CN113292651B

CN113292651B - 一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113292651B
Application number: CN202110750619.4A
Authority: CN
Inventors: 范红结; 肖宁; 蔺辉星; 周红; 李剑男; 胡雨婷
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113292651A

Abstract

本发明公开了一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述单克隆抗体的轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本发明所得猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体能够用于胞内劳森菌，以制备的单克隆抗体为一抗，IFTC‑标记的羊抗鼠抗体为二抗，检测感染细胞中的胞内劳森菌，为肠上皮细胞中胞内劳森菌抗原检测方法的建立奠定基础。

Description

一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy,PPE)，是由胞内劳森菌(LawsoniaIntracellularis，LI)感染引起的，在世界各地猪场中普遍存在的一种肠道疾病，主要影响猪群生长速度，降低日增重等，已成为现代养猪业中一种重要的肠道疾病。PPE在欧洲和美国等地发病率可达50％-70％，在韩国、泰国、马来西亚等地的猪场由于抗生素的限制使用，使得这些地区PPE阳性率达100％，仅美国养猪业一年因PPE造成的损失就不低于2000万美元，英国一年因PPE损失约400万英镑。在欧洲，由于抗生素和添加剂明令禁止使用，使得当地回肠炎的危害性已大大超过了呼吸道疾病。从2005年来，PPE已成为中国华南、华东地区规模化养猪场的一种常见病，检测结果表明，3-4周龄和8-10周龄猪群PPE阳性率一般低于50％，而从18-24周龄PPE阳性率高达50％-70％，后备母猪和经产母猪阳性率分别为60％-80％。中国传统的防控PPE的方法多采用在饲料饮水中添加泰妙菌素、泰乐菌素等抗生素，但此方法易通过生物富集作用，将抗生素散播在自然界和人体内，从而造成生物安全隐患，此外，由于抗生素的频繁使用，细菌产生耐药性，这将对PPE的防控构成严重威胁。

胞内劳森菌为严格的胞内寄生菌，只能在特定的细胞中进行生长，如McCoy、IEC-18、Hep-2、IPEC-J2、PK-15等细胞系。此外，该菌生长环境极其苛刻，需要在微需氧环境(83.2％N₂，8.8％CO₂和8.0％O₂)中生长。因此，胞内劳森菌的分离、培养极其困难，全球只有少数实验室具备成功分离、培养LI的能力，其原因主要是因为猪肠道中微生物菌群复杂，在分离过程中极易受其他肠道微生物的污染；其次，缺乏准确的检测感染细胞中胞内劳森菌的检测方法，故国内很少有实验室具备成功从临床样品中分离、培养胞内劳森菌的能力，其严重阻碍了国人对该病原菌的进一步研究。

疾病的诊断对其防控方案的制定具有重要意义。对于PPE的诊断，国际普遍使用的诊断方法主要分为特异性诊断和非特异性诊断两大类。其中，以组织病理学诊断为主的非特异性诊断方法有Warthin-Staixy银染技术、苏木素－伊红染色(H&E)、Ziehl-Neelsen法等；特异性的诊断方法包括血清学、分子生物学和组织学的诊断，包括间接免疫荧光光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化(IHC)、原位杂交(ISH)等技术。目前，国内主要是提高PCR、qPCR和RPA-FLD等分子生物学方法间接地检测样品中LI的核酸，缺乏检测感染细胞中胞内劳森菌的免疫学方法，而单克隆抗体在病原诊断方法的建立中起至关重要的作用。关于胞内劳森菌蛋白的研究近年来不断完善，已报道的可作为候选抗原的蛋白，如LsaA、LatA、鞭毛相关蛋白0710、L10902、L11022和L11024等都被证实具有良好的免疫原性。Omp2为胞内劳森菌的外膜蛋白，迄今为止，国内外尚无制备胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的相关报道。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用，制备的抗胞内劳森菌Omp2蛋白的单克隆抗体，为胞内劳森菌检测方法建立奠定基础。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述单克隆抗体的轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区均具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。

一种编码所述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的核酸分子，所述核酸分子编码猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述核酸分子编码猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQID NO.10所示。

一种载体，其含有上述的核酸分子。

一种宿主细胞，其含有上述的核酸分子或载体。

一种试剂盒，包含上述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体。

所述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的制备方法，采用杂交瘤技术进行制备。

优选的，所述猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

步骤1：重组表达载体pGex-6p-1-Omp2/BL21的构建；

步骤2：重组Omp2蛋白的诱导表达、纯化及免疫反应性分析；

步骤3：Balb/c小鼠的免疫；

步骤4：阳性杂交瘤细胞的筛选、鉴定及亚克隆；

步骤5：腹水的制备及亚型鉴定；

步骤6：单克隆抗体特性分析；

步骤7：腹水的纯化；

本发明最后提供了所述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体在胞内劳森菌检测中的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：

以所述Omp2蛋白单克隆抗体作为一抗，FITC标记的羊抗鼠抗体作为二抗，采用IFA检测方法对胞内劳森菌进行测定。

优选的，所述应用包括以下步骤：

培养IEC-18细胞，加入含胞内劳森菌LJS19051的菌液，同时设立阴性对照；加入所述Omp2蛋白单克隆抗体，孵育；加入FITC标记的羊抗鼠抗体，孵育；加入DAPA染色液，室温避光反应，清洗，荧光倒置显微镜下拍照、观察结果；IFA结果判定：IEC-18细胞胞浆中有特异性绿色荧光，即为阳性，而胞浆中无特异性绿色荧光，即为阴性。

本发明制备了一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体，并以制备的单克隆抗体为一抗，IFTC-标记的羊抗鼠抗体为二抗，检测感染细胞中的胞内劳森菌，为肠上皮细胞中胞内劳森菌抗原检测方法的建立奠定基础。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、本发明制备了一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体，通过优化Omp2蛋白诱导表达条件，最终使重组Omp2蛋白以可溶性表达形式在大肠杆菌中获得表达，保留了Omp2蛋白的天然生物学活性；

2、本发明在采用间接竞争ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞时，通过向纯化后的包被原(rOmp2蛋白)中添加PreScission Protease，从而排除本发明筛选的阳性杂交瘤细胞株是针对大肠杆菌GST标签蛋白的抗体；

3、本发明所得猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体，只与胞内劳森菌发生特异性结合，而与鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌无交叉反应；此外，纯化后单克隆抗体效价高，以其为一抗，采用IFA检测方法对感染胞内劳森菌的单层细胞进行检测时，检测结果准确，稳定，可靠。后续该抗体还可应用于胞内劳森菌Omp2蛋白抗原表位的筛选，为胞内劳森菌表位疫苗研制奠定基础。

附图说明

图1为表达载体pGex-6p-1的结构图谱。

图2为重组质粒pGex-6p-1-Omp2/DH5α双酶切鉴定图；M：DNAMarker；1：pGex-6p-1空质粒；2：重组质粒；

图3为重组Omp2蛋白诱导表达及纯化图；M:Protein molecular weightstandard；1：诱导表达后的Omp2蛋白上清；2：纯化后的Omp2蛋白；

图4为Omp2蛋白免疫印迹分析；M：Protein molecular weight standard；1：Omp2蛋白；2：GST标签蛋白；

图5为使用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，检测3种单克隆抗体的OD_450nm读数结果；

图6为单克隆抗体亚型鉴定结果；

图7为单克隆抗体与rOmp2蛋白的免疫反应性检测结果；M：Protein molecularweight standard；1-3分别指一抗为4D9,3G2和7G5；4：阳性对照；5：阴性对照；

图8为单克隆抗体交叉反应性测定结果；

图9为单克隆抗体效价测定结果；

图10为纯化后的4D9,3G2和7G5单克隆抗体SDS-PAGE分析图；M：Proteinmolecular weight standard；1：纯化前的4D9单抗；2：纯化过程中除杂的流川液；3-5分别指纯化后的4D9,3G2和7G5抗体；

图11为IFA检测IEC-18细胞中胞内劳森菌的检测结果；图A-C分别为以4D9,3G2和7G5为一抗，D为以猪胞内劳森菌阳性血清为一抗；E为以未免疫的小鼠阴性血清为一抗。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

本发明所用的材料来源：

鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、胞内劳森菌为本实验室保存；其中，胞内劳森菌菌株LJS19051已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉武汉大学，保藏日期为2020年7月21，保藏编号为CCTCC NO：V202046，分类命名为胞内劳森菌菌株LJS19051。

GST标签蛋白纯化柱，购于GE Healthcare公司；

PreScission Protease购于碧云天生物技术公司；

猪胞内劳森菌阳性血清为SVANOVIR公司产品；

HRP标记的羊抗猪IgG购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；

弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)为Sigma公司产品；

雌性BALB/c(6～8周龄)小鼠购于扬州大学比较医学中心；

DMEM高糖培养基、胎牛血清购于GIBCO公司；

SP2/0细胞由本实验室保存；

HAT、HT Media Supplement(50×)购于Sigma公司；

HRP标记的羊抗鼠抗体，购于武汉博士德生物工程有限公司；

TMB显色液，购于Beyotime公司。

高敏型ECL化学发光检测试剂盒(即用型)购于Vazyme公司；

HiTrap Protein G HP纯化柱为GE公司产品；

小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒为proteintech公司产品；

FITC标记的羊抗鼠抗体购自Sigma公司；

其他未列出的试剂都是能通过正规商业渠道购买；

实施例1胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的制备

(1)重组表达载体pGex-6p-1-Omp2/BL21的构建

根据GenBank中胞内劳森菌Omp2基因序列，用DNAStar生物学软件分析，选择抗原性良好的区域，委托上海生工生物工程有限公司合成一段带有BamH I和Sal I酶切位点的Omp2基因序列(103-993bp)，预期目的片段长度为891bp，将合成的目的基因与经BamH I和Sal I酶切的pGex-6p-1载体进行连接，其结构图谱如图1所示。次日，从-80℃冰箱取出1管E.coliDH5α感受态细胞，迅速放入冰上，待其融化后向其中加入全部连接产物，轻轻混匀，冰水浴中放置30min，42℃热击45s，冰水浴中放置1min，随后加入960μL LB液体培养基中，37℃，150rpm活化1h，转化液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素和氯霉素的LB固体板，37℃培养过夜，次日挑取单菌落，提取经菌落PCR鉴定为阳性的重组质粒pGex-6p-1-Omp2/DH5α进行双酶切鉴定和测序鉴定。随后将验证正确的pGex-6p-1-Omp2/DH5α重组质粒按上述方法转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，同时转化空质粒pGex-6p-1作为阴性对照。结果如图2所示，从pGex-6p-1-Omp2/DH5α中提取的重组质粒，经BamHI和Sal I双酶切后，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳。结果显示在4984bp和891bp处各出现一条目的条带，其中4984bp处条带与pGex-6p-1大小相符，另一条与891bp的Omp2基因条带大小一致，说明重组质粒pGex-6p-1-Omp2构建成功。

(2)重组Omp2蛋白的诱导表达、纯化及免疫反应性分析

1)重组Omp2蛋白的诱导表达

挑取pGex-6p-1-Omp2/BL21单菌落接种于含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。次日，按1∶100比例转接于3mL LB培养液(含氨苄青霉素和氯霉素)中，37℃、220rpm/min震荡培养至OD_600nm值为0.4，加入终浓度为0.3mmol/L IPTG，于16℃、90rpm/min诱导表达18h。收集表达产物，4℃，12000rpm/min，离心5min，收集菌体沉淀并经0.01mol/L pH 7.4PBS洗3次后，用细胞裂解缓冲液重悬菌体沉淀，-80℃反复冻融菌体3次，超声破碎裂解(200W工作5s间歇5s)至菌体不再粘稠，4℃、12 000rpm/min离心20min，上清即为可溶性部分，沉淀为包涵体部分。分别取上清部分和包涵体部分进行SDS-PAGE电泳以确定重组Omp2蛋白的表达形式。同时设置pGex-6p-1空载体质粒转化E.coliBL21同步诱导作为空白对照。SDS-PAGE电泳结果表明，与空载体和未诱导的蛋白相比，诱导后的全菌、上清和包涵体在58.6KDa处均出现一条目的条带，与rOmp2蛋白理论值相符，说明重组蛋白以可溶性表达形式在大肠杆菌中表达(图3，泳道1)，保留了Omp2蛋白的天然生物学活性；随后，使用GSTRAP HP蛋白纯化柱对上清中的rOmp2蛋白进行纯化，纯化后蛋白经超滤浓缩管浓缩除盐3次后，SDS-PAGE电泳结果表明，本研究获得了高纯度和高浓度的重组Omp2蛋白(图3，泳道2)，说明纯化后的rOmp2蛋白可作为天然免疫原免疫动物，制备相应的抗体。

2)重组Omp2蛋白免疫反应性检测

重组Omp2蛋白经12％SDS-PAGE分离后，转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，经5％脱脂奶粉4℃封闭过夜后，PBST洗涤3次，10min/次；加入1:500倍稀释的猪胞内劳森菌阳性血清，37℃孵育1h；PBST洗6次，10min/次；加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，室温孵育1h，0.05％PBST洗膜6次，用ECL化学发光液显色并分析Omp2蛋白的免疫反应性。WB结果如图4所示，以纯化后的rOmp2蛋白为检测原，胞内劳森菌猪阳性血清为一抗后，发现在58.6KDa处可观察到一天特异性目的条带，说明rOmp2蛋白可与胞内劳森菌猪阳性血清发生特异性结合，上述结果说明本研究制备的rOmp2蛋白具有良好的反应原性。

(3)Balb/c小鼠的免疫

将纯化后rOmp2蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1比例混合、乳化为免疫原。免疫原以背部皮下多点注射方式免疫7周龄Bab/C小鼠，免疫剂量为50μg/只，分别于一免后第14天对小鼠进行二免，二免后10天对小鼠进行三免，免疫剂量和免疫途径同首免，但佐剂更换为弗氏不完全佐剂；三免后7天，小鼠断尾采血，分离血清，用间接ELISA法测定各只小鼠血清中抗体效价。选取抗体水平最高的小鼠在融合前3天进行最后一次冲击免疫，即免疫原中不添加任何佐剂，直接腹腔注射纯化后的Omp2蛋白，50μg/只。

(4)阳性杂交瘤细胞的筛选、鉴定及亚克隆

1)饲养细胞的制备

取8周龄Bab/C小鼠颈椎脱处死，浸泡于75％酒精中3-5min；在生物安全柜中，用灭菌处理的眼科剪刨开皮肤，暴露腹膜。用注射器吸取10mL DMEM培养液注入到腹腔内，避免刺破肠管，反复按摩腹膜，吸出培养液；放入10mL离心管，1000rpm/min离心10min，弃上清，进行细胞计数；用含15％胎牛血清的DMEM培养液混悬，调整细胞数为1×10⁵个/mL，加入96孔细胞板，每孔2滴，放入37℃，5％CO₂培养箱培养。

2)脾细胞的制备

根据间接ELISA检测结果，选择抗血清效价最高的小鼠摘眼球放血制备阳性血清备用；采用颈椎脱臼法处死小鼠，并将其在75％酒精中浸泡3-5min；在生物安全柜中，将小鼠固定在解剖板上，灭菌眼科剪剪开小鼠腹部右侧位置，暴露脾脏后从无菌镊子取出，放入含有DMEM培养基的平皿中，剥离被膜；将100目细胞筛网套放在50mL一次性离心管上，将脾剪成小块取出放于其上，吸取10mL左右培养基，并用1mL的玻璃注射器的内芯(灭菌)边磨边滴加培养基，1500rpm离心，弃上清，在用少量的DMEM基础培养基重悬并用0.4％台盼蓝染色计数；

注意：融合前一天保证SP2/0细胞对数生长。

3)细胞融合

将上述脾细胞和SP2/0细胞按照5：1的比例混合在一起加入10mL DMEM培养液，吹打混匀之后1000rpm离心8min并将上清吸干净；在安全柜边操作台边缘透气孔上将细胞磨匀成糊状，将离心管放在37℃温水中，一边摇动离心管，一边滴加37℃预热的PEG4000，在1min内加完1mL。继续置于37℃温浴90s；

5min内加入25mL的DMEM培养基使PEG快速被稀释而失去作用，在前1min内加1mL，中间2min加4mL，最后2min加完20mL，继续静置5-10min；1500rpm离心5min后弃上清，HAT培养基重悬后，加入事先加有饲养细胞的96孔板中，每孔2滴，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；5d后使用15％血清的HAT培养基补液，8d左右将培养液吸尽，使用15％血清的HT DMEM培养液换液。

4)杂交瘤细胞的筛选与鉴定

在细胞融合10d左右观察每孔是否有葡萄串状细胞团存在，记录有细胞的孔，待细胞生长至整个孔底的1/2-1/3时吸取各孔的细胞上清进行间接竞争ELISA来确定阳性细胞孔，如果不加蛋白的孔与加蛋白的孔OD_450nm相差很大则为阳性，且差值越大表明该孔对蛋白的敏感性越好。如果二者值相近则为阴性。

间接竞争ELISA方法如下：

(1)包被抗原：100μg/mL纯化后rOmp2蛋白(已事先用PreScission Protease对GST蛋白进行酶切)，100μL/孔包被酶标板，4℃冰箱过夜；

(2)PBS洗3次，5％脱脂奶粉37℃封闭2h，PBS洗3次，拍干；

(3)加细胞上清：用PBST将细胞上清分成等量的两份，一份直接加入孔中，另一份与100μg/mL的蛋白混匀加入孔中，分别设置阳性、阴性、空白对照，于37℃恒温培养箱中作用1h；

(4)洗涤同上；

(5)加酶标二抗：PBST对酶标二抗进行1:5000稀释，100μL/孔，37℃反应1h；

(6)洗涤同上；

(7)显色：每孔加入100μL TMB，37℃避光反应15min，每孔加入50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应；

(8)酶标仪测定OD_450nm值。

5)亚克隆

挑选对蛋白敏感和效价较好的孔，按照有限稀释法进行亚克隆，直到最后一次克隆细胞的孔均为阳性为止。具体操作方法如下：

(1)克隆前一天制备饲养细胞，100μL/孔铺于96孔细胞培养板中；

(2)对克隆细胞进行计数，用HT培养液将细胞稀释成约2000个细胞/mL；

(3)取0.1mL细胞悬液，加入4mL HT培养基；

(4)取2.4mL加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上的A、B两排，100uL/孔，每孔大约5个细胞，细胞浓度为50个细胞/mL；

(5)剩余1.6mL再加入2.4mL的HT培养基，取2.4mL加入C、D两排，每孔2个细胞；

(6)剩余1.6mL加入3.4mL HT培养基，加到剩余四排，每孔0.5个细胞，37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(7)7d后对亚克隆细胞进行筛选，将阳性单克隆扩大培养，按上述方法继续进亚克隆，在每次亚克隆时要将阳性目的孔细胞冻存备用；

(8)经3次亚克隆后，最终获得3株对胞内劳森菌rOmp2蛋白敏感性较好的杂交瘤细胞株，分别为4D9,3G2和7G5；

6)杂交瘤细胞的扩大培养和冻存

(1)待3株杂交瘤细胞长满孔底时，吸取细胞上清后用新鲜的HT培养基轻轻地吹打细胞后加入24孔板中培养；

(2)然后按照上述方法继续在6孔板中扩大培养，最后转到细胞瓶中培养；

(3)等到细胞在瓶中的密度达到80％以上且处于对数生长时，倾去培养液，用新鲜的培养液吹下附着在瓶壁上的细胞；

(4)1500rpm离心10min，弃上清，沉淀用含10％DMSO的培养液进行重悬，1mL/管分装于冻存管中；

(5)4℃30min、-20℃2h、-80℃过夜，液氮中长期保存。

(5)腹水的制备及亚型鉴定

取6-8周龄Balb/c雌性小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7d后每只小鼠分别腹腔注射1.0×10⁶个阳性杂交瘤细胞株4D9,3G2和7G5，7～10天后待小鼠腹部明显隆起，收集腹水。4500rpm/min，4℃离心15min，取上清，置于-20℃冰箱保存、备用。同时，按小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书对3株细胞所产生的腹水进行亚型鉴定，结果如图5～图6所示，3株细胞所产抗体亚型均为IgG1型，轻链为kappa。

(6)单克隆抗体特性分析

1)反应原性鉴定

纯化的rOmp2重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，分别以4D9,3G2和7G5单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗进行Western blot鉴定。结果显示，本发明制备的3种单抗均可与胞内劳森菌Omp2蛋白反应(图7)。

2)交叉反应性测定

细菌蛋白提取试剂盒分别提取鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、胞内劳森菌全菌蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度后，10μg/孔包被于酶标板，4℃过夜；次日，用含5％脱脂乳的PBS进行封闭；随后分别加入经1:500倍稀释的3种单克隆抗体，37℃孵育1h；PBST洗5次，各孔依次加入100μL 1:5000稀释的HRP-标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1h后，0.5％的PBST洗5次，各孔依次加入100μL TMB显色液，室温反应15min，每孔加入50μL2mol/L的H₂SO₄终止反应，酶标仪测定OD_450nm处吸光值，结果如图8所示，3种抗体(4D9,3G2和7G5)只与胞内劳森菌发生特异性结合，而与鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌无反应，说明本研究制备的单克隆抗体具有良好的特异性。

3)效价测定

采用间接ELISA法检测小鼠腹水中抗体效价。间接ELISA法中rVMH蛋白包被浓度为100μg/mL、待检小鼠腹水从1:1000倍比稀释至1:100×2¹²、HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)的稀释度为1:5000，TMB底物液显色后，酶标仪测定OD_450nm值，以待检孔的OD_450nm值/阴性孔的OD_450nm值≥2.1判为阳性，结果如图5所示，纯化后的3种抗体效价分别为1:2048000；1:512000；1:256000(图9)

(7)腹水的纯化

使用GE公司生产的HiTrap Protein G HP柱对各组小鼠腹水进行纯化，纯化后的抗体经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度后，SDS-PAGE电泳检测纯化效果。结果表明，3株杂交瘤细胞株4D9,3G2和7G5所制得的腹水经纯化后浓度分别为4.2mg/mL，4.8mg/mL和3.9mg/mL，纯化前后的腹水，经SDS-PAGE分析，纯化后的抗体有两条明显的条带，大小分别为55KD和25KD，与抗体重链和轻链大小相符合(图10)。

(8)单克隆抗体测序

将上述制得的单克隆抗体4D9进行测序(委托单位：苏州金唯智生物科技有限公司)，测序结果如下：其重链可变区和轻链可变区均具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示；轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

实施例2胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的应用

将IEC-18细胞消化离心后制备成含1.0×10⁵cells/mL的细胞悬液，500μL/孔接种至含有细胞爬片的24孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；次日，待细胞完全贴壁后，弃培养液，每孔加入500μL含胞内劳森菌LJS19051的菌液，同时设立只加DMEM培养液的阴性对照；将细胞板置于37℃，8％O₂，8.8％CO₂和83.2％N₂的三气培养箱中培养，3h后更换为新鲜培养液后继续培养；24h后取出96孔板；PBS洗3次，每孔加入500μL-20℃预冷的无水甲醇室温固定15min；弃无水甲醇，PBST洗3次，5min/次；每孔用5％的脱脂奶粉进行封闭，500μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗5次，5min/次，拍干；每孔分别加入1：200倍稀释的4D9,3G2和7G5单克隆抗体，37℃孵育1h；PBST洗5次，5min/次，拍干；每孔加入500μL 1:500稀释的FITC标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1h；PBST洗5次，5min/次，拍干；每孔加入500μL DAPA染色液，室温避光反应10min，PBST洗5次，5min/次，荧光倒置显微镜下拍照、观察结果。IFA结果判定：IEC-18细胞胞浆中有特异性绿色荧光，即为阳性，而胞浆中无特异性绿色荧光，即为阴性。IFA结果如图11所示，与阴性对照组相比，一抗分别为4D9,3G2和7G5单克隆抗体和猪胞内劳森菌阳性血清时，可见IEC-18细胞胞质中有特异性绿色荧光，与胞内劳森菌在细胞中存在部位相符，上述结果说明本研究制备的3株抗胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体可与肠上皮细胞中的胞内劳森菌全菌发生特异性结合。

上述的实施例中PBS缓冲液通过以下步骤得到：

取十二水合磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、氯化钠8g；将以上成分混合后，溶于1000mL超纯水中，并用0.1M的HCL调PH至7.4-7.6，经0.22μm的滤膜进行过滤所得，4℃保存备用。

上述的实施例中细胞裂解缓冲液通过以下步骤得到：

取5mL 1mol/L pH 8.0的Tris-HCl，2.5mL 0.5mol/L EDTA，10mg溶菌酶，混匀加超纯水至100mL，4℃保存。

上述的实施例中PBST溶液通过以下步骤得到：

取十二水合磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、氯化钠8g；将以上成分混合后，溶于1000mL超纯水中，并用0.1M的HCL调PH至7.4-7.6，加入500μL Tween-20，混匀后，室温保存，备用。

上述的实施例中封闭液通过以下步骤得到：

取5g脱脂牛奶溶于100mLPBS溶液中，混匀后备用。

上述的实施例中SP2/0细胞完全培养液通过以下步骤得到：

HDMEM培养液 90V/V％

胎牛血清10 V/V％

上述的实施例中HAT选择培养液通过以下步骤得到：

HDMEM培养液 88V/V％

胎牛血清 10V/V％

HAT2 V/V％

上述的实施例中HT选择培养液通过以下步骤得到：

HDMEM培养液 88V/V％

胎牛血清 10V/V％

HT 2 V/V％

综上所述，本发明所提出的一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的制备方法及应用，操作过程简单，本发明制备的单克隆抗体将为PPE诊断方法建立和防控方案制定提供重要依据。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Arg Asp Leu Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Asn Ile Asn Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Thr Ser

1

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

His Gln Trp Ser Ile Phe Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr His Arg Asp Asn Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Met Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 8

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Asn Ile Asn Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asn Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Asp

65 70 75 80

Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ile Phe Pro Thr Phe

85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacgtaaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtactta cacgtaccat 180

cgagacaatc tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccatgaa caccctgtat 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccattt attactgtac aagagatttg 300

gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctca 339

<210> 10

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caaatagttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc 60

ctaacctgca gtgccagctc gaatataaat tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acttctccca aactcttgat ttataacaca tccaaactgg cttctggagt cccttctcgc 180

ttcagtggcg gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcagcagtgt ggaggctgac 240

gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtatttttc cgacgttcgg tggaggcacc 300

aagctggaaa tcaaa 315

Claims

1.一种猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；所述单克隆抗体的轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。

3.一种编码权利要求1所述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述核酸分子编码猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.一种载体，其含有权利要求3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体。

6.一种试剂盒，包含权利要求1所述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体。

7.权利要求1所述的猪源胞内劳森菌Omp2蛋白单克隆抗体在制备检测猪源胞内劳森菌试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：