CN106198974A - 一种快速检测虹鳟鱼血清中ihnv抗体的elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒，包含：纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原、酶标板，兔抗虹鳟鱼IgG作为二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为酶标三抗。本发明的ELISA检测试剂盒是一种快速、特异性强、灵敏性高、检测方便、批量化使用、商品化程度高的虹鳟鱼IHNV抗体检测试剂盒。可用于虹鳟鱼IHNV抗体的检测，不与其他弹状病毒科病毒发生交叉反应，可实现批量样本的检测。

Description

一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及动物传染病病原微生物检测领域，尤其是涉及一种快速、准确检测虹鳟鱼传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒。

背景技术

传染性造血器官坏死病是一种能够引起鲑鱼、鳟鱼等鲑鱼的急性传染病。是由传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)引起的，属于弹状病毒科成员。其发病特征主要以肾脏和脾脏等造血器官坏死为主，主要传播途径是患病鱼类或者是感染病毒鱼卵的进出口。该病最早流行于美国西北太平洋地区，随后传遍整个北美、亚洲和欧洲。1985年，IHNV病毒进入我国东北境内，并在辽宁本溪市大规模爆发流行。近几年，在河北、甘肃、深圳和北京等养殖场也检测到了IHNV，并给当地的冷水养殖业造成严重的经济损失。IHNV主要危害刚孵育的鱼苗到四周龄的鲑科幼鱼，感染后死亡率可达到70％-90％，目前已成为制约虹鳟鱼养殖业发展的重要威胁并被世界动物卫生组织(IEO)列为必报动物疫病，为鱼类进出口第一类检疫对象，我国列为第二类动物疫病。由于病毒病尚无有效的治疗方法，因此，病毒性疾病的早期快速检测对控制该病的爆发流行至关重要。目前，我国对于IHNV病毒的检测方法的研究相对比较落后，常用的分子生物学检测方法主要是检测病毒核酸的PCR方法。由于IHNV相应抗原的制备工艺复杂，产量低的原因，免疫学检测技术的研究尚有很大的空缺。无论是感染还是免疫监测，都需要建立一个虹鳟鱼抗体的高通量检测技术。

IHNV的糖蛋白(简称G蛋白)是病毒的主要抗原，能够诱导产生中和抗体和刺激细胞免疫。此外，糖蛋白还参与病毒与细胞受体的识别和结合的过程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、特异性强、灵敏性高、使用方便可商品化的虹鳟鱼IHNV抗体检测试剂盒。可用于虹鳟鱼IHNV抗体的检测，不与其他弹状病毒科病毒发生交叉反应，可实现批量样本的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒，包含：纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原、酶标板，兔抗虹鳟鱼IgG作为二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为酶标三抗。

还包含：稀释液、显色液、终止液、阳性血清和/或阴性血清。

本发明进一步提供上述作为抗原的纯化的IHNV重组G蛋白的制备方法：

(1)将IHNV分离株G蛋白膜外表达区进行真核表达；

(2)利用pFB-LIC-Bse杆状病毒载体以及rBacmid-G重组杆粒在sf9昆虫细胞中获得重组G蛋白；

(3)纯化。

步骤(1)是从传染性造血器官坏死病病毒IHNV中扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区。

用于扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区的特异性引物的核苷酸序列优选为：

F：5'-ATGGACACCATGATCACCAC-3'；

R：5'-CTACCAGTGGAGT-3'。

作为二抗的兔抗虹鳟鱼IgG的制备方法是：虹鳟鱼血清经纯化获得IgM后将其免疫大耳白兔，获得针对虹鳟鱼IgM的特异性抗体IgG。

本发明继续提供使用上述试剂盒检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的方法，用纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原包被酶标板，过夜；将待检血清、二抗、三抗稀释，分别反应后进行ELISA测定。

所述抗原IHNV重组G蛋白的包被浓度优选为2μg/ml，待检血清的稀释度优选为1:5。

所述二抗稀释浓度优选为1:1000，三抗稀释倍数优选为1:4000。

待检血清结合时间为60min，二抗结合时间为60min，三抗作用时间为30min。

反应后测定OD450值，进行OD450值平均值X、标准方差S.D的计算；计算出OD450的平均值和标准方差S.D，确定阳性血清临界值为0.24，阴性血清临界值为0.206，即当被检血清样品的OD450≥0.24时，判为阳性；OD450＜0.206判为阴性。

进一步说明如下：本发明重点涉及IHNV的G蛋白抗原的表达、纯化、免疫原性分析，虹鳟鱼血清免疫球蛋白IgM的提取和纯化，兔抗虹鳟鱼免疫球蛋白IgG的制备，建立检测IHNV病毒血清抗体的ELISA检测试剂盒。最优选的具体操作为：

(1)本发明所用IHNV病毒株为实验室分离，根据GeneBank中登陆的IHNV基因序列(L40883)用Primer5设计引物。

(2)本发明采用RT-PCR方法从传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)中扩增糖蛋白(G)基因中1380bp的膜外表达区，将其克隆至pFB-LIC-Bse杆状病毒载体中，构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G，转化至感受态细胞DH10Bac中，获得重组杆粒rBacmid-G。再将其转染至sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒。IFA和Western blot分析鉴定重组G蛋白可被抗组氨酸单抗(anti-his)以及anti-IHNV鼠血清特异性识别，即IHNV G基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达。

(3)本发明用以制备兔抗鱼二抗的血清取自虹鳟鱼IHNV阴性血清，共30ml。

(4)使用GE公司预装HiTrap Protein A HP柱1mL对虹鳟鱼IHNV阴性血清进行亲和层析，目的是获得虹鳟鱼免疫球蛋白IgM。层析中所用的条件和缓冲液浓度等均经过摸索，以达到最佳效果。鱼血清用20-200ml PBS稀释，其中以100ml PBS稀释效果最佳。用0.45μm膜过滤，以0.1-1mg/ml的流速上样，其中以0.5mg/min的流速上样最优,并过夜反复循环上样。用5-50倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/L PBS,pH7.0)洗去未结合的蛋白，其中以30倍柱体积的结合缓冲液洗脱未结合的蛋白效果最佳。再用5-15倍柱体积的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.5)缓冲液洗脱结合的蛋白，其中以10倍柱体积的缓冲洗脱液洗脱效果最佳。用nanodrop蛋白测定系统，测定虹鳟鱼IgM浓度。本发明采用Bio-Rad非连续缓冲系统垂直板电泳，对纯化的虹鳟鱼IgM进行纯度分析。

(5)将获得的纯化虹鳟鱼IgM免疫大耳白兔，目的是获得兔抗虹鳟鱼IgM的血清。与弗氏完全佐剂混合对大耳白兔进行初免，100μg/只，加强免疫用纯化IgM与弗氏不完全佐剂混合，100μg/只，进行3次加强免疫，在3免和4免疫后7天采血，分离血清测效价，血清效价可达到1:8000，最高达到1：32000，4次免疫后10天采血收集全部兔血清。

(6)使用GE公司预装HiTrap Protein G HP柱1mL对获得的兔抗虹鳟鱼IgM的血清进行亲和层析，目的是获得兔抗虹鳟鱼免疫球蛋白IgG。兔血清用50-200ml PBS稀释，其中以100ml PBS稀释效果最佳。用0.45μm膜过滤，以0.1-1mg/ml的流速上样，其中以0.5mg/min的流速上样最优。然后用1-8倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/L PBS,pH7.0)洗去未结合的蛋白,其中以5倍柱体积的结合缓冲液效果最好。再用6倍柱体积的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.5)缓冲液洗脱结合的蛋白，结合蛋白以1mL管为单位分步收集到含30μL pH9.0的Tris-Cl中和液的收集管中。用nanodrop蛋白测定系统，测定兔IgG浓度。本发明采用Bio-Rad非连续缓冲系统垂直板电泳，对纯化的兔IgG进行纯度分析。

(7)本发明将IHNV重组G蛋白抗原用包被液按照以下比例进行稀释：0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml共6个稀释度，每孔加入100μL，4℃包被过夜，其中以2μg/ml最适。

(8)用血清稀释液将虹鳟鱼IHNV阳性血清和阴性血清稀释成以下稀释度：1：1、1：2、1：5、1：10、1：20和1：50组成方阵，每孔加100μL，37℃反应。反应时间设置为60min。其中血清稀释度以1:5最佳。

根据上述确定的G蛋白最佳包被浓度和虹鳟鱼血清最适稀释倍数，将兔抗虹鳟鱼IgG用稀释液按照以下稀释度进行稀释：1：200、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000，37℃进行反应，反应时间设置为60min。其中二抗的工作浓度以1:1000为最佳。

(9)根据上述确定的G蛋白最佳包被浓度、虹鳟鱼血清和兔抗虹鳟鱼IgG的最佳稀释倍数，将HRP标记的山羊抗兔IgG按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000，37℃进行反应，反应时间设置为30min，其HRP标记的山羊抗兔的抗体最佳稀释倍数是1:4000。

(10)本发明用相同批次以及3批制备并纯化的IHNV重组G蛋白，经包被、封闭后与同一批次的阳性血清和阴性血清在相同条件下进行反应，结果进行统计学分析，证明该方法的批内和批间重复性都很好。

(11)本发明用IHNV阳性血清和重组G蛋白预先作用，以及用VHSV和HRV阳性血清，进行同IHNV抗体ELISA相同的检测，观察IHNV阳性血清和G蛋白反应的特异性以及其他病毒阳性血清与IHNV G蛋白之间有无交叉反应，从而确定该方法的特异性。

与以往检测技术相比，本发明有以下优点：

本发明所用抗原为IHNV的G蛋白，它是该病毒五个结构蛋白中抗原表位最为丰富，免疫原性最好的一种结构蛋白，能够诱导产生中和抗体并刺激细胞免疫。本发明构建的G蛋白杆状病毒表达系统除了具有真核表达系统的普遍优点外，还具有产生蛋白周期短、蛋白产量高，是以往原核表达系统在再现重组G蛋白免疫原性和反应原性方面所不具有的优点。

本发明针对虹鳟鱼血清提纯的免疫球蛋白IgM和用虹鳟鱼IgM免疫大耳白兔制备的兔抗虹鳟鱼免疫球蛋白IgG，实属首次报道，尤其是虹鳟鱼血清提纯的免疫球蛋白IgM步骤，未见文献报道，经过多次摸索和优化，得到纯度和浓度满足下一步实验的要求。经免疫大耳白兔制备了兔抗虹鳟鱼IgG，克服了抗虹鳟鱼的二抗没有商品化的问题，再经酶标山羊抗兔IgG反应，达到特异性检测虹鳟鱼血清中抗体的目的。

附图说明

图1是IHNV G基因PCR扩增产物图，其中M为DL2000分子量marker；1，2为IHNV G基因PCR扩增条带；

图2是重组杆粒rBacmid-G PCR鉴定结果，其中M为DL15000分子量marker；1，2为rBacmid-G经M13/pUC通用引物PCR扩增条带；

图3是重组杆粒rBacmid-G PCR鉴定结果，其中M为DL2000分子量marker；1，2为rBacmid-G经pFB-IHNV-G引物PCR扩增条带；3为阴性对照；

图4是rBacmid-G转染sf9昆虫细胞结果(×250)，其中A为正常sf9细胞；B为转染rBacmid-G 72h后的sf9细胞；

图5是重组G蛋白的ECL-Western-Blot鉴定结果(用anti-his单抗)，其中1,接种重组病毒的sf9细胞上清；2-4,接种重组病毒的sf9细胞沉淀；

图6是重组G蛋白的DAB-Western-Blot鉴定(用anti-IHNV鼠血清)，其中1,细胞上清；2、3,细胞沉淀裂解；M,Protein marker；

图7是用IFA检测sf9细胞表达的IHNV G蛋白(×400)，其中A为转染rBacmid-G 72h后的sf9细胞；B为正常sf9细胞；

图8是虹鳟鱼IgM的SDS-PAGE鉴定图，其中M为低分子量标准蛋白质；1，2为纯化虹鳟鱼IgM；

图9是兔抗虹鳟鱼IgG的SDS-PAGE鉴定图，其中M为低分子量标准蛋白质；1，2为1、2号大耳白兔纯化IgG 10μg上样条带；3为2号大耳白兔纯化IgG 2μg上样条带。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 IHNV G蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及活性检测

1.重组表达载体构建

1.1引物设计 根据GenBank中登录的IHNV G基因序列(L40883)，用TMHMM在线分析其跨膜区，选取G蛋白1380bp的膜外表达区,用primer 5.0设计特异性IHNV-G上下游引物，结合pFB-LIC-Bse载体质粒的LIC克隆位点，添加终止密码子，并在上游引物中添加Kozak序列以利于基因表达，设计pFB-IHNV-G引物对，鉴定重组病毒通用引物为M13/pUC。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1引物序列

1.2 IHNV病毒繁殖 用含10％胎牛血清的199/EBSS培养CHSE细胞，于20℃培养，待细胞长成单层后，接种IHNV种毒，15℃感作1h，补充含2％胎牛血清的M199继续于15℃培养，约72h后收获病毒。

1.3 RNA的提取以及目的片段扩增 按照RNA提取试剂盒说明书对收获病毒进行RNA提取，用one step RT-PCR试剂盒进行反转录及G全长基因扩增。PCR反应程序如下：94℃变性3min；94℃变性20s，56℃退火30s，68℃延伸90s，共30个循环；68℃延伸7min；15℃保温。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，扩增的片段长约1380bp，与预期结果一致(见图1)。回收产物与pGM-T载体16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10，涂布含氨苄青霉素的LB平板，分别挑取单菌落扩大培养并进行菌液PCR鉴定G的插入与否。挑选阳性克隆送上海生物工程技术服务有限公司测序，测序结果正确的克隆被命名为pGM-G。

1.4重组质粒pFB-LIC-Bse-G的构建 以重组质粒pGM-G为模板，用pFB-IHNV-G上下游引物扩增目的片段，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，用T4聚合酶处理pFB-LIC-Bse载体和回收目的片段，混合处理后的载体与目的片段，22℃孵育30min，连接产物转化TOP10感受态细胞，培养后，提取重组质粒，使用引物pFB-IHNV-G经PCR鉴定筛选阳性重组质粒，由上海生物工程技术服务有限公司测序，重组转座质粒命名为pFB-LIC-Bse-G。

1.5重组杆粒rBacmid-G的构建 参照Bac to Bac Baculovirus ExpressionSystems使用手册，将pFB-LIC-Bse-N转化含有穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac中，挑取Kana/GM/Tet/X-gal/IPTG/LB平板上白色较大菌落，使用载体pFB-LIC-Bse携带引物pFB-seq-up/low进行鉴定；制备rBacmid-G，并采用引物M13/pUC、pFB-IHNV-G引物分别进行PCR鉴定，分别扩增出约3500bp和1400bp的片段，与预期结果一致。见图2和图3。

2.IHNV G蛋白的表达及纯化

2.1 rBacmid-G转染 Sf9昆虫细胞按II Reagent操作说明书的方法，将2μg不同浓度的rBacmid-G与8μL转染试剂转染于Sf9单层细胞，27℃继续培养3d～5d后收集上清，标记为P1代重组病毒，同时设空细胞为阴性对照和空Bac质粒为阳性对照。将P1代重组病毒液按照1％的体积进行传代，得到P2、P3代重组病毒，提取杆状病毒DNA为模板，分别采用M13/pUC和pFB-IHNV-G引物进行PCR检测重组病毒DNA。结果表明，72h后细胞呈现明显病变，细胞变大变圆，细胞界限变得模糊、胞质中分布大量颗粒样物质，折光性增强，增殖缓慢后期开始脱落(见图4)；PCR鉴定结果为：条带清晰可见，大小正确，丰度高。

2.2重组G蛋白的表达和检测 将P3代重组杆状病毒上清以1％～5％体积分别接种Sf9单层细胞，同时设置未接毒空白对照，27℃培养72h～96h，收集细胞。细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳产物电转印于硝酸纤维素膜上，以5％脱脂乳作为封闭液，以1：3 000稀释的HRP标记的anti-His单克隆抗体和以1：100稀释的IHNV鼠血清分别孵育2h，分别采用ECL显色液和增强型HRP-DAB底物显色剂显色，进行western blot鉴定。结果表明，重组G蛋白可以与HRP标记的anti-His单克隆抗体、IHNV鼠血清反应出特异性条带，大小约为50KDa，表明重组蛋白具有良好的反应原性。见图5和图6。

2.3重组病毒表达G蛋白间接免疫荧光检测 重组病毒种毒接种sf9细胞，27℃温箱培养72h，弃去病毒液，PBST洗三遍，用4％多聚甲醛室温固定30min，晾干。在室温与鼠anti-his的单克隆抗体孵育1h，PBST洗三次。加入FITC标记的羊抗鼠IgG，进行间接荧光试验，同时以正常sf9细胞作为对照。结果显示，表达的IHNV G蛋白重组杆状病毒rBacmid-G感染的sf9昆虫细胞可与小鼠anti-His单抗发生反应，产生特异的亮绿色荧光，而未感染重组病毒的正常sf9细胞呈阴性反应，表明IHNV G蛋白在昆虫细胞内得到了表达。见图7。

2.4重组病毒表达G蛋白的纯化 反复冻融收集的病变Sf9细胞(-40℃)，用力摇瓶子使冰破碎。收集细胞液于50ml离心管中，≥5000g离心10min。弃去上清，用细胞裂解液重悬沉淀，在冰上裂解细胞30min。超声裂解4min，≥15000g离心40min，收集上清，与镍离子螯合树脂(Roche)混匀，树脂预先经过20倍柱体积的缓冲液A平衡，4℃用磁力搅拌器搅拌过夜。将搅拌过夜的混合物放入底部用滤纸封好的注射器管套，使液体自然流出。用缓冲液A平衡柱子，液体体积约为柱床体积10倍。用5倍柱床体积的缓冲液B洗脱具有His标签目的蛋白，并分管收集，SDS-PAGE验证纯化结果并用nanodrop蛋白测定系统，测定G蛋白浓度为1.05mg/mL。

实施例2兔抗虹鳟鱼IgG的制备及纯化

1.虹鳟鱼血清的制备 试验用健康虹鳟鱼取自北京市水产研究所，虹鳟鱼取血，室温静置1小时，4℃过夜放置6000r/min离心15min，分离血清，分装，-80℃保存。

2.虹鳟鱼IgM的纯化 使用GE公司预装HiTrap Protein A HP柱1mL对虹鳟鱼IHNV阴性血清进行亲和层析，目的是获得虹鳟鱼免疫球蛋白IgM。层析中所用的条件和缓冲液浓度等均经过摸索，以达到最佳效果。鱼血清用100ml PBS稀释。用0.45μm膜过滤，以0.5mg/min的流速上样,并过夜反复循环上样。用30倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/L PBS,pH7.0)洗去未结合的蛋白。再用10倍柱体积的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.5)缓冲液洗脱结合的蛋白。用nanodrop蛋白测定系统，测定虹鳟鱼IgM浓度为0.5mg/mL。

3.虹鳟鱼IgM纯度的分析 采用Bio-Rad非连续缓冲系统垂直板电泳，对纯化的鱼抗体进行纯度分析：按照浓缩胶5.0％，分离胶12.0％，加样20μl，稳流电泳，样品在浓缩胶中电流用70mA，进入分离胶后加大至140mA。采用考马斯亮蓝染色法，待脱色至背景清晰后进行拍照(见图8)。结果表明，所纯化的IgM条带清晰，大小正确，无非特异性杂带。

4.兔抗虹鳟鱼IgG血清的制备 将200μg亲和层析纯化的虹鳟鱼IgM用20mmol/L的PBS(PH＝8)缓冲液稀释成1ml，随后与等体积的弗式完全佐剂进行混合，反复乳化成油包水状，对2只兔子进行背部皮下多点注射免疫，每只兔子注射0.5ml抗原乳剂，含有IgM 100μg。两周后将200μg IgM与等体积的弗氏不完全佐剂混合，每只兔子注射100μg抗原乳剂。每隔2周进行一次免疫，在4免后10天采血。6000rpm/min离心15min分离血清。

5.兔抗虹鳟鱼血清效价的检测 用包被液(PH＝9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液)将虹鳟鱼IgM以2μg/ml的浓度，每孔加入100μl,4℃冰箱包被过夜，用5％的牛血清白蛋白于37℃封闭1h，封闭结束后用PBST(PH＝7.4)洗涤3次，每次3min。随后各孔依次加入1：1000，1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000稀释的兔抗虹鳟鱼IgG的血清100μl，空白对照加PBS，25℃温育1h，洗涤同上。每孔加入新鲜配制的1：4000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG,25℃温育1h，洗涤同上。每孔加入新鲜配制的100μl底物显色液，避光反应15min，随后加入100μl终止液终止反应。在450nm下检测每孔OD值。由表2可知，1号兔子多抗稀释到1:32000时，仍满足阳性血清样本吸收值与一组同倍稀释的阴性样本吸收值的比值，即P/N比值大于3倍，即判为阳性。2号兔子多抗稀释到1:8000时，P/N比值大于3倍，即判为阳性。说明本试验制备的兔抗虹鳟鱼血清在稀释8000倍及以上均能够与虹鳟鱼IgM发生反应。见表2：

表2兔抗虹鳟鱼血清效价测定

6.兔抗虹鳟鱼IgG的纯化 使用GE公司预装HiTrap Protein G HP柱1mL对获得的兔抗虹鳟鱼IgM的血清进行亲和层析，目的是获得兔抗虹鳟鱼免疫球蛋白IgG，。兔血清用50—200ml PBS稀释，其中以100ml PBS稀释效果最佳。用0.45μm膜过滤，以0.1—1mg/ml的流速上样，其中以0.5mg/min的流速上样最优。然后用1-8倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/LPBS,pH7.0)洗去未结合的蛋白,其中以5倍柱体积的结合缓冲液效果最好。再用6倍柱体积的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.5)缓冲液洗脱结合的蛋白，结合蛋白以1mL管为单位分步收集到含30μL pH9.0的Tris-Cl中和液的收集管中。用nanodrop蛋白测定系统，测定兔IgG浓度为20.6mg/mL。本发明采用Bio-Rad非连续缓冲系统垂直板电泳，对纯化的兔IgG进行纯度分析。

7.兔抗虹鳟鱼IgG纯度的分析 采用Bio-Rad非连续缓冲系统垂直板电泳，对纯化的鱼抗体进行纯度分析：按照浓缩胶5.0％，分离胶12.0％，加样20μl，稳流电泳，样品在浓缩胶中电流用70mA，进入分离胶后加大至140mA。采用考马斯亮蓝染色法，待脱色至背景清晰后进行拍照(见图9)。结果表明，所纯化的IgG条带清晰，大小正确，无非特异性杂带。

实施例3虹鳟鱼IHNV抗体检测ELISA方法的建立

1.虹鳟鱼IHNV抗体检测ELISA方法的建立

使用方阵滴定的方法确定抗原G蛋白的最佳抗原包被浓度和待检血清的稀释度，同时确定最佳反应程序。以阳性、阴性血清孔OD值之比即P/N值作为指标，对包被抗原浓度、血清稀释倍数、二抗、酶标抗体最适工作浓度、各步反应时间等项目进行比较试验，确定各项最适反应条件，将纯化的重组IHNV G蛋白抗原用包被液稀释至如下浓度：0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml共6个稀释度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，置湿盒中，4℃包被过夜。用含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS(pH7.4)的(PBST)洗涤5次，间隔2min，期间振摇；以50g/L脱脂奶粉37℃封闭2h，同上步骤洗板；将IHNV阳性血清和阴性血清进行1：1、1：2、1：5、1：10、1：20和1：50倍比稀释，加入封闭后的酶标板，每孔100μL，用封口膜封闭，37℃感作60min，同上步骤洗板；将兔抗鱼IgG按照以下稀释度进行稀释：1：200、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000，每孔加入100μL，37℃感作60min，同上洗板；最后，将HRP标记的山羊抗兔IgG做以下倍数稀释：1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000，每孔加入100μL，37℃感作30min。加入100μL底物液(TMB)，避光显色15～30min，最后加入50μL终止液(2mol/L H₂SO₄)终止反应，用酶标仪检测OD450，计算阳性血清孔的平均OD450值(P)和阴性血清孔的平均OD450值(N)之比(P/N)。

利用方阵滴定法对抗原包被浓度、血清稀释浓度、二抗工作浓度、酶标山羊抗兔IgG等ELISA参数进行优化。结果抗原浓度在2μg/ml，抗体稀释度在1：5时P/N值相对最大，且阴性血清的非特异性反应不明显，所以选择抗原浓度为2μg/ml，血清1：5为最佳稀释度。(当用此抗原包被浓度和血清稀释度时，经过几次试验验证，标准阴性血清的OD450值≤0.132，标准阳性血清的OD450值≥0.382)。见表3。

表3重组蛋白包被浓度和血清最佳稀释倍数试验

根据抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定结果，将纯化抗原和IHNV阳性血清分别作最佳稀释后进行ELISA操作，兔抗鱼IgG分别作1：200、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000 6个稀释度进行ELISA试验，测其OD450值并计算P/N。通过OD450值下降幅度及ELISA判定标准，认为二抗(兔抗鱼IgG)浓度均作1000倍稀释最佳。

用重组蛋白G蛋白以其最佳抗原包被浓度条件下包被ELISA反应板，4℃过夜，将血清及其二抗(兔抗鱼IgG)都作最佳稀释倍数，分别在37℃下反应1.5h，60min，40min，30min，进行ELISA测定，测定OD450值并求其P/N值，以确定血清和二抗(兔抗鱼IgG)的最佳反应时间，通过试验最终确定一抗结合时间为60min，二抗结合时间为60min。

用重组蛋白G蛋白以其最佳抗原包被浓度条件下包被ELISA反应板，4℃过夜，将血清、二抗(兔抗鱼IgG)都作最佳稀释倍数，HRP标记的山羊抗兔IgG分别作1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释，在37℃下反应1.5h，60min，40min，30min，进行ELISA测定，测定OD450值并求其P/N值，以确定酶标三抗(山羊抗兔IgG)的最佳稀释倍数和反应时间，通过试验最终确定三抗稀释倍数为1:4000，作用时间为30min。

对10份阴性血清进行间接ELISA检测，按照已经确定的ELISA程序进行测定，读出OD450值，进行样本OD450值平均值(X)、标准方差(S.D)的计算。计算出10份血清的OD450的平均值和标准方差S.D，确定阳性血清临界值为0.24，阴性血清临界值为0.206，即当被检血清样品的OD450≥0.24时，判为阳性；OD450＜0.206判为阴性，介于两者之间的视为可疑，需要重检。

2.虹鳟鱼IHNV抗体检测ELISA方法的特异性

2.1阻断试验 将阳性血清按照最佳稀释度进行稀释，同时加入等体积的最佳稀释度的IHNV重组蛋白，37℃孵育60min，同时设立未进行阻断的同份阳性血清(只加抗原液等量的抗体稀释液)做对照。用包被好的酶标板，按照已确定好的条件对血清进行ELISA检测。计算(N-P)/N值，若此值大于0.5，则判定为阻断阳性，小于0.5则为阻断阴性。(N-P)/N＝(未阻断孔阳性OD值-阻断孔OD值)/(未阻断孔OD值)。根据公式计算得阻断值为0.75，大于0.5，判定为阻断阳性。说明阳性血清对纯化的IHNV重组G蛋白具有很好的特异性。

2.2特异性检测 用VHSV和HRV的阳性血清替代IHNV阳性血清，按照ELISA检测步骤进行检测，观察其他病毒血清与IHNV G蛋白之间有无交叉反应，从而确定该方法的特异性。从ELISA检测结果可以看出，所检VHSV和HRV阳性血清均小于0.206，显示为阴性。表明本实验所建立的ELISA检测方法具有很好的特异性。

表4特异性试验

IHNV阳性血清	VHSV阳性血清	HRV阳性血清
			1.125	0.124	0.101
1.136	0.116	0.117
			1.121	0.121	0.109

3.虹鳟鱼IHNV抗体检测ELISA方法的重复性

3.1批内重复 用同一批制备的IHNV重组G蛋白作为抗原包被酶标板，取6份虹鳟鱼IHNV阳性血清和1份阴性血清进行四份重复试验，求所有孔的平均值和标准差，变异系数(CV)＝标准差/平均值。通过变异系数公式计算变异系数。结果表明，重复试验变异系数最大是4.69％，最小是0.26％，均小于10％，具有很好的重复性。

表5批内重复性试验

3.2批间重复 取3份不同批次制备的IHNV重组G蛋白，按照上述优化好的实验条件进行ELISA，每份血清重复3孔，将所得结果进行统计学分析。从表6可以看出，同一份血清用不同批次的抗原进行反应时OD450值变化很小，表明建立的ELISA检测方法具有很好的重复性。

表6批间重复性试验

蛋白批次	阳性血清OD450	阴性血清OD450
			1	0.634	0.122
2	0.597	0.132
			3	0.638	0.114
平均值	0.623	0.123
			标准差	0.023	0.009
变异系数	3.69	7.32

实施例4虹鳟鱼IHNV抗体检测ELISA试剂盒的建立

试剂盒的组成：

纯化的IHNV重组G蛋白；

酶标板：用来包被IHNV重组G蛋白，包被浓度为2ug/ml，血清1：5为最佳稀释度，每孔100μL；

二抗：兔抗鲑鳟鱼IgG；

酶标三抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG；

显色液：3′，3′，5′，5′-四甲基联苯胺(TMB)单相液；

终止液：2M H2SO4溶液；

稀释液：含5％脱脂奶的洗涤液；

洗涤液：PBST；

阳性标准品：已知IHNV阳性血清；

阴性标准品：已知IHNV阴性血清；

注：阴、阳性标准品购自美国TSZ公司。

采用上述试剂盒可对待检血清样本进行快速、批量化检测，所述试剂盒可商品化出售。本发明的ELISA检测试剂盒是一种快速、特异性强、灵敏性高、检测方便、批量化使用、商品化程度高的虹鳟鱼IHNV抗体检测试剂盒。可用于虹鳟鱼IHNV抗体的检测，不与其他弹状病毒科病毒发生交叉反应，可实现批量样本的检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含：纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原、酶标板，兔抗虹鳟鱼IgG作为二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为酶标三抗。

2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含：稀释液、显色液、终止液、阳性血清和/或阴性血清。

3.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述纯化的IHNV重组G蛋白的制备方法是：

(1)将IHNV分离株G蛋白膜外表达区进行真核表达；

(2)利用pFB-LIC-Bse杆状病毒载体以及rBacmid-G重组杆粒在sf9昆虫细胞中获得重组G蛋白；

(3)纯化。

4.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(1)是从传染性造血器官坏死病病毒IHNV中扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区。

5.根据权利要求4所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(1)中用于扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区的特异性引物的核苷酸序列为：

F：5'-ATGGACACCATGATCACCAC-3'；

R：5'-CTACCAGTGGAGT-3'。

6.一种用权利要求1所述的试剂盒检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的方法，其特征在于：用纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原包被酶标板，过夜；将待检血清、二抗、三抗稀释，分别反应后进行ELISA测定。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述抗原IHNV重组G蛋白的包被浓度为2μg/ml，待检血清的稀释度为1:5。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述二抗稀释浓度为1:1000，三抗稀释倍数为1:4000。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：待检血清结合时间为60min，二抗结合时间为60min，三抗作用时间为30min。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：反应后测定OD450值，进行OD450值平均值X、标准方差S.D的计算；计算出OD450的平均值和标准方差S.D，确定阳性血清临界值为0.24，阴性血清临界值为0.206，即当被检血清样品的OD450≥0.24时，判为阳性；OD450＜0.206判为阴性。