CN108918869B - fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用。首先基于fiber2蛋白获得了能与禽4型腺病毒特异性抗体特异结合的重组FAdV‑4 fiber2蛋白，以及辣根过氧化物酶标记的抗FAdV‑4酶标抗体，并进一步利用所述重组蛋白作为包被蛋白，建立了血清中禽4型腺病毒抗体特异性阻断ELISA方法和检测试剂盒。该检测试剂盒灵敏度高、特异性强、稳定性好、能反映中和抗体水平，用于血清中禽4型腺病毒抗体的快速检测，具有操作简单、高特异性、高灵敏度、低成本的特点，能同时检测大量的样品，可以实时监控整体免疫效果及中和抗体水平，为该病的诊断和疫苗防控等提供了有力的基础和支持，具有很好的应用前景。

Description

fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面 的应用

技术领域

本发明属于养殖业疾病防控技术领域。更具体地，涉及fiber2蛋白及其重组蛋白在阻断ELISA法检测血清中4型禽腺病毒(FAdV-4)抗体方面的应用及检测方法和试剂盒。

背景技术

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAdV）归为腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)，根据抗原性差异，分为3个群，其中，Ⅰ群禽腺病毒（FAdVⅠ）具有共同的群抗原，共12个血清型，广泛存在于多种家禽的眼睛、上呼吸道及消化道内，大多数呈隐性感染或与其他疾病共同作用引起家禽发病或死亡。2015年以来，禽4型腺病毒在我国鸡群发病率呈上升趋势，引起以心包积液、肝脏肿大出血为特征的疾病，俗称安卡拉病，也称心包积液综合征，给当前家禽养殖业带来巨大危害。

该病临床上尚无有效的治疗措施，目前只是以饲养管理、卫生消毒、疫苗预防和控制种源等防治措施为主。可靠的抗体诊断技术在疫苗防控和种源选择等方面起着关键的作用。在疫苗开发及应用过程中，更需要一种能反映中和抗体水平的抗体检测方法。酶联免疫吸附测定（ELISA）是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

目前针对4型腺病毒特异性抗体的检测方法研究较少，国内外尚没有成熟的、商品化的针对4型禽腺病毒的特异性抗体的检测测试盒，特别是阻断ELISA方法鲜有报道。目前市场上仅有荷兰BioChek公司生产的针对Ⅰ群禽腺病毒特异性抗体开发的ELISA 检测试剂盒，用于检测血清中FADVⅠ抗体的含量。在无商品化针对4型禽腺病毒特异性抗体检测方法的现状下，临床上多通用Ⅰ群禽腺病毒抗体检测试剂盒检测4型腺病毒特异性抗体。但是利用该试剂盒检测鸡血清中的4型禽腺病毒特异性抗体的含量，特异性及敏感性差，且不能反映中和抗体水平。另外，专利201710205483.2公开了一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法，用于检测鸡血清中FAdV-4抗体的含量。该专利的基本技术手段是通过微量板包被重组FAdV-4 fiber-2蛋白，将稀释的鸡血清样品加入到微量孔中，样品中FAdV-4抗体将与包被的重组FAdV-4 fiber-2蛋白形成抗原抗体复合物，非特异性抗体和其它血清蛋白被洗去，将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体加入孔中，与抗原抗体复合物结合，然后再洗去未反应的结合物；加入双组份TMB显色液显色，然后加入2M硫酸溶液终止，如果FAdV-4抗体存在，则显黄色，颜色强度直接与样品中的该抗体的量有关。但是，针对FAdV-4抗体的间接ELISA检测方法容易出现与其他血清型禽腺病毒抗体的交叉反应，特异性较差。

在鉴于当前4型禽腺病毒对养鸡业造成了巨大经济损失的现状，急需一种特异性强、与血清病毒中和效价符合率高的抗体检测方法，以期为该病原的防控和净化提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有禽4型腺病毒特异性抗体检测技术的缺陷和不足，以杆状病毒昆虫细胞真核表达系统表达的重组FAdV-4 fiber2 蛋白和辣根过氧化物酶标记的抗重组FAdV-4 fiber2 蛋白的单克隆抗体为基础，研制灵敏度高、特异性强、稳定性好、能反映中和抗体水平且不产生与其他血清型禽腺病毒抗体的交叉的阻断ELISA抗体检测试剂盒，用于血清中4型禽腺病毒抗体的快速检测。本发明使用阻断ELISA方法，利用单克隆抗体的特异性，减少了检测样品中FAdV-4抗体时出现与其他血清型禽腺病毒抗体的交叉反应。

本发明的目的是提供一种fiber2蛋白。

本发明的另一目的是提供一种重组蛋白FAdV-4 fiber2。

本发明的再一目的是提供一种辣根过氧化物酶标记的抗重组FAdV-4 fiber2 蛋白的单克隆抗体。

本发明的再一目的是提供一种检测血清中禽4型腺病毒特异性抗体的阻断ELISA检测方法。

本发明的再一目的是提供一种检测血清样品中禽4型腺病毒特异性抗体的阻断ELISA检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供一种fiber2蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

基于fiber2所述fiber2蛋白，获得了一种能与禽4型腺病毒特异性抗体特异结合的重组FAdV-2 fiber2蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

并进一步获得辣根过氧化物酶标记的杂交瘤细胞制备的抗FAdV-4的单克隆抗体；并基于所述重组蛋白FAdV-4 fiber2作为包被蛋白及辣根过氧化物酶标记的杂交瘤细胞制备的抗FAdV-4的单克隆抗体，成功建立血清样品中禽4型腺病毒抗体特异性阻断ELISA检测方法，且该方法不产生与其他血清型禽腺病毒抗体的交叉反应。

优选地，所述重组蛋白FAdV-4 fiber2的制备方法包括以下步骤：

S1.真核表达：

以SEQ ID NO.1所示fiber2序列，设计特异性引物，上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，以FAdV-4病毒株核酸为模板，扩增FAdV-4 fiber2基因完整的开放阅读框，将其克隆至pFastBac杆状病毒载体，随后转化DH10Bac感受态细胞获得重组质粒rBacmid-fiber2，将重组质粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rB-fiber2，然后，用病毒感染复数为1的重组杆状病毒感染处于对数生长期的 Sf9 细胞，进行蛋白表达；

S2.蛋白纯化：收集重组杆状病毒感染后的 Sf9 细胞沉淀，进行裂解后收集上清，随后进行镍螯合亲和层析，获得纯化的FAdV-4 fiber2蛋白。

一种辣根过氧化物酶标记的抗FAdV-4的单克隆抗体，是以所述重组蛋白FAdV-4fiber2为免疫原制备得到，并以HRP标记。

具体地抗体制备方法如下：

（1）杂交瘤细胞株的筛选

选取5 只6-8 周龄雌性BALB/c 小鼠，用PBS 稀释纯化的重组FAdV-4 fiber2蛋白进行三次免疫；三免后一周断尾采血，以FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原，通过间接ELISA方法确定抗血清针对FAdV-4 fiber2蛋白的效价，待效价大于1:10 000，小鼠达到融合制备单克隆抗体的标准；选择1-2 只小鼠进行细胞融合安排；在融合前，用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，以FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原，通过间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选，将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释，获1株能稳定分泌FAdV-4 fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞株；

（2）单克隆抗体的大量制备与纯化

挑选经产BALB/c 小鼠，腹腔注射灭菌石蜡1 mL/只，7 d 后腹腔注射杂交瘤细胞；将处于对数生长期的细胞从细胞培养皿中轻轻吹下，500 rpm，离心5min，弃上清；用DMEM将细胞沉淀重悬，洗涤2 次，用DMEM 重悬后计数备用；每只小鼠腹腔注射2.5×10⁶个细胞，体积约为200µL；7～10 d 后，小鼠腹围明显增大，采集腹水，5 000 rpm，离心5 min 后收集上清保存于-80℃；取小鼠腹水单克隆抗体，用饱和硫酸铵沉淀方法和Protein A亲和层析纯化IgG；

（3）HRP标记单克隆抗体：纯化后单抗再用戊二醛二步交联法进行HRP标记，小量分装，-20℃保存。

另外，所述重组蛋白FAdV-4 fiber2或所述单克隆抗体在检测血清中禽4型腺病毒抗体方面的应用，以及在制备血清中禽4型腺病毒抗体的检测试剂盒方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述检测的方法为阻断ELISA法。

一种检测血清中禽4型腺病毒特异性抗体的阻断ELISA检测方法，是以所述重组蛋白FAdV-4 fiber2为包被抗原，利用阻断ELISA法进行检测。

优选地，所述血清中禽4型腺病毒特异性抗体的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

S1.以重组FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原，并封闭液封闭微孔表面未吸附位点（以重组FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原包被酶标板，并以含3%明胶的PBST为封闭液封闭微孔表面未吸附位点）；

S2.将待测血清加入包被抗原，待测血清中的抗体与包被抗原反应，形成固相免疫复合物；

S3.洗涤除去经反应后未结合物质，再加入辣根过氧化物酶标记的抗FAdV-4的单克隆抗体，未与待测血清中的抗体反应的包被抗原与酶标抗体反应，形成固相免疫复合物；

S4.洗涤未结合的酶标抗体，加入预先等体积混合的底物液和底物缓冲液，显色，用终止液终止反应，检测OD值，进行结果判定。

所述结果判定方法：

阴性对照平均OD₄₅₀nm值(NCX)NCX＝(A1孔OD₄₅₀值+A2孔OD₄₅₀值)/2

阳性对照平均OD值(PCX)PCX＝(B1孔OD₄₅₀值+B2孔OD₄₅₀值)/2

样品阻断率的计算阻断率（PI）＝(NCX﹣样品OD₄₅₀值)/NCX× 100%

NCX大于0.8，PCX小于0.3时，试验条件成立。

当PI值≥40%判为阳性，PI值≤35%判为阴性，35%＜PI值＜40%判为可疑，对可疑样品重新检测一次，PI＜40%，判为阴性。

一种检测血清中禽4型腺病毒特异性抗体的阻断ELISA检测试剂盒，包括由所述重组蛋白FAdV-4 fiber2包被的酶标板。

优选地，所述试剂盒还包括盒体、包括辣根过氧化物酶标记的抗FAdV-4的单克隆抗体、阳性血清对照及阴性血清对照、血清样品稀释液、浓缩洗涤液、底物缓冲液、底物液和反应终止液。

更具体地，所述试剂盒包括以下各组分：

（1）酶标板：酶标板孔内包被有所述重组蛋白FAdV-4 fiber2；

（2）酶标记物：1:50000稀释的HRP标记的抗FAdV-4的单克隆抗体，单克隆抗体原浓度为5mg/mL；

（3）阳性血清对照；

（4）阴性血清对照；

（5）血清样品稀释液：0.2M PB缓冲液；

（6）20X浓缩洗涤液：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-20 2mL、蒸馏水20 mL；

（7）底物缓冲液：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂ HPO₄·12 H₂O，吐温-20100μL，蒸馏水 1000 mL，pH5；

（8）底物液：四甲基联苯胺（TMB）700mg（40mL DMSO溶解），10.3g柠檬酸，蒸馏水1000 mL，pH2.4；

（9）终止液配方：2M 浓硫酸。

其中，优选地，所述酶标板是96孔酶标板，本发明实施例中所用酶标板为聚苯乙烯微孔板，包被有能与禽4型腺病毒特异性抗体特异结合的包被抗原，并封闭微孔表面未吸附位点。

优选地，所述酶标记物是辣根过氧化物酶标记的抗FAdV-4的单克隆抗体，所述单克隆抗体是利用重组FAdV-4 fiber2蛋白为免疫原，制备的针对FAdV-4病毒的单克隆抗体。

优选地，所述阳性血清对照为：经噬斑纯化后FAdV-4型毒株灭活后通过皮下注射途径免疫10日龄无特定病原鸡，21天后再经滴口途径感染无特定病原鸡，二次免疫后14天采集免疫鸡的血分离的血清，并以血清稀释液按1:1稀释。

优选地，所述阴性血清对照为：采集自无特定病原的SPF鸡血清，并以血清稀释液按1:1稀释。

优选地，所述血清样品稀释液为0.2M磷酸缓冲液，其通过称取Na₂HPO₄·12H₂O57.996g及NaH₂PO₄·2H₂O 5.928g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得。

所述底物缓冲液为含有3,3,5,5－四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液。

所述底物液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液。

所述终止液为1mol/L硫酸溶液。

另外，所述试剂盒的使用方法，即利用所述试剂盒检测血清中禽4型腺病毒特异性抗体的方法，包括如下步骤：

（1）加样：将所需数量的板条固定于板架，用血清稀释液在稀释板内将待检血清1:1稀释，即每孔先加50μl样品稀释液，再加50μl待检血清；每次实验设空白对照1孔（不加任何液体），阳性对照2孔、阴性对照2孔分别加入阳、阴性对照各100µL；

（2）温育：置37℃温育60分钟；

（3）洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30～60秒，弃去孔内洗液，重复洗涤（4次）拍干；

（4）加酶：空白对照孔不加酶标记物，其余孔加入酶标记物100µL；

（5）温育：置37℃温育30分钟；

（6）洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30～60秒，弃去孔内洗液。重复洗4次后拍干；

（7）显色：取适量底物缓冲液和底物液1:1震荡混匀，每孔加入100µL，置37℃温育10分钟；

（8）终止：每孔加入终止液50µL，轻拍混匀；

（9）读值：用酶标仪读值，在单波长450nm（须以空白对照孔调零）或双波长 450nm/620nm下读取各孔OD₄₅₀值；进行结果判定；

结果判定：

阴性对照平均OD₄₅₀nm值(NCX)NCX＝(A1孔OD₄₅₀值+A2孔OD₄₅₀值)/2

阳性对照平均OD₄₅₀值(PCX)PCX＝(B1孔OD₄₅₀值+B2孔OD₄₅₀值)/2

样品阻断率的计算阻断率＝(NCX﹣样品OD₄₅₀值)/NCX× 100%

NCX大于0.8，PCX小于0.3时，试验条件成立。

当PI值≥40%判为阳性，PI值≤35%判为阴性，35%＜PI值＜40%判为可疑，对可疑样品重新检测一次，PI＜40%，判为阴性。

本发明具有以下有益效果：

本发明对FAdV-2 fiber2 蛋白的选择和制备进行了科学的研究和设计，以杆状病毒昆虫细胞表达系统获得纯化的重组禽4型腺病毒 fiber2蛋白，并通过SPF鸡的攻毒保护试验，结果证明fiber2蛋白与FAdV-4诱发机体产生中和抗体有关。将纯化的重组FAdV-4fiber2蛋白作为免疫原制备抗FAdV-4单克隆抗体，并进行辣根过氧化物酶标记。将纯化的重组FAdV-4 fiber2蛋白作为包被抗原，利用HRP标记的抗FAdV-4单克隆抗体作为阻断抗体成功建立了灵敏度、特异性、稳定性很好的阻断ELISA抗体检测方法，用以检测血清样品中禽4型腺病毒抗体，且不产生与其他血清型禽腺病毒抗体的交叉，填补了针对禽4型腺病毒特异性抗体的检测试剂、检测产品和检测方法的空白。

本发明以杆状病毒昆虫细胞表达表达的禽4型腺病毒 fiber2 蛋白和辣根过氧化物酶标记的抗FAdV-4单克隆抗体为基础，研制灵敏度高、特异性强、稳定性好、能反映中和抗体水平的ELISA抗体检测试剂盒，用于血清中禽4型腺病毒抗体的快速检测。

本发明进一步开发的FAdV-4阻断ELISA抗体检测试剂盒，能够特异性检测血清中的抗FAdV-4 IgG，与血清中的中和抗体水平相关性好，且不产生与其他血清型禽腺病毒抗体的交叉，具有很好特异性和灵敏性，检测时间短，能同时检测大量的样品，而且本发明试剂盒保存时间长，稳定性好。本发明对解决大批量样品血清中的禽4型腺病毒抗体检测具有重要的现实意义，通过对禽群血清样品的检测，可以实时监控禽群的整体免疫效果及中和抗体水平，为该病的诊断和疫苗防控等提供了有力的工具。

附图说明

图1为本发明检测血清4型禽腺病毒抗体的酶联免疫试剂盒的保存稳定性试验结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 FAdV-4 fiber2 蛋白的选择和制备

1、经过分析，hexon、penton和fiber是主要结构蛋白，构成了禽4型腺病毒的核衣壳。FAdV-4具有两条纤维，分别为一条长的纤维（fiber1）和一条短的纤维（fiber2）。其中fiber2对病毒的增殖、组装或扩散某个阶段是必要的，缺少fiber2不能产生病毒粒子。纤维上有主要的种特异性抗原决定簇和次要的亚属特异性抗原决定簇。纤维蛋白可识别细胞膜上的特异性受体，即病毒颗粒通过纤维蛋白与细胞受体结合，从引起感染。另外，纤维蛋白还具有抗原性。本发明的重组fiber2蛋白是通过杆状病毒昆虫细胞表达系统获得的。

2、蛋白制备

（1）序列获得

本发明2014-2017年对血清4型FAdV进行流行病学监控，通过病毒分离、fiber2序列测定、序列同源性及进化分析等对该病毒的fiber2变异情况进行分析，筛选出目标病毒株，以该病毒株fiber2蛋白碱基序列为目标fiber2蛋白碱基序列，如SEQ ID NO.1所示。

（2）蛋白表达：

以上述fiber2序列作为参考，设计特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4，上下游引物中分别含有BamHI和HindⅢ酶切位点。以筛选出的FAdV-4病毒株核酸为模板，扩增FAdV-4 fiber2基因完整的开放阅读框，反应体系为：Taq酶10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1μL，超纯水8μL，将以上反应体系混匀离心，置于PCR 扩增仪中按照以下程序进行扩增： 94℃预变性4 min； 94℃变性30s， 55 ℃退火30 s， 72℃延伸 40s，共进行30个循环；72℃终延伸7 min。随后进行杆状病毒真核表达：将PCR产物进行胶回收纯化后与pFastBac杆状病毒载体共同使用BamHI和HindⅢ进行双酶切，将酶切后的线性pFastBac及fiber-2基因片段再次进行胶回收纯化，随后将带有BamHI和HindⅢ 酶切位点的fiber-2片段及pFastBac载体进行连接，获得pFastBac-fiber2重组质粒，随后转化DH10Bac感受态细胞获得重组质粒rBacmid-fiber2，将重组质粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rB-fiber2。然后，用病毒感染复数（Multiplicity of infection，MOI）为1 的重组杆状病毒感染处于对数生长期的Sf9 细胞，放入28℃细胞培养箱中培养约72 h，收集培养物。将培养物离心后（5000rpm，10min，4℃）取细胞沉淀（用PBS吹散）。

（3）蛋白纯化：

收集重组杆状病毒感染后的Sf9 细胞沉淀，用PBS（含1% Triton X-100）重悬细胞沉淀（1×10⁷ cells/mL裂解液），冰上裂解30 min，在细胞裂解过程中加入蛋白酶抑制；细胞裂解液经12,000 g 离心30 min 除去细胞核以及较大的碎片，收集上清，随后进行镍螯合亲和层析，在上镍螯合亲和层析柱前，所有样品都需要用0.45µm滤膜过滤后才能上柱纯化。纯化蛋白全程都在 4℃条件下进行，蛋白纯化的具体步骤如下：

1）首先用5倍柱体积的蒸馏水冲洗镍柱，以便除去柱子中的乙醇。

2）用5倍柱子体积的0.1 M NiSO4 冲洗柱子，以便使镍离子结合到柱子上。

3）用5倍柱子体积的Binding Buffer（20 mM 磷酸钠，pH 7.4）平衡柱子。

4）用0.45 µm 滤膜过滤后的细胞上清液上样，上样速度为20 个柱子体积1h。

5）用10 倍柱体积的Binding Buffer冲洗镍柱，直到样品被柱子完全吸附。

6）用10 倍柱体积的Washing Buffer （20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，70 mMImidazole，pH 7.4）冲洗柱子。

7）用5倍柱子体积的Elution Buffer（20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，500 mMImidazole，pH 7.4）洗脱蛋白，收集纯化的蛋白产物，-80℃保存。

获得重组FAdV-4 fiber2蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 动物攻毒保护试验

1、实验材料

实验动物：1日龄无攻毒任何疫苗的SPF鸡75只。

免疫疫苗：FAdV-4全病毒灭活苗，重组FAdV-4 fiber2蛋白亚单位油苗，hexon蛋白亚单位油苗，PBS作为对照。

攻毒毒株：FAdV-4病毒液，PBS作为对照。

2、实验方法

免疫日龄：10日龄。

攻毒日龄：免疫后7天。

试验动物共分为灭活苗、重组FAdV-4 fiber2、hexon、免疫空白对照组及空白对照组，每组15只，于10天龄进行免疫，于免疫后1周进行攻毒。其中攻毒对照组以PBS作为免疫对照，空白组以PBS作为攻毒和免疫对照。攻毒后逐日观察并记录鸡只的精神状态、饮食、饮水情况，发病和病死情况。

3、实验结果

攻毒后第8天，各组存活率如表1所示。

表1

根据动物攻毒保护试验结果，重组FAdV-4 fiber2蛋白亚单位疫苗能使机体产生对FAdV-4的有效保护力，且效果优于全病毒灭活苗及hexon亚单位疫苗，这说明fiber2蛋白与诱导机体产生中和抗体有关，与临床保护力密切相关。

实施例3 酶标抗体的制备

（1）杂交瘤细胞株的筛选

选取5 只6-8 周龄雌性BALB/c 小鼠，用PBS 稀释纯化的重组FAdV-4 fiber2蛋白进行三次免疫。三免后一周断尾采血，以FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原，通过间接ELISA方法确定抗血清针对FAdV-4 fiber2蛋白的效价，待效价大于1:10 000，小鼠达到融合制备单克隆抗体的标准。选择1-2 只小鼠进行细胞融合安排。在融合前，用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，以FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原，通过间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选，将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释，获1株能稳定分泌FAdV-4 fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞株，被命名为分泌FAdV-4 fiber2蛋白单克隆抗体细胞2G1株，简称2G1细胞。

（2）细胞的冻存

将处于对数生长期的杂交瘤细胞从细胞培养皿中轻轻吹下，1 000 rpm，离心3min，弃尽上清。用新鲜配制的冻存液重悬细胞沉淀，分装于冻存管中，细胞密度约为10⁶～10⁷个/mL，1 mL/管。先将冻存管放在-20℃冰箱中，再置于-80℃冰箱过夜，之后移入液氮罐中长期保存。

（3）细胞的复苏不定期对冻存的杂交瘤进行复苏，检验其生长情况。从液氮罐中取出冻存的杂交瘤细胞，迅速放入37℃水浴中，轻轻晃动使其完全融化。1 000 rpm离心3min，弃上清。用20% DMEM 培养液悬浮沉淀，加入细胞培养皿中，置于37℃，5% CO₂培养箱内培养，观察细胞生长情况。

（4）单克隆抗体的大量制备与纯化

挑选经产BALB/c 小鼠，腹腔注射灭菌石蜡1 mL/只，7 d 后腹腔注射杂交瘤细胞。将处于对数生长期的细胞从细胞培养皿中轻轻吹下，500 rpm，离心5min，弃上清。用DMEM将细胞沉淀重悬，洗涤2 次，用DMEM 重悬后计数备用。每只小鼠腹腔注射2.5×10⁶个细胞，体积约为200µL。7～10 d 后，小鼠腹围明显增大，采集腹水，5 000 rpm，离心5 min 后收集上清保存于-80℃。取2G1小鼠腹水单克隆抗体，用饱和硫酸铵沉淀方法和Protein A亲和层析纯化IgG。

（4）HRP标记单克隆抗体

纯化后单抗再用戊二醛二步交联法进行HRP标记，具体步骤为：

1)HRP醛化：用0.01mol/LpH6.8PBS将25%戊二醛稀释为1.25%，取10mg HRP溶于0.2mL1.25%戊二醛，室温(20℃左右)结合18h；将反应物通过预先用0.15mol/L NaCL平衡的Sephadex G-50凝胶柱，用平衡液洗脱，去除游离的戊二醛，或对0.01mol/L、pH7.2PBS，4 ℃透析过夜；

2)标记：将5mg抗体IgG溶于1mL 0.15mol/L NaCl溶液，加入上述醛化HRP溶液(10mg/mL)混合，加入0.1mL 1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液，调节pH至9.0～9.5，于4℃电磁搅拌下结合24h，然后加入0.1mL 0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，以封闭残留的醛基，终止反应；

3)分离纯化：通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液。最后，加入终体积为60%的甘油防腐，小量分装，-20℃保存。

（5）酶标记物的检验

1)性状无色透明液体，无臭、无味。

2)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

3)效价测定：腹水从 1:500 开始做 2 倍倍比稀释，分别用重组FAdV-4 fiber2蛋白和FAdV-4全病毒作为包被抗原，用直接ELISA 方法测定其效价。三批酶标抗体Hab01、Hab02、Hab03的效价均为1:10000。

（6）酶标抗体的配制

将检验合格的酶标抗体，按1:5000比例进行稀释，加入proclin300后，无菌分装于棕黑色瓶内，50ml/瓶，4℃保存。

实施例4 FAdV-4 抗体阻断ELISA检测方法的构建

基于实施例1获得的重组蛋白FAdV-4 fiber2，构建了血清中禽4型腺病毒特异性抗体的阻断ELISA检测方法，包括如下步骤：

（1）以重组FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原，并封闭液封闭微孔表面未吸附位点（以重组FAdV-4 fiber2蛋白为包被抗原包被酶标板，并以含3%明胶的PBST为封闭液封闭微孔表面未吸附位点）；

（2）将待测血清加入（酶标板）包被抗原，待测血清中的抗体与包被抗原反应，形成固相免疫复合物；

（3）洗涤除去经反应后未结合物质，再加入酶标抗体，未与待测血清中的抗体反应的包被抗原与酶标抗体反应，形成固相免疫复合物；

（4）洗涤未结合的酶标抗体，加入预先等体积混合的底物液和底物缓冲液，显色，用终止液终止反应，检测OD值，进行结果判定。

所述结果判定方法：

阴性对照平均OD₄₅₀nm值(NCX)NCX＝(A1孔OD₄₅₀值+A2孔OD₄₅₀值)/2

阳性对照平均OD₄₅₀值(PCX)PCX＝(B1孔OD₄₅₀值+B2孔OD₄₅₀值)/2

样品阻断率的计算阻断率＝(NCX﹣样品OD₄₅₀值)/NCX× 100%

NCX大于0.8，PCX小于0.3时，试验条件成立。

当PI值≥40%判为阳性，PI值≤35%判为阴性，35%＜PI值＜40%判为可疑，对可疑样品重新检测一次，PI＜40%，判为阴性。

实施例5 FAdV-4 抗体检测试剂盒的组建

基于实施例4的酶联免疫检测方法，构建了试剂盒血清样品中禽4型腺病毒特异性抗体的阻断ELISA检测试剂盒，包含如下组分：

（1）酶标板：酶标板孔内包被有所述重组蛋白FAdV-4 fiber2；

（2）酶标记物：1:50000稀释的HRP标记的抗FAdV-4的单克隆抗体；

（3）阳性血清对照；

（4）阴性血清对照；

（5）血清样品稀释液：0.2M PB缓冲液；

（6）20X浓缩洗涤液：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-20 2mL、蒸馏水20 mL；

（7）底物缓冲液：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂ HPO₄·12 H₂O，吐温-20100μL，蒸馏水 1000 mL，pH5；

（8）底物液：四甲基联苯胺（TMB）700mg（40mL DMSO溶解），10.3g柠檬酸，蒸馏水1000 mL，pH2.4；

（9）终止液配方：2M 浓硫酸。

其中，所述酶标板是96孔酶标板，本发明实施例中所用酶标板为聚苯乙烯微孔板，包被有能与禽4型腺病毒特异性抗体特异结合的包被抗原，并封闭微孔表面未吸附位点。

所述酶标记物是辣根过氧化物酶标记的抗FAdV-4的单克隆抗体，所述单克隆抗体是利用重组FAdV-4 fiber2蛋白为免疫原，制备的针对FAdV-4病毒的单克隆抗体。

所述阳性血清对照为：经噬斑纯化后FAdV-4型毒株灭活后通过皮下注射途径免疫10日龄无特定病原鸡，21天后再经滴口途径感染无特定病原鸡，二次免疫后14天采集免疫鸡的血分离的血清，并以血清稀释液按1:1稀释。

所述阴性血清对照为：采集自无特定病原的SPF鸡血清，并以血清稀释液按1:1稀释。

所述血清样品稀释液为0.2M磷酸缓冲液，其通过称取Na₂HPO₄·12H₂O 57.996g及NaH₂PO₄·2H₂O 5.928g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得。

所述底物缓冲液为含有3,3,5,5－四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液。

所述底物液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液。

所述终止液为1mol/L硫酸溶液。

实施例5 试剂盒使用方法及结果计算

使用前应将所有试剂恢复至室温(18～25℃)。20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用。

具体地所述试剂盒的使用方法，即利用所述试剂盒检测血清中禽4型腺病毒特异性抗体的方法，包括如下步骤：

（1）加样：将各试剂轻轻旋转或振荡，使之均匀；将所需数量的板条固定于板架，用血清稀释液在稀释板内将待检血清1:1稀释，即每孔先加50μl样品稀释液，再加50μl待检血清；每次实验设空白对照1孔（不加任何液体），阳性对照2孔、阴性对照2孔分别加入阳、阴性对照各100µL；

（2）温育：置37℃温育60分钟；

（3）洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30～60秒，弃去孔内洗液，重复洗涤（4次），将酶标板倒置在吸水纸上拍干；

（4）加酶：空白对照孔不加酶标记物，其余孔加入酶标记物100µL；

（5）温育：置37℃温育30分钟；

（6）洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30～60秒，弃去孔内洗液。重复洗4次后拍干；

（7）显色：取底物缓冲液和底物液等体积混匀，每孔加入100µL，在暗处37℃显色10分钟；

（8）终止：每孔加入终止液50µL，轻拍混匀；

（9）读值：酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD₄₅₀值；进行结果判定；

临界值确定：用建立好的阻断ELISA检测已知背景信息50份临床鸡血清，把本方法得到的阻断率（(NCX﹣样品OD₄₅₀值)/NCX× 100%））和血清的背景信息导入SPASS软件,用ROC曲线做分析, 根据统计结果中各可能切点的灵敏度和特异度，计算Youden指数，并选择其最大的切点为临界点，确定本方法CUT-OFF为40%，检测灰区为35%～40%，在此范围的检测结果需要做重复。

结果判定：

阴性对照平均OD₄₅₀nm值(NCX)NCX＝(A1孔OD₄₅₀值+A2孔OD₄₅₀值)/2

阳性对照平均OD₄₅₀值(PCX)PCX＝(B1孔OD₄₅₀值+B2孔OD₄₅₀值)/2

样品阻断率的计算阻断率＝(NCX﹣样品OD₄₅₀值)/NCX× 100%

NCX大于0.8，PCX小于0.3时，试验条件成立。

当PI值≥40%判为阳性，PI值≤35%判为阴性，35%＜PI值＜40%判为可疑，对可疑样品重新检测一次，PI＜40%，判为阴性。

实施例6 试剂盒保存期稳定性实验

将FAdV-4抗体检测试剂盒中的抗原包被ELISA板和酶标记物，置37℃恒温箱中加速老化，将其余成分仍放于4℃。抗原包被ELISA板和酶标记物于37℃恒温箱中放置1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d后，依次取出继续保存于4℃。当抗原包被ELISA板和酶标记物于37℃恒温箱中放置至第7d后，取出所有之前保存于4℃的抗原包被ELISA板和酶标记物，对背景已知的7份被检血清（5份阳性血清P1、P2、P3、P4、P5，2份阴性血清N1、N2）进行检测，以判断抗原包被ELISA板和酶标记物的保存情况。保存期测定结果如图1所示。

从结果可知抗原包被ELISA板和酶标记物在37℃恒温箱中放置7d，其检测结果数值仍较稳定，说明试剂盒中的酶标抗原在37℃恒温箱中可保存一周，即相对于4℃能保存一年。

实施例7 试剂盒特异性实验

用重组FAdV-fiber2蛋白以10倍的反应浓度与FAdV-4阳性血清混合，进行阻断试验。即以吸附阳性血清后的fiber2蛋白为包被抗原进行间接ELISA检测临床阳性血清样品，所测抗体的OD值显著降低，（N-P）/N的值均大于0.5，阻断阳性。阻断试验的结果表明，以FAdV-4 fiber2蛋白为抗原检测FAdV-4血清具有良好的的特异性。

（N-P）/N= (未阻断孔OD值一阻断孔OD值)/未阻断孔OD值（此比值大于0.5即判为阻断阳性）

按照已建立好的阻断ELISA方法，分别取鸡4型腺病毒阳性血清、鸡H9亚型禽流感病毒阳性血清（H9 AIV）、鸡H5亚型禽流感病毒阳性血清（H5 AIV）、鸡3型腺病毒阳性血清（FAdV-3）、鸡新城疫病毒阳性血清（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒阳性血清（IBV）进行交叉试验。结果显示，4型腺病毒阳性血清ELISA试验平均PI值较高，在50.0%以上，而与鸡H9亚型禽流感病毒阳性血清、鸡H5亚型禽流感病毒阳性血清、鸡3型腺病毒阳性血清、鸡新城疫病毒阳性血清和鸡传染性支气管炎病毒阳性血清反应的平均PI值则比较低，均在35.0%以下，结果说明建立的阻断ELISA具有较好的特异性（表2）。

表2

根据阻断试验和交叉试验结果可知该试剂盒其特异性较好，可用于禽4型腺病毒的血清学诊断。

实施例8 试剂盒敏感性实验

选择保存的1份强阳性血清(S1)、1份中等阳性血清(S2)、2份弱阳性血清（S3、S4），一份阴性血清S5，分别进行倍比稀释（25～6400），设置重复孔，按优化的阻断ELISA方法进行检测，读取其OD₄₅₀值并计算PI值。

表3

由表3可见，强阳性血清经6400倍稀释，中等阳性血清经1600倍稀释，弱阳性血清经800倍稀释，PI值均大于40%，而阴性样品经25～6400倍稀释，OD₄₅₀值均小于35%，表明该方法具有良好的敏感性。

实施例9 与中和试验符合率比较

将建立的阻断ELISA方法与病毒中和试验对150份临床血清进行检测，结果如表4。

表4

由结果可以看出，本发明所建立的阻断ELISA方法与病毒中和试验的阳性符合率为96.2%，阴性符合率为100%，两者总符合率为94.8%。

实施例10 与荷兰BioChekⅠ群禽腺病毒抗体ELISA 试剂盒符合率比较

将建立的fiber2蛋白ELISA方法对150份临床血清进行检测，结果与荷兰BioChekⅠ群禽腺病毒抗体ELISA 试剂盒比较。结果如表5。

表5

由结果可以看出，本试验所建立的阻断ELISA方法与BioChekⅠ群禽腺病毒抗体ELISA 试剂盒的阳性符合率为76.5%，阴性符合率为69.3%，两者总符合率为73.8%。

实施例11 禽4型腺病毒新型抗体检测试剂盒的包装规格设计

对本发明所建立的酶联免疫试剂盒方法进行包装规格设计，利于实现该试剂盒的产业化和实际检测的方便应用。本发明所建立的酶联免疫试剂盒方法按照以下规格进行产品组装：产品规格：96孔/板，5板/盒，产品组分如表6所示：

表6

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 新兴县国研科技有限公司、广东温氏食品集团股份有限公司

<120> fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> fiber2蛋白编码核苷酸序列(fiber2 nucleotide sequence)

<400> 1

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccggag ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagagaccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgcc 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtc gaacatacag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgggca tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tacgatatag tctgcagacc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

<210> 2

<211> 1458

<212> DNA

<213> 重组蛋白FAdV-4 fiber2编码核苷酸序列(Recombinant protein FAdV-4 fiber2nucleotide sequence)

<400> 2

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccggag ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagagaccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgcc 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtc gaacatacag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgggca tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tacgatatag tctgcagacc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgcat 1440

catcatcatc atcattaa 1458

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 上游引物(forward primer)

<400> 3

ctaggatcca tgctccgggc cccta 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 下游引物(reverse primer)

<400> 4

caggaagctt aatgatgatg atgatg 26

Claims (3)

1.重组蛋白FAdV-4 fiber2和辣根过氧化物酶标记的抗重组FAdV-4 fiber2蛋白的单克隆抗体在制备血清中禽4型腺病毒抗体的检测试剂盒方面的应用，其特征在于，编码所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述单克隆抗体是以重组FAdV-4 fiber2蛋白为免疫原制备得到，并以HRP标记。

2.一种检测血清中禽4型腺病毒特异性抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括由权利要求1所述重组蛋白FAdV-4 fiber2包被的酶标板以及辣根过氧化物酶标记的抗FAdV-4的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性血清对照及阴性血清对照、血清样品稀释液、浓缩洗涤液、底物缓冲液、底物液和反应终止液。

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