol/L的H₂SO₄，50μL/孔，终止反应，测定OD₄₅₀值。当阴性对照OD₄₅₀值控制在0.2以下时，选择OD₄₅₀值在0.5以上的细胞孔进行第二次间接ELISA检测，两次检测OD₄₅₀值均在0.5以上的细胞孔则视为阳性杂交瘤细胞克隆孔。

8.阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆8G4进行2～3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆8G4对应保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株。

实施例2抗ESAT6单克隆抗体的制备与纯化

1.腹水的制备

采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。向10周龄以上的雌性BALB/c小鼠腹腔内注射液体石蜡0.3-0.5mL/只，7-10天后，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用灭菌PBS清洗并重悬于无菌PBS中，将无菌PBS重悬的细胞注射入BALB/c小鼠腹腔内，5×10⁵个/0.2mL/只。免疫7-10天后开始观察小鼠的状态，待其腹部明显增大且行动不便时收集腹水。3500rpm离心10min，吸取上清，间接ELISA检测腹水效价，分装，-70℃保存。保藏号为CCTCC NO:C2019287的杂交瘤细胞株或其传代细胞株(对应杂交瘤细胞8G4)分泌产生的单克隆抗体记作单克隆抗体8G4。

2.抗体的纯化

抗体纯化按rProtein A Sepharose 4B亲和层析柱说明书要求进行。取2mL小鼠腹水装入用处理液(NaHCO₃+EDTA)预处理的透析袋中，透析袋置于PBS中，4℃透析过夜；将rProtein A预装柱固定好，加入10倍柱体积的PBS平衡层析柱，控制流速为1mL/min；将透析好的小鼠腹水从层析柱上端加入，控制流速为1mL/min；抗体结合后，加入20倍柱体积的PBS洗涤层析柱，控制流速为1mL/min；向层析柱上端加入洗脱液(100mmol/L甘氨酸，pH 2.7)，用预先加有中和缓冲液(1mol/L的Tris，pH 9.0)的指形管收集洗脱液(1mL的收集液加入50μL的中和液)，然后进行SDS-PAGE分析抗体纯化效果。

实施例3单克隆抗体特性检测

1.单克隆抗体亚类的鉴定

按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。根据方阵试验所确定的检测原rGST-ESAT6的最佳包被浓度包被96孔酶标板，用含10％小牛血清的PBS37℃封闭2h后；PBST洗涤3次，将液体拍干后加入细胞培养上清或者腹水，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，分别加入用PBS 1:1000稀释的羊抗鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM(每个亚类设置两个重复)，100μL/孔，37℃孵育30min；PBST洗涤3次，加入用PBS 1:5000稀释的兔抗羊酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育15min；PBST洗涤5次，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育5min后加入2mol/L的H₂SO₄，50μL/孔，终止反应，测定OD₄₅₀值。根据所测OD₄₅₀值，判定抗体亚类类型。

结果显示，单克隆抗体8G4亚类为IgG1。

经鉴定，结果表明，单克隆抗体8G4的轻链可变区互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

KSSHSVLKSSNQKNYLA。

单克隆抗体8G4的轻链可变区互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

WASTRNS。

单克隆抗体8G4的轻链可变区互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

HQYLSSLT。

单克隆抗体8G4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

NIMMTQSPSSLAVSAREKVTMICKSSHSVLKSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRNSGVPDRFTGSGSGTNFTLTITSVQTEDLAVYYCHQYLSSLTFGGGTKLELK。

单克隆抗体8G4的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

MESQTQVFLSLLLWVSGTCGNIMMTQSPSSLAVSAREKVTMICKSSHSVLKSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRNSGVPDRFTGSGSGTNFTLTITSVQTEDLAVYYCHQYLSSLTFGGGTKLELK。(SEQ IDNO.5)亦即单克隆抗体3C1的轻链含有132个氨基酸。

单克隆抗体8G4的重链可变区互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

NYGMN。

单克隆抗体8G4的重链可变区互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

WINTYNGVPTYTDDFKG。

单克隆抗体8G4的重链可变区互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

GGNIPPAY。

单克隆抗体8G4的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：

QIQLVQSGPELKRPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGVPTYTDDFKGRFAFSLETSARTAYLQIKNLKNEDMATYFCAIGGNIPPAYWGQGTLVTVSA。

单克隆抗体8G4的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：

MDWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLVQSGPELKRPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGVPTYTDDFKGRFAFSLETSARTAYLQIKNLKNEDMATYFCAIGGNIPPAYWGQGTLVTVSA。

对应地，单克隆抗体8G4的轻链可变区互补决定区1(CDR1)的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，具体为：

AAGTCCAGTCACAGTGTTTTAAAGAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCC。

单克隆抗体8G4的轻链可变区互补决定区2(CDR2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：

TGGGCATCCACTAGGAATTCT。

单克隆抗体8G4的轻链可变区互补决定区3(CDR3)的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：

CATCAATACCTCTCCTCCCTCACG。

单克隆抗体8G4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：

AACATTATGATGACACAGTCGCCTTCATCTCTGGCTGTGTCTGCAAGAGAGAAGGTCACTATGATCTGTAAGTCCAGTCACAGTGTTTTAAAGAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAATTCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAAATTTTACTCTTACCATCACCAGTGTACAAACTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTC CTCCCTCACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA。

单克隆抗体8G4的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：

ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATGATGACACAGTCGCCTTCATCTCTGGCTGTGTCTGCAAGAGAGAAGGTCACTATGATCTGTAAGTCCAGTCACAGT GTTTTAAAGAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAATTCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAAATTTTACTCTTACCATCACCAGTGTACAAACTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCCCTCACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA。(SEQ ID NO.15)亦即单克隆抗体8G4的轻链的核苷酸含有396个碱基。

单克隆抗体8G4的重链可变区互补决定区1(CDR1)核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：

AACTATGGAATGAAC。

单克隆抗体8G4的重链可变区互补决定区2(CDR2)核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，具体为：

TGGATAAACACCTACAATGGAGTACCAACATATACTGATGACTTCAAGGGA。

单克隆抗体8G4的重链可变区互补决定区3(CDR3)核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，具体为：

GGGGGAAACATCCCCCCTGCTTAC。

单克隆抗体8G4的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，具体为：

CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAGGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACAATGGAGTACCAACATATACTGATGACTTCAAGGGACGCTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCCGCACTGCCTATTTGCAGATTAAGAACCTCAAAAATGAGGACATGGCGACATATTTCTGTGCAATAGG GGGAAACATCCCCCCTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTTGTCACAGTCTCTGCA。

单克隆抗体8G4的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，具体为：

ATGGATTGGCTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAGGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACA ATGGAGTACCAACATATACTGATGACTTCAAGGGACGCTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCCGCACTGCCTATTTGCAGATTAAGAACCTCAAAAATGAGGACATGGCGACATATTTCTGTGCAATAGGGGGAAACATCCCCCCTGCT TACTGGGGCCAAGGGACTCTTGTCACAGTCTCTGCA(SEQ ID NO.20)。亦即，单克隆抗体8G4的重链的核苷酸含有408个碱基。

2.单克隆抗体腹水效价的检测

根据方阵试验所确定的检测原rGST-ESAT6的最佳包被浓度包被96孔酶标板，用含10％小牛血清的PBS 37℃封闭2h后；PBST洗涤3次，将液体拍干后分别加入倍比稀释的腹水(腹水从1:10000开始稀释，作15个稀释度，最后一孔加PBS作为空白对照)，另外加入相应的SP2/0的腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；PBST洗涤4次，将液体尽量拍干，加入100μL/孔用PBST稀释至工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；PBST洗涤5次，将液体尽量拍干，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育5min后加入2mol/L的H₂SO₄，50μL/孔，终止反应，测定OD₄₅₀值。根据所测OD₄₅₀值，以P/N值≥2.1为判定标准，测定单克隆抗体腹水效价。

结果显示，单克隆抗体8G4的效价均达到1:81920000。

3.单克隆抗体特异性的鉴定

采用间接ELISA方法检测抗体与重组蛋白反应的特异性。将rGST-ESAT6，rGST-CFP10，rHis-ESAT6，rHis-CFP10以及His和GST蛋白分别稀释至方阵实验所确定的最佳包被浓度，4℃包被14-18h；弃包被液，用PBST洗涤3次，将液体尽量拍干，加入含有10％小牛血清的PBS，200μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗涤4次，将液体尽量拍干，加入100μL/孔用PBS或PBST稀释的单抗腹水或细胞上清，同时加入SP2/0培养上清和稀释液PBS或PBST作为阴性对照和空白对照，37℃孵育2h；PBST洗涤4次，将液体尽量拍干，加入100μL/孔用PBST稀释至工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；PBST洗涤5次，将液体尽量拍干，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育5min后加入2mol/L的H₂SO₄，50μL/孔，终止反应，测定OD₄₅₀值。

结果如表1所示，表明8G4只与蛋白rGST-ESAT6和rHis-ESAT6反应，而与其他蛋白rGST-CFP10，rHis-CFP10，His以及GST均不反应，说明所获得的ESAT6 MAbs在重组蛋白检测方面具有较好的特异性。

表1单克隆抗体8G4特异性鉴定结果

“+”代表阳性，“－”代表阴性

经Western blotting鉴定结果显示，所制备的抗体可特异性的识别重组ESAT6蛋白和H37Rv中ESAT6抗原。同时，采用间接ELISA方法比较抗体与商品化抗体识别抗原的特异性，结果显示，抗结核分枝杆菌ESAT6蛋白的特异性MAbs可特异性的识别H37Rv中的ESAT6抗原，且不与BCG菌株反应。

实施例4竞争ELISA方法的建立

1.最佳抗原包被浓度、酶标抗体使用浓度的确定

按照正交矩阵方法进行滴定试验，0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原，包被抗原浓度为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0μg/ml，100μL/孔，4℃过夜包被。用PBST洗涤液洗涤3次，加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃封闭2h，洗涤后加入1:10稀释的阳性血清和阴性血清，50μL/孔，同时加入工作浓度的酶标抗体，其稀释倍数分别为1:5000、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000、1:50000、1:60000。37℃作用0.5h，洗涤后加入TMB显色液，100μL/孔，室温作用5min，加入2M H₂SO₄50μL/孔终止反应，于酶标仪450nm波长下测定OD值，计算P/N值，以阴性血清OD值达到并接近1.0，P/N值较大的所在孔的抗原浓度和血清稀释度作为最佳抗原包被浓度和酶标抗体使用浓度。

比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定rHis-ESAT6蛋白最佳包被抗原浓度为0.25μg/mL，酶标抗体最佳稀释倍数为1:20000。

2.最佳阴、阳性血清使用浓度的确定

0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至0.25μg/mL包被酶标板，将阴性血清和阳性血清分别按照1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320倍比稀释，酶标抗体1:10000进行稀释，并设立PBS孔作为空白对照。比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，测定出最适的血清稀释倍数为1:10。

3.酶标板抗原包被条件及稳定性确定

3.1封闭液的确定

0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至0.25μg/mL包被酶标板，封闭液分别为含1％BSA、2％BSA、5％FBS、10％FBS、2％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉的PBS，37℃封闭2h，PBST洗涤后加入50μL的1:5稀释的阳性血清、阴性血清和50μL的1:10000稀释的酶标抗体，使得血清与酶标抗体混合后血清终浓度为1:10，酶标抗体终浓度为1:20000，随后进行ELISA测定。比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定最佳封闭液为含2.0％脱脂奶粉的PBS。

3.2显色时间的确定

0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至0.25μg/mL包被酶标板，以含2.0％脱脂奶粉的PBS 37℃封闭2h，PBST洗涤后加入50μL的1:5稀释的阳性血清和阴性血清和50μL的1:10000稀释的酶标抗体，加入显色液后37℃显色3、5、7、10、12、15min，进行ELISA测定。比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定最佳显色时间为37℃5min。

4.cELISA灵敏度实验

使用8G4与HRP-8G4进行竞争，计算cELISA的灵敏度。

8G4初始浓度为3.238mg/ml，用pH 7.2PBS系列稀释为323.8、80.95、20.24、5.06、1.26、0.32、0.08μg/mL，分别加入到预先包被的酶标板孔中，每孔50μL，每个稀释度做3个重复，每孔加入50μL 1:10000稀释的酶标抗体，使得酶标抗体终浓度为1:20000，同时设定阴性、阳性和空白对照；酶标板置于37℃反应1h，PBST洗涤3次，甩干，每孔加入100μL TMB显色液，室温显色5min，每孔加入50μL终止液，10min内在酶标仪上读取OD₄₅₀值。

其中抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS OD值，S为待测样品OD值；

表2计算的抑制率绘制成图1，从结果看，8G4抗体浓度达到0.32μg/mL时，抑制率仍能达到20.95％，显示cELISA检测试剂盒具有良好的灵敏度。

表2cELISA灵敏度实验结果

竞争抗体浓度(μg/mL)	OD值<sub>450nm</sub>	抑制率
			323.80	0.056	94.37％
80.95	0.061	93.87％
			20.24	0.092	90.75％
5.06	0.234	76.47％
			1.26	0.575	42.17％
0.32	0.786	20.95％
			0.08	0.892	10.29％

5.cELISA方法cut-off值的确定

5.1实验材料

参照本发明实施例4中的方法来制备cELISA检测试剂盒。

5.2截止值的确定

累计采集某牛场134头牛血样品，其中结核阳性奶牛血清样品42头，结核阴性牛血清样品92头，其中结核阳性牛为皮试和

试剂盒检测为阳性，结核阴性牛为皮试和

试剂盒检测为阴性。使用实施例4中制备的cELISA方法进行检测。其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果如图2、3所示，通过ROC曲线分析，敏感性曲线与特异度曲线的交叉连接点显示，抑制率的截止值为30.19％，约登指数为0.779。这表明，当抑制率为≥30.19％时，血清样品被认为是抗ESAT6抗体阳性，当抑制率为＜30.19％时，血清样品被认为是抗ESAT6抗体阴性。同时，约登指数表明此实验筛检效果较好，且真实可靠。

实施例5快速检测结核病的cELISA试剂盒的组装

检测结核病的cELISA试剂盒的组装步骤如下：

1.辣根过氧化物酶标记ESAT6蛋白单克隆抗体(记为HRP-8G4)的制备：

将纯化的单克隆抗体8G4采用标准辣根过氧化物酶标记法进行标记，获得辣根过氧化物酶标记ESAT6单克隆抗体HRP-8G4。

2.试剂盒组装

如表3所示，将酶标板、包被抗原、辣根过氧化物酶标记ESAT6单克隆抗体HRP-8G4(由保藏号为CCTCC NO:C2019287杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体经辣根过氧化物酶标记)等组份按每个试剂盒数量装载瓶数放入试剂盒塑料支架，包装组装成试剂盒，将说明书放入试剂盒，贴好外标签和侧标签。

进一步的，试剂盒中依据需要组装入：洗涤液(20×)、底物显色液、稀释液、封闭液、阴性对照、阳性对照和终止液中的一种或多种。

试剂盒中，酶标板、包被抗原(ESAT6蛋白)也可采用包被结核分枝杆菌包被抗原的酶标板替代。

包被包被抗原的酶标板的制备方法：

①96孔酶标板中加入0.25μg/mL的包被抗原，100μL/孔，4℃过夜包被；

②弃包被液，使用PBST洗板3次，1min/次,并将洗好的板子拍干；

③加入2％BSA的PBS封闭液，300μL/孔，在37℃孵育2h；

④弃封闭液，使用PBST洗板3次，常温干燥2h，加干燥剂将96孔酶标板一起放于密封袋中，抽真空密封，置4℃保存。

3.试剂盒使用说明

①加样：用PBS对样品和酶标抗体HRP-8G4分别以1:5和1:10000进行稀释。取已包被的ELISA板(包被rHis-ESAT6抗原的酶标板)，将50μL稀释后的样品和50μL酶标抗体混合加入，放于37℃水浴锅中孵育0.5h。

②显色：用PBST洗涤7遍，洗涤时要轻柔，防止跳孔。100μL孔加入TMB单组份显色液，37℃水浴锅中显色5min。

③终止：50μL/孔加入终止液终止，在15min内放于酶标仪中读取OD₄₅₀，保存数据以便后续分析。

表3本发明所涉及试剂盒的组份

编号	试剂	剂量
			1.	96孔酶标板(包被rHis-ESAT6抗原的酶标板)	1块
2.	阳性对照	10μL
			3.	阴性对照	10μL
4.	HRP-8G4	2μL
			5.	稀释液	11mL
6.	洗涤液(20×)	30mL
			7.	TMB显色液	11mL
8.	终止液	6mL
			9.	说明书	1份

实施例6快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测兔血清样品

1.实验材料

使用实施例4中制备的cELISA检测试剂盒。

1.cELISA检测试剂盒检测

采集10份结核阳性兔血清样品和10份结核阴性兔血清样品，其中结核阳性兔均为结核分枝杆菌免疫兔，阴性兔为健康兔。使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行结核病检测。

其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

由图4所示结果可见，结核兔血清样品的竞争ELISA抑制率均大于cut-off值30.19％，健康样品的竞争ELISA抑制率均小于30.19％，结果表明本发明的试剂盒可用于对兔血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，亦表明本发明的试剂盒在样品检测方面具有较好的灵敏度和特异性。

实施例7快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测牛血清样品

1.实验材料

参照本发明实施例4中的方法来制备cELISA检测试剂盒。

2.cELISA特异性试验检测

采集某牛场112头结核阴性牛血清样品，结核阴性牛为皮试和

试剂盒检测均为阴性的样品。使用实施例4中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；结果如表4所示。

表4cELISA阴性检出率

共检测112头牛血清样品，以皮试和

ELISA试剂盒联合检验结果作为参考，cELISA检测样品阴性检出率为96.55％，表明本发明的试剂盒对阴性牛血清样品具有明显的区分度，具有较好的特异性。

3.cELISA敏感性试验检测

采集某牛场23头结核阳性牛血清样品，结核阳性牛为皮试和

试剂盒检测均为阳性的样品。使用实施例4中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品，结果如表5所示。

表5cELISA阳性检出率

共检测23头牛血清样品，以皮试和

ELISA试剂盒联合检验结果作为参考，cELISA检测样品阳性检出率为91.30％，表明本发明的试剂盒对阳性牛血清样品具有明显的区分度，具有较好的敏感性。

综合以上数据绘制结果如图5所示，表明本发明的试剂盒可用于对牛血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，亦表明本发明的试剂盒在样品检测方面具有较好的灵敏度和特异性。

实施例8快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测人血清样品

2.实验材料

使用实施例4中制备的cELISA检测试剂盒。

2.人血清样品的获取

从医院获取5个结核病人和4个健康人血清，采用痰涂片抗酸染色方法进行检测确定结核病患者。

3.人血清样品的检测

①在上述包被抗原的96孔酶标板中加入下列试剂：每个血清样品取50μL与50μL酶标抗体HRP-8G4混和加入，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO₂培养箱培养0.5h。

②用PBST洗涤7遍，洗涤时要轻柔，防止跳孔。100μL/孔加入TMB单组份显色液，37℃水浴锅中显色5min。

③50μL/孔加入终止液终止，在15min内放于酶标仪中读取OD₄₅₀，保存数据以便后续分析。

其中抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果如图6所示，结核人血清样品的竞争ELISA抑制率均大于截止值30.19％，健康样品的竞争ELISA抑制率均小于30.19％，结果表明本发明的试剂盒可用于对人血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，亦表明本发明的试剂盒在样品检测方面具有较好的灵敏度和特异性。

实施例9快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测羊血清样品

1.实验材料

使用实施例4中制备的cELISA检测试剂盒。

2.cELISA检测试剂盒检测

采集1份结核阳性羊血清样品和1份结核阴性羊血清样品，使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行结核病检测。

其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果表明本发明的试剂盒可用于对羊血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。

实施例10快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测鹿血清样品

1.实验材料

使用实施例4中制备的cELISA检测试剂盒。

2.cELISA检测试剂盒检测

采集1份结核阳性鹿血清样品和1份结核阴性鹿血清样品，使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行结核病检测。

其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果表明，本发明的试剂盒可用于对鹿血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。

实施例11快速检测结核病的cELISA试剂盒与牛结核病抗体检测试剂盒的比较

1.实验材料

使用实施例4中制备的cELISA检测试剂盒。

牛结核病抗体检测试剂盒(IDEXX M.bovis Ab Test)购自IDEXX公司。

2.牛结核病抗体试剂盒检测

选择某结核阳性牛场4头PPD检测阳性奶牛和5头PPD检测阴性奶牛，使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。将检验结果与牛结核病抗体试剂盒结果进行比较与分析。结果如表6所示；

表6.快速检测结核病的cELISA试剂盒与牛结核病抗体试剂盒结果的比较(单位：头)

“+”代表阳性，“－”代表阴性

将两种试剂盒检测出来共同阳性牛数/[(ELISA试剂盒检测出的阳性牛数+cELISA检测试剂盒检测出的阳性牛数)/2]计算出阳性符合率；将两种试剂盒检测出来共同阴性牛数/[(ELISA试剂盒检测出的阴性牛数+cELISA检测试剂盒检测出的阴性牛数)/2]计算出阴性符合率。将(两种试剂盒共同检测出的阳性牛数+共同检测出的阴性牛数)/(总共检测牛数)，计算出总符合率。经统计学分析，快速检测结核病的cELISA检测试剂盒与牛结核病抗体检测试剂盒结果的阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，总符合率为100％。显示cELISA检测试剂盒与进口试剂盒相比，在牛结核病检测中具有良好的检测价值。

综上所述，本发明的发明人建立以结核分枝杆菌ESAT6蛋白为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的ESAT6单克隆抗体HRP-8G4为酶标抗体的cELISA检测试剂盒可以用于辅助检测人、牛及其他动物结核病，操作简便易懂，能最大限度的节约时间成本和经济成本，有望适用于人和动物的大规模临床检测。

通过将研制的cELISA试剂盒与商品化ELISA试剂盒进行比较，具有较高的特异性和灵敏度，而与皮试和商品化ELISA试剂盒联合使用，可以降低感染动物的漏检率，使总体检测水平得到提高。同时，与商品化抗体试剂盒比较，其高符合率更能充分体现该试剂盒检测结果的准确度及可靠性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种分泌结核分枝杆菌ESAT6蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Ser Ser His Ser Val Leu Lys Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Ala Ser Thr Arg Asn Ser

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His Gln Tyr Leu Ser Ser Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Arg

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Lys Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asn Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Thr Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Ala Arg Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser His Ser

35 40 45

Val Leu Lys Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Leu Lys

130

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Val Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gly Asn Ile Pro Pro Ala Tyr

1 5

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Arg Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Val Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Lys Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ile Gly Gly Asn Ile Pro Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 10

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Arg

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Val Pro Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Arg

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Lys Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Ile Gly Gly Asn Ile Pro Pro Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtccagtc acagtgtttt aaagagttca aatcagaaga actacttggc c 51

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgggcatcca ctaggaattc t 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catcaatacc tctcctccct cacg 24

<210> 14

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aacattatga tgacacagtc gccttcatct ctggctgtgt ctgcaagaga gaaggtcact 60

atgatctgta agtccagtca cagtgtttta aagagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 120

tggtatcagc agaaaccagg gcagtctcct aaactactga tctactgggc atccactagg 180

aattctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacaaattt tactcttacc 240

atcaccagtg tacaaactga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcc 300

ctcacgttcg gtggtgggac caagctggag ctgaaa 336

<210> 15

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggaatcac agactcaggt cttcctctcc ctgctgctct gggtatctgg tacctgtggg 60

aacattatga tgacacagtc gccttcatct ctggctgtgt ctgcaagaga gaaggtcact 120

atgatctgta agtccagtca cagtgtttta aagagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 180

tggtatcagc agaaaccagg gcagtctcct aaactactga tctactgggc atccactagg 240

aattctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacaaattt tactcttacc 300

atcaccagtg tacaaactga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcc 360

ctcacgttcg gtggtgggac caagctggag ctgaaa 396

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aactatggaa tgaac 15

<210> 17

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tggataaaca cctacaatgg agtaccaaca tatactgatg acttcaaggg a 51

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gggggaaaca tcccccctgc ttac 24

<210> 19

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaggc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acaatggagt accaacatat 180

actgatgact tcaagggacg ctttgccttc tctttggaaa cctctgcccg cactgcctat 240

ttgcagatta agaacctcaa aaatgaggac atggcgacat atttctgtgc aataggggga 300

aacatccccc ctgcttactg gggccaaggg actcttgtca cagtctctgc a 351

<210> 20

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggattggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaggcctg gagagacagt caagatctcc 120

tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180

ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacacctaca atggagtacc aacatatact 240

gatgacttca agggacgctt tgccttctct ttggaaacct ctgcccgcac tgcctatttg 300

cagattaaga acctcaaaaa tgaggacatg gcgacatatt tctgtgcaat agggggaaac 360

atcccccctg cttactgggg ccaagggact cttgtcacag tctctgca 408

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caggtaccat gacagagcag cagtggaat 29

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tagcggccgc ctatgcgaac atcccagtga c 31

Claims

1.一种分泌抗ESAT6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株8G4，其保藏号为CCTCC NO:C2019287。

2.一种抗ESAT6单克隆抗体MAb 8G4，其由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.一种抗ESAT6抗体，所述抗ESAT6抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的CDR为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR-L2、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR-L3，所述重链可变区的CDR为氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR-H2、氨基酸序列如SEQID NO.8所示的CDR-H3。

4.如权利要求3所述的抗ESAT6抗体，其特征在于，所述抗ESAT6抗体为单克隆抗体；和/或，所述抗ESAT6抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

和/或，所述抗ESAT6抗体的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

5.一种多核苷酸，编码如权利要求3-4任一权利要求所述的抗ESAT6抗体的全长氨基酸。

6.一种构建体，含有如权利要求5所述的多核苷酸。

7.如权利要求2所述的抗ESAT6单克隆抗体MAb 8G4、或权利要求3-4任一权利要求所述的抗ESAT6抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养所述抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体；和/或，由保藏号为CCTCCNO:C2019287的杂交瘤细胞株产生，所述抗体的表达系统含有如权利要求6所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸。

8.如权利要求2所述的抗ESAT6单克隆抗体MAb 8G4、权利要求3-4任一项所述的抗ESAT6抗体在制备结核病的检测试剂中的用途。

9.一种用于检测结核病的cELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如权利要求2所述的抗ESAT6单克隆抗体MAb 8G4、或权利要求3-4任一所述的抗ESAT6抗体。