CN104330572A

CN104330572A - 一种用于间接ELISA检测猪PRRSV病毒IgG或IgA抗体的试剂盒

Info

Publication number: CN104330572A
Application number: CN201410583386.3A
Authority: CN
Inventors: 樊彦红; 何成华; 赵秀美; 任喆; 夏兵兵; 汪袁
Original assignee: SUZHOU WUJIANG DISTRICT ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY STATION; Nanjing Agricultural University
Current assignee: SUZHOU WUJIANG DISTRICT ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY STATION; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-10-27
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2015-02-04

Abstract

本发明属于生物检测试剂领域，涉及一种用于间接ELISA检测猪PRRSV病毒IgG或IgA抗体的试剂盒。一种用于间接ELISA检测猪血清或唾液PRRSV病毒IgG或IgA抗体的试剂盒，该试剂盒包含：a)抗体检测板，b)HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液或HRP标记的羊抗猪IgA，c)阳性对照：PRRSV标准阳性血清或唾液，d)阴性对照：PRRSV阴性血清或唾液，e)样品稀释液，f)10×浓缩洗涤液，g)底物显色液，h)终止液。本发明试剂盒用于猪血清或唾液中PRRSV IgG或IgA抗体的有很好的PRRSV特异性和敏感性。重复性试验也表明该试剂盒具有良好的重复性好。

Description

一种用于间接ELISA检测猪PRRSV病毒IgG或IgA抗体的试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测试剂领域，涉及一种用于间接ELISA检测猪PRRSV病毒IgG或IgA抗体的试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称猪高致病性蓝耳病，由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染所致。该病在中国的流行和分布十分广泛，危害日趋严重，已成为制约养猪业发展的重要传染性疾病。该病在临床上主要表现为持续高热、粪便干燥、呼吸障碍及繁殖性能下降，母猪在怀孕后期出现流产、死胎以及木乃伊胎[1]。具有发病率高、持续时间长、难治疗和易反复等特点。

目前猪群中PRRSV抗体检测主要采用血清学方法，主要包括免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和血清中和试验(SN)等。血清学检测技术因操作简便，且敏感性和特异性较高，已成为猪繁殖与呼吸障碍综合征的主要检测方法之一。然而，血清学检测方法费时、费力，对猪产生的应激较大，同时威胁着操作者的安全。血清样本难以满足大量样本数的要求，不能对动物随机、随时采样。

唾液采集方便，利用猪好奇心理及嗜好咀嚼的特性，将灭菌处理的棉球悬挂于猪面前，将吸收唾液的棉球置于干净的封口袋中，挤压到离心管中，-20℃保存备用。目前关于用唾液来检测疾病的方法已经在人医临床上开始应用，如在儿童孤独症、口干症、乙型肝炎表面抗原以及艾滋病等。但唾液样本在兽医临床上尚未得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于间接ELISA检测猪血清或唾液中PRRSVIgG或IgA抗体的试剂盒。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于间接ELISA检测猪血清或唾液PRRSV病毒IgG或IgA抗体的试剂盒，该试剂盒包含：a)抗体检测板，b)HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液或HRP标记的羊抗猪IgA抗体溶液， c)阳性对照：PRRSV标准阳性血清或唾液，d)阴性对照：PRRSV阴性血清或唾液，e)样品稀释液，f)10×浓缩洗涤液，g)底物显色液，h)终止液，其中：所述的抗体检测板为包被PRRSVJXA1重组N蛋白的96孔酶标板；所述的PRRSV JXA1重组N蛋白通过以下方法制备得到：

1)根据PRRSV JXA1株设计1对扩增包括N蛋白全基因序列的特异性引物F1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以PRRSV JXA1株基因组DNA为模板，PCR扩增PRRSV JXA1株N蛋白基因片段；

2)将扩增的片段插入pET-28a表达载体的EcoRI和XhoI酶切位点间得到重组表达质粒pET-28a-N，经双酶切及测序验证；

3)将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养基因工程菌诱导表达目的蛋白；

4)重组菌体离心后，纯化得所述的PRRSV JXA1重组N蛋白。

用于间接ELISA检测猪血清PRRSV病毒IgG抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为1.25μg/mL，使用的封闭液为3％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液稀释度为1:4000；阳性对照为用PBST溶液1:40稀释的PRRSV标准阳性血清；阴性对照为用PBST溶液1:40稀释的PRRSV阴性血清。

用于间接ELISA检测猪血清PRRSV病毒IgA抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为2.5μg/mL，使用的封闭液为1％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgA抗体溶液稀释度为1:1000；阳性对照为用PBST溶液1:4稀释的PRRSV标准阳性血清；阴性对照为用PBST溶液1:4稀释的PRRSV阴性血清。

用于间接ELISA检测猪唾液PRRSV病毒IgG抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为2.5μg/mL，使用的封闭液为1％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液稀释度为1:2000；阳性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阳性唾液样本；阴性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阴性唾液样本。

用于间接ELISA检测猪唾液PRRSV病毒IgA抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为2.5μg/mL，使用的封闭液为1％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgA抗体溶液稀释度为1:1000；阳性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阳性唾液样本；阴性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阴性唾液样本。

所述的样品稀释液为所述的样品稀释液为PBST。

本发明所述的PBST溶液为含5％Tween-20的PBS溶液。

有益效果：

PRRSV病毒基因组约15kb，含8个阅读框(ORFs)，其中ORF7长372bp，编码PRRSV的核衣壳蛋白N蛋白。N蛋白最为保守，欧洲型和美洲型毒株含有共同的N蛋白抗原决定簇。N蛋白含量较高，占病毒结构蛋白的20～40％，是病毒的主要结构蛋白，有较强的免疫活性。本发明通过基因工程手段合成了重组E蛋白，以重组N蛋白为包被抗原，建立检测猪血清或唾液中PRRSV抗体的间接ELISA方法和间接ELISA试剂盒。血清交叉试验证明，本发明试剂盒用于猪血清或唾液中PRRSV IgG或IgA抗体的有很好的PRRSV特异性和敏感型。重复性试验也表明该试剂盒具有良好的重复性好。

附图说明

图1N蛋白基因RT-PCR扩增结果

M:DL1000Marker；1,2:N蛋白基因

图2pET-28a-N重组质粒双酶切鉴定

M₁：DL 5000Marker；1:pET-28a-N基因PCR产物；2:pET-28a-N重组质粒双酶切产物；3:pET-28a双酶切产物

图3重组N蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析

M:蛋白Marker；1：pET-28a/BL21(DE₃)菌液，2：pET-28a-N诱导前菌液，3：pET-28a-N诱导后菌裂解液上清，4：pET-28a-N诱导后菌裂解液沉淀

图4重组N蛋白的亲和层析纯化

M:蛋白Marker；1:纯化后的重组N蛋白

图5重组N蛋白的Western blot分析

M:预染蛋白Marker；1:纯化后的重组N蛋白

具体实施方式

实施例1重组N蛋白的表达及纯化

1.1N蛋白基因的扩增

根据美洲株PRRSV JXA1株(GenBank:KC422729)设计1对扩增包括N蛋白全基因序列的特异性引物：P1:5'-CCGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG-3'(SEQ ID NO.1)；

P2:5'-CCGCTCGAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGT-3'(SEQ ID NO.2)，

分别于上游和下游的5'端插入EcoRI和XhoI限制性酶切位点。引物由英骏生物技术有限公司合成，该扩增片段大小为372bp。从病毒细胞培养液中提取总RNA，按照试剂盒说明进行RT-PCR扩增目的基因。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后取5μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检查，结果显示与预期大小相符(图1)。

1.2重组质粒的构建

将N基因纯化回收后，经EcoRI和XhoI双酶切后，克隆至经EcoRI和XhoI双酶切消化后的pET-28a表达载体中，于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，碱裂解法少制备质粒，经PCR扩增及酶切鉴定，筛选阳性重组表达质粒pET-28a-N，双酶切鉴定为阳性后，送至测序公司进行序列测定。pET-28a-N经测序鉴定，与PRRSV JXA1(GenBank:KC422729)的同源率达99％。重组质粒经EcoRI和XhoI双酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约5369bp和372bp的条带，与预期结果一致，说明重组质粒构建成功(图2)。

1.3重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达

将阳性重组质粒转化至表达菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，接种于新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到约0.6左右，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，18℃诱导培养12h后，离心收集菌体，SDS-PAGE检测表达情况。离心后菌体经超声破碎后，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性。经12％SDS-PAGE电泳分析，空载体菌pET-28a/BL21(DE₃)及pET-28a-N诱导前菌液没有出现目的蛋白，超声裂解液上清在17kD左右出现目的蛋白，说明该表达蛋白为可溶性蛋白(图3)。

1.4重组蛋白的纯化及免疫学活性检测

37℃诱导培养5h的200mL重组菌体离心后，用150mL 50mmol/L PBS重悬菌体沉淀，按约1:10的比例加入200μL质量浓度为50g/L，含1％Triton X-100的预冷的溶菌酶，混合作用30min后，250W超声裂解2h，离心之后上清用0.22μm的滤器过滤。用3mL镍琼脂糖凝胶基质装柱，自然沉降30min，加过滤后上清，然后依次用10～20倍柱床体积的PBS缓冲液洗涤1次，用100、200、300、400mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱，与上清液和沉淀物进行12％的SDS-PAGE检测。12％SDS-PAGE电泳分析表明，尽管有少量杂蛋白，但目的蛋白占绝对多的含量，且纯度可达90％以上(图4)。

按常规方法(Dea S,Wilson L,Therrien D,et al.Competitive ELISA for detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant E.coil-expressed nucleocapsid)，对纯化N蛋白进行Western blot分析，分别应用PRRS标准阳性血清与HRP标记的羊抗猪IgG作为一抗和二抗，检测重组融合蛋白的免疫原性。结果显示:纯化N蛋白在目标条带处出现明显印迹(图5)。

实施例2血清IgG ELISA检测方法的建立

1.1最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度的确定

将实施例1中纯化的N蛋白用PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液稀释成6个稀释度进行包被10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,1.25μg/mL,0.625μg/mL及0.313μg/mL，每个稀释度重复两孔，100μL/孔，4℃包被过夜。PBST(含0.5％Tween-20的PBS)洗涤3次，每孔加入100μL 3％BSA(稀释于PBST中)于37℃温箱中封闭2h。PRRSV标准阳性血清、阴性血清分别于封闭液中进行1:10,1:20,1:40,1:80稀释，每孔100μL，37℃温箱中孵育1h进行ELISA方阵实验。HRP标记的抗猪IgG抗体于PBST中1：5000倍稀释(说明书推荐稀释倍数)，每孔100μL，37℃温箱中孵育1h。加入100μL显色底物，37℃避光显色10min。100μL 2mol/L H₂SO₄终止反应。测定各孔OD450nm值，根据阳性血清OD₄₅₀nm值和阴性血清OD₄₅₀nm值之比(即P/N)的最大值，确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。

表1重组N蛋白最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度的确立

注：+表示PRRSV阳性血清OD₄₅₀值；－表示PRRSV阴性血清OD₄₅₀值。

方阵结果显示，随着重组N蛋白浓度的递减，标准阴性、阳性血清浓度的递增，阳性样品OD₄₅₀值随之不断减小，当抗原包被浓度为1.25μg/ml，标准阴性、阳性血清稀释度为1:40的时候，阳性标准血清的OD₄₅₀值在1.0左右，阴性血清OD₄₅₀值在0.1左右，P/N值最大(表1)。因此确定抗原包被浓度为1.25μg/mL，血清稀释度为1:40。

2.2最佳封闭液的确定

以最适的抗原包被浓度和抗体稀释度包被酶标板，PBST清洗3次之后，每孔加入100μL不同的封闭液。封闭液包括稀释于PBST中的1％BSA，3％BSA,1％OVA 3％OVA,5％脱脂奶粉,5％明胶和5％小牛血清。37℃封闭2h，其余各步骤同上。酶标仪测量各孔OD₄₅₀nm值，计算P/N值，确定最佳封闭液。结果显示3％BSA的P/N值最高，以次为最佳封闭液。

2.3酶标二抗最佳工作浓度的确定

用已经确定的抗原和抗体最适工作浓度进行间接ELISA，HRP标记的羊抗猪IgG抗体按照1:1000、1:2000、1:4000和1:8000共4个梯度稀释，37℃孵育1h，TMB显色10min后终止。测定OD₄₅₀nm值，P/N值最大时为酶标二抗的最适工作浓度。结果显示，P/N最高时，酶标二抗稀释度为1:4000，为最佳稀释度。

2.4判定标准的确定

选取用美国IDEXX Herd Chek ELISA试剂盒检测过的PRRSV阴性血清87份，用所建立的ELISA方法进行检测，每个样品做3个重复。测定OD₄₅₀值，进行统计学分析，计算出血清样本平均OD值和标准差SD根据公式：样本的平均OD值+3×SD计算其判定标准的临界值。对87份阴性血清ELISA检测结果进行统计学分析，计算出血清样本平均OD₄₅₀值为0.714，标准差SD为0.048，从而计算出临界值样本平均OD₄₅₀值+3SD为0.318。样本OD₄₅₀值≥0.318为阳性，样本OD₄₅₀值＜0.318为阴性。

2.5血清交叉反应试验

在同一条件下，分别对已知PRRSV、PCV-2、PPV、PRV、CSFV、JEV、TGEV阳性血清用已经建立的间接ELISA程序进行盲检；再将得出的结果与已知结果相比较。

利用PRRSV、PCV-2、PPV、PRV、CSFV、JEV、TGEV阳性血清进行ELISA交叉反应，除PRRSV阳性血清呈阳性外，其他血清OD₄₅₀值均小于0.318，证明无血清学交叉反应。

2.6重复性试验

2.6.1批内重复试验

批内重复试验在同一批次、同一块酶标板上进行。已知为PRRSV阳性、弱阳性、阴性血清 5份，每份血清设置5个重复，计算批内变异系数CV＝(SD/OD₄₅₀平均值)×100％。

2.6.2批间重复试验

取5块不同批次的酶标板，检测PRRSV阳性、弱阳性、阴性血清5份，每个样本每块板设置2个重复，计算批间变异系数CV＝(SD/OD₄₅₀平均值)×100％。

用PRRSV阳性、弱阳性、阴性血清5份，分别取同一批次酶标板和不同批次酶标板，进行批内重复试验和批间重复试验。计算批内重复试验变异系数1.53％～2.74％，小于7.00％，说明该方法有良好的重复性。不同批次酶标板与同一份血清反应的OD₄₅₀值及P/N值影响不大，t检验表明，差异不显著(P＞0.05)，因此本方法有良好重复性。

2.7特异性、敏感性、符合率试验

随机抽选267份血清平行用美国IDEXX HerdChek ELISA试剂盒和已建立的ELISA方法进行检测，分析该方法的特异性、敏感性，计算两者的符合率。

本方法与IDEXX公司ELISA检测试剂盒比较结果见表2。按常规方法得出比较结果，本试验方法敏感性达91.9％，特异性为91.5％。本研究结果与IDEXX公司检测结果的符合率为91.7％。

表2重组N蛋白与IDEXX公司ELISA检测试剂盒的比较

敏感性为148/161＝91.9％；特异性为：97/106＝91.5％；符合率为：(148+97)/267＝91.7％

实施例3血清、唾液IgA抗体ELISA检测方法的建立

对血清中IgG间接ELISA方法进行修改，优化反应条件，建立适合血清中IgA抗体检测的间接ELISA方法。其操作步骤与要求同血清中IgG检测方法一致，酶标二抗替换为HRP标记的羊抗猪IgA。其中所用的阴、阳性血清分别为免疫前及免疫后35d所分离的血清样本。对动物进行前腔静脉采血，采集血液于室温凝结后，于4℃过夜，待血清析出后经1000×g离心10min分离血清样本。

同时，在血清IgG检测方法的基础上，对对反应条件进行改良、优化，确定适合唾液中IgG、IgA抗体检测的方法。优化过程包括增大唾液样本反应体积，延长样本孵育时间，减小样本稀释度和酶标抗体稀释度。采集免疫前唾液为阴性唾液样本，免疫后14d唾液为阳性唾液样本。采集的猪唾液于4℃经1000×g离心10min，分离上清液。迅速置于冰盒降温，于4℃短期保存，-20℃或-80℃长期保存。以重组N蛋白为包被抗原，对血清、唾液样本中IgG、IgA抗体检测的间接ELISA方法反应条件总结见表3。

表3间接ELISA检测猪血清、唾液中PRRSV IgG、IgA抗体反应条件

实施例4

一种用于检测猪血清中PRRSV病毒IgG抗体的试剂盒，主要由以下组份组成：

a)96孔酶标板4块。包被PRRSV JXA1重组N蛋白，其浓度为1.25μg/mL，以3％BSA为封闭液

b)稀释度为1:4000的HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液

c)阳性对照：1:40稀释的PRRSV标准阳性血清1管(1ml)

d)阴性对照：1:40稀释的PRRSV标准阴性血清1管(1ml)

e)样品稀释液：PBST 1瓶(50ml)，0.2g磷酸二氢钾，2.9g磷酸氢二钠，8.0g氯化钠，2.0g氯化钾，0.5mL Tween20，加水定容至1000mL

f)10×浓缩洗涤液:PBST 1瓶(30ml)，2g磷酸二氢钾，29g磷酸氢二钠，80g氯化钠，2g氯化钾，5mL Tween20，加水定容至1000mL

g)底物显色液：TMB溶液(15mL)

h)终止液：2M H₂SO₄(15mL)

实施例5

一种用于检测猪血清中PRRSV病毒IgA抗体的试剂盒，主要由以下组份组成：

a)96孔酶标板4块。包被PRRSV JXA1重组N蛋白，其浓度为2.5μg/mL，以1％BSA为封闭液

b)稀释度为1:1000的HRP标记的羊抗猪IgA

c)阳性对照：1:4稀释的PRRSV标准阳性血清1管(1ml)

d)阴性对照：1:4稀释的PRRSV标准阴性血清1管(1ml)

e)样品稀释液：PBST 1瓶(50ml)，配方为：0.2g磷酸二氢钾，2.9g磷酸氢二钠，8.0g氯化钠，2.0g氯化钾，0.5mL Tween20，加水定容至1000mL

f)10×浓缩洗涤液:PBST 1瓶(30ml)，配方为：2g磷酸二氢钾，29g磷酸氢二钠，80g氯化钠，2g氯化钾，5mL Tween20，加水定容至1000mL

g)底物显色液：TMB溶液(15mL)

h)终止液：2M H₂SO₄(15mL)

实施例6

一种用于检测猪唾液中PRRSV病毒IgG抗体的试剂盒，主要由以下组份组成：

a)96孔酶标板4块。包被PRRSV JXA1重组N蛋白，其浓度为1.25μg/mL，以1％BSA为封闭液；

b)稀释度为1:2000的HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液

c)阳性对照：1:2稀释的PRRSV标准阳性唾液1管(1ml)

d)阴性对照：1:2稀释的PRRSV标准阴性唾液1管(1ml)

g)底物显色液：TMB溶液(15mL)

h)终止液：2M H₂SO₄(15mL)

实施例7

a)96孔酶标板4块。包被PRRSV JXA1重组N蛋白，其浓度为2.5μg/mL，以1％BSA为封闭液；

b)稀释度为1:1000的HRP标记的羊抗猪IgA

c)阳性对照：1:2稀释的PRRSV标准阳性唾液1管(1ml)

d)阴性对照：1:2稀释的PRRSV标准阴性唾液1管(1ml)

g)底物显色液：TMB溶液(15mL)

h)终止液：2M H₂SO₄(15mL) 。

Claims

1.一种用于间接ELISA检测猪血清或唾液PRRSV病毒IgG或IgA抗体的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含：a)抗体检测板，b)HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液或HRP标记的羊抗猪IgA抗体溶液，c)阳性对照：PRRSV标准阳性血清或唾液，d)阴性对照：PRRSV阴性血清或唾液，e)样品稀释液，f)10×浓缩洗涤液，g)底物显色液，h)终止液，其中：所述的抗体检测板为包被PRRSV JXA1重组N蛋白的96孔酶标板；所述的PRRSV JXA1重组N蛋白通过以下方法制备得到：

1)根据PRRSV JXA1株设计1对扩增包括N蛋白全基因序列的特异性引物F1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以PRRSV JXA1株基因组RNA为模板，RT-PCR扩增PRRSV JXA1株N蛋白基因片段；

4)重组菌体离心后，纯化得所述的PRRSV JXA1重组N蛋白。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于用于间接ELISA检测猪血清PRRSV病毒IgG抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为1.25μg/mL，使用的封闭液为3％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液稀释度为1:4000；阳性对照为用PBST溶液1:40稀释的PRRSV标准阳性血清；阴性对照为用PBST溶液1:40稀释的PRRSV阴性血清。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于用于间接ELISA检测猪血清PRRSV病毒IgA抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为2.5μg/mL，使用的封闭液为1％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgA抗体溶液稀释度为1:1000；阳性对照为用PBST溶液1:4稀释的PRRSV标准阳性血清；阴性对照为用PBST溶液1:4稀释的PRRSV阴性血清。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于用于间接ELISA检测猪唾液PRRSV病毒IgG抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为2.5μg/mL，使用的封闭液为1％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgG抗体溶液稀释度为1:2000；阳性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阳性唾液样本；阴性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阴性唾液样本。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于用于间接ELISA检测猪唾液PRRSV病毒IgA抗体的试剂盒中所述的酶标板中抗原包被浓度为2.5μg/mL，使用的封闭液为1％BSA的PBST溶液；所述的HRP标记的羊抗猪IgA抗体溶液稀释度为1:1000；阳性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阳性唾液样本；阴性对照为用PBST溶液1:2稀释的PRRSV阴性唾液样本。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的样品稀释液为PBST。