CN110456078A

CN110456078A - 检测羊mvv及所引起的传染病的蛋白及其试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN110456078A
Application number: CN201910878185.9A
Authority: CN
Inventors: 盛金良; 张彦红; 肖盛中; 李岩; 杨艳; 蔡卓轩
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2019-11-15

Abstract

本发明涉及一种检测羊MVV及所引起的传染病的重组蛋白及所构成的试剂和试剂盒，所述的检测羊MVV或MVV所引起的传染病的重组蛋白的基因序列为序列表中<210>1，通过该重组蛋白可以进一步地制备检测羊梅迪维斯纳病毒抗体的间接ELISA试剂和试剂盒。该重组蛋白融合了结构蛋白env蛋白的多个优势表位，特异性强、敏感性高，在新疆部分地区羊梅迪维斯纳病毒抗体的检测实践中得到进一步验证，其具有特异性强、敏感度高、操作简单等特点，易于大范围推广使用，具有广阔的市场前景，可用于梅迪维斯纳病感染情况的血清学调查、抗体监测及疫苗免疫效果的评估等方面。

Description

检测羊MVV及所引起的传染病的蛋白及其试剂和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测羊MVV及所引起的传染病的重组蛋白及试剂和所构成的试剂盒。

背景技术

梅迪-维斯纳病(Maedi-Visna Disease，MVD)是一种由梅迪-维斯纳病毒(maedii-visna vrius,MVV)引起的羊全身性疾病。

此病的共同特征为典型的慢性进行性疾病，表现为潜伏期长、持久性感染、病程发展缓慢，一旦感染即为终身患病，抵抗力下降而易继发细菌感染，最后以死亡而告终，还能造成新生羔羊体重下降以及早期死亡等繁殖性能障碍。

因此，MV感染是影响养羊业发展的一个重要因素。

MVD首次在冰岛的羊身上发现这种疾病，据文献报道目前中国地区已有云南、陕西和新疆等12个地区不同程度的流行。

MVV属于反转录病毒科，与人类免疫缺陷病毒(HIV)和其他动物慢病毒具有典型的逆转录病毒形态和相似的基本生物学特征。

目前，由于MVD无有效治疗的方法，一旦流行，会给羊产业造成不可逆转的威胁。因此对于MVD只能采取早期检测预防的方法。

因此，一种检测羊MVV及所引起的传染病的蛋白及所构成的试剂和试剂盒应运而生，对于羊群中MVV感染的监测对于该病的防控和公共卫生都具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、稳定性好、操作方便快捷的检测羊梅迪维斯纳病毒抗体的重组蛋白以及由该重组蛋白所构成的试剂和试剂盒，用于羊梅迪维斯纳病毒抗体水平的检测，以判断羊梅迪维斯纳病毒的感染情况和监测免疫效果等。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：所述的检测羊MVV或MVV所引起的传染病的重组蛋白的基因序列为序列表中<210>1。

MVV主要有三个功能蛋白，即gag、env和pol。其中外膜蛋白env蛋白具有分子生物学诊断意义。本发明的重组蛋白主要通过对MVV功能蛋白中的env蛋白氨基酸序列进行优化重组得到。

本发明的检测羊MVV或MVV所引起的传染病的重组蛋白融合了结构蛋白env蛋白的多个优势表位，具有特异性强、敏感性高的特点。

进一步地，本发明的检测羊MVV或MVV所引起的传染病的检测羊MVV或MVV所引起的传染病的可以配制成检测羊梅迪维斯纳病毒抗体的间接ELISA试剂或试剂盒，试剂盒包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、酶浓缩液稀释液、显色液和终止液，包被酶标板以重组蛋白作为包被抗原。

所述的重组蛋白按以下操作制备得到：对MVV功能蛋白中的env蛋白氨基酸序列进行优化，通过全基因合成并通过限制性酶切位点Nde I和Hind III将env蛋白基因插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到Top10克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株中，通过IPTG诱导表达env蛋白，之后通过亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化具有生物学活性的重组env蛋白。

包被酶标板每孔包被重组蛋白4μg，包被缓冲液采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，并用5％的脱脂乳和1％的蔗糖的0.01M的PBS溶液作为封闭液进行封闭。

阴性对照血清2mL，为健康未免疫犊羊血清，经IDVET MVV总抗体检测试剂盒检测为阴性，样本稀释液50倍稀释；阳性对照血清2mL，成年羊免疫env蛋白后1月采集的血清，湖州英创生物科技有限公司HRP藕联物稳定/稀释剂I 20倍稀释，1.8≦OD450nm≦2.3；样品稀释液为含有50％马血清，2.5％脱脂乳，1％吐温和0.002mol/lEDTA的0.01M的PBS溶液，共120mL；酶标二抗浓缩液为0.6mL，由美国JacksonImmunoResearch公司生产的兔抗羊IgG稀释100倍而得，兔抗羊IgG稀释液为湖州英创生物科技有限公司HRP藕联物稳定/稀释剂I；酶标二抗浓缩液稀释液为含有5％马血清的0.01M的PBS溶液，共60mL；浓缩洗涤液为20×洗涤液，为含0.5％吐-20pH7.2-7.4的0.2M的PBS溶液，共100mL；显色液包括显色液A和显色液B，显色液A：称取200mg四甲基联苯胺，溶于100mL的无水乙醇中，双蒸水定容至1000mL；显色液B：称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75％过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至1000mL，调节PH值为4.5-5.0。显色液A和显色液B均为30mL；终止液为2M的H2SO4溶液，共30mL。

间接ELISA具有操作简单、特异性及稳定性好等诸多优点，目前在临床上广泛应用于各种细菌、病毒及寄生虫等病原抗体水平的检测。本发明依据间接ELISA的原理，建立了预包被有重组蛋白的酶标板的检测羊梅迪维斯纳病毒抗体的间接ELISA试剂盒：首先，通过筛选抗原性强且保守的羊梅迪维斯纳病毒结构蛋白，扩增和克隆基因；然后构建原核表达载体，原核表达融合蛋白；接着通过Western blotting进行抗原性分析，筛选表达量高、抗原性较好的重组蛋白抗原进行纯化作为包被抗原，最终获得了灵敏度较高、特异性强、稳定性好的间接ELISA试剂盒。

本发明在新疆部分地区羊梅迪维斯纳病毒抗体的检测实践中得到进一步验证，其具有特异性强、敏感度高、操作简单等特点，易于大范围推广使用，具有广阔的市场前景，可用于梅迪维斯纳病感染情况的血清学调查、抗体监测及疫苗免疫效果的评估等方面。

附图说明

图1是羊梅迪维斯纳病毒env蛋白基因质粒DNA及Nde I/Hind III酶切电泳图。

图中：泳道1为质粒DNA，泳道2为Nde I/Hind III酶切产物，泳道M为DNAMarkerDL10000。

图2是质粒pET-30a-env结构图。

图3是SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果图。

图中：泳道M为SDS-PAGE蛋白Marker，泳道0为空白对照，泳道1为15℃诱导16h，泳道1为37℃诱导16h。

图4是SDS-PAGE分析env蛋白上清纯化结果图。

图中：泳道M为:SDS-PAGE蛋白Marker，泳道1为全菌破菌离心后沉淀，泳道2为全菌破菌离心后上清，泳道3为上清同Ni-IDA孵育后流出液，泳道4-6为50mMImidazole的洗脱组分，泳道7-9为100mM Imidazole的洗脱组分，泳道10-11为300mM Imidazole的洗脱组分。

图5是SDS-PAGE分析包涵体中env蛋白纯化结果图。

图中：泳道M为:SDS-PAGE蛋白marker，泳道1为包涵体溶解离心后上清，泳道2为上清同Ni-IDA孵育后流出液，泳道3-4为50mM Imidazole的洗脱组分，泳道5-6为100mMImidazole的洗脱组分，泳道7-8为300mM Imidazole的洗脱组分。

图6是重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE分析图。

图中：泳道1为BSA，泳道M₁为预染蛋白质Marker，泳道2为env蛋白诱导菌体蛋白。

图7是重组菌诱导表达产物的Western-blot分析图。

图中：泳道1为纯化后env蛋白，泳道M₂为预染蛋白Marker。

具体实施方式

下面详细说明本发明的优选实施方式。

1.env蛋白序列的扩增及原核表达载体的构建。

使用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对env蛋白氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点Nde I和Hind III将env蛋白基因插入到表达载体pET30a中，通过酶切和测序确认最终表达载体的准确性，得到原核表达质粒pET30a-env(图1)。

2.表达载体转化及诱导表达。

将构建好的含有MVV env蛋白基因的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。

3.SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果。

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰(图3)。

4.上清中亲和层析纯化env蛋白。

全菌采用50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X-100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，20mM Imidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测，确定蛋白以包涵体进行表达(图4)。

5.包涵体通过亲和层析纯化env蛋白。

包涵体采用50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl含1％Triton X-100，2mM EDTA，5mMDTT洗涤后，以50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole，0.2％N-acylsarcosine sodium缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测(图5)。

6.env蛋白纯化。

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane9-11，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH 7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，2mM EDTA，0.4ML-Arginine，2M Urea]中复性，复性后TGZ pig MVV E0蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，5％Glycerol溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装。纯化后得到大小为79kDa(图6)，条带单一的目的蛋白，并将其冻存至-80℃。对纯化后的重组蛋白复性后进行Western-blot分析其抗原性，结果表明纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性(图7)。

7.酶标二抗浓缩液的制备。

使用HRP藕联物稳定/稀释剂I(湖州英创生物科技有限公司)100倍稀释兔抗羊IgG(美国Jackson ImmunoResearch公司)。

8.包被液、封闭液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、洗涤液的配制。

包被液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液(Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加灭菌ddH2O 800mL溶解，调PH9.6后加水至1000mL)；封闭液为5％的脱脂乳和1％的蔗糖的0.01M的PBS溶液(pH7.2-7.4)；样品稀释液为含有50％马血清，2.5％脱脂乳，1％吐温和0.002mol/l EDTA的0.01M的PBS溶液(pH7.2-7.4)；酶标二抗浓缩液稀释液为含有5％马血清的0.01M的PBS溶液(pH7.2-7.4)；10×洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M的PBS溶液(pH7.2-7.4)；

9.显色液及终止液的配制。

显色液A：称取200mg四甲基联苯胺，溶于100mL的无水乙醇中，双蒸水定容至1000mL；显色液B：称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75％过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至1000mL，调节PH值为4.5-5.0。显色液A和显色液B均为60mL。终止液：终止液为2MH2SO4，将11.1mL的浓硫酸缓慢加入水中稀释，并定容至100mL。

10.ELISA反应条件的确定。

最佳包被浓度最佳样本稀释倍数的确定。采用方阵法，分别将抗原0.5、1、2、4和8μg/孔包被量包被；阴/阳性血清进行1：25、1：50、1：100和1：200倍样本稀释液稀释；进行间接ELISA。根据P/N值(阳性样本OD值/阴性样本OD值)，最终确定最佳抗原包被量为4μg/孔，样本的最佳稀释倍数为1：50。并对最佳包被条件、最佳封闭液及封闭条件、血清孵育时间、酶标二抗稀释度、酶标二抗作用时间以及底物显色时间等作了逐一优化，最终确定本研究的羊梅迪维斯纳病毒抗体间接ELISA的最佳反应条件为：最佳包被抗原量为4μg/孔，4℃包被过夜；37℃2h封闭；待检血清稀释50倍，37℃孵育0.5h；二抗稀释度为1：30000，37℃反应0.5h；底物显色条件为TMB底物室温避光显色10min。

11.阴/阳性对照血清的制备。

阴性对照血清2mL，为健康未免疫犊羊血清，经IDVET MVV总抗体检测试剂盒检测为阴性，样本稀释液50倍稀释，0.1≦OD_450nm；阳性对照血清2mL，成年羊免疫env蛋白后1月采集的血清，使用湖州英创生物科技有限公司HRP藕联物稳定/稀释剂I20倍稀释，1.8≦OD_450nm≦2.3。

12.羊梅迪维斯纳病毒抗体间接ELISA阴阳性临界值的确定。

用建立的间接ELISA方法对92份健康羊血清进行检测，计算S/P值(样本OD值/阳性对照血清OD值)，及S/P的平均值和标准差SD，当被检样本时判为阳性，时判为阴性。经计算92份阴性血清的OD450值的平均值为0.0974，标准差为0.0725，所以故将阴阳性临界值定为0.315，为了判定方便，把临界值定为0.30。即在已优化好的ELISA反应条件下，S/P值≥0.30，即判定为阳性，反之为阴性。

羊梅迪维斯纳病毒抗体间接ELISA在临床检测中的应用。

应用本发明方法检测新疆石河子、沙湾、玛纳斯、伊犁等地区部分奶羊场920份临床血清样本，结果如表1所示：

表1

13.羊梅迪维斯纳病毒抗体间接ELISA检测试剂盒组成：如表2

表2

14.羊梅迪维斯纳病毒抗体间接ELISA试剂盒操作方法。

试剂配制：洗涤工作液：使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温(20～25℃)，并摇动，使结晶溶解(最好在37℃恒温培养箱中加热5～10min)，然后用去离子水作10倍稀释(例如：30mL的浓缩洗涤液加上270mL去离子水)混匀，稀释好的洗涤液2～8℃可存放7日。

样品处理：1)取动物全血，待血液凝固后，4000rpm离心10min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，无溶血。

2)在血清稀释板中按1:50的体积稀释待检血清样本，(147μL样本稀释液中加3μL待检血清样本)，充分混匀。

操作步骤：

1)设阴、阳性对照血清各2孔，每孔100μL。

2)将稀释好的待检血清加入到包被板中，100μL/孔。加样结束后，盖上盖板膜，置37℃温育30min。

3)取出包被板，弃去反应液，每孔加入300μL洗涤液，洗涤4次，在吸水纸上充分拍干。

4)用稀释液按1:300比例稀释酶结合物浓缩液(1份酶结合物浓缩液加299份酶稀释液)，将稀释后的酶结合物物加入到包被板中，100μL/孔。加样结束后，将包被板置37℃温育30min。

5)弃去反应液，洗涤4次，方法同3。

6)将底物A和B按等体积进行混合，混合后立即加入到包被板中，100μL/孔，置37℃(或18-25℃)避光显色10min。

7)每个反应孔加入100μL终止液，避免出现气泡。10min内测定结果。

15.结果判定。

用酶标仪于450nm(或双波长450nm和620nm)读取各孔OD值。

实验成立条件：当阳性对照血清平均OD值且

计算方法：

阴阳性判定：S/P<0.3，判为阴性；S/P≥0.3，判为阳性。

<110>石河子大学

<120> 检测羊MVV及所引起的传染病的蛋白及其试剂和试剂盒

<160> 1

<210>

<211> 733

<212> DNA

<213>

<220>

<221>

<223> Gp5-env-pro 蛋白

<400> 1

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Claims

1.一种检测羊MVV及所引起的传染病的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的基因序列为序列表中序列<210>1。

2.根据权利要求1所述的检测羊MVV及所引起的传染病的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白按以下操作制备：对MVV功能蛋白中的env蛋白氨基酸序列进行优化，通过全基因合成并通过限制性酶切位点Nde I和Hind III将env蛋白基因插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到Top10克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株中，通过IPTG诱导表达env蛋白，之后通过亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化具有生物学活性的重组蛋白。

3.一种检测羊MVV及所引起的传染病的试剂，其特征在于，根据权利要求1或2所述的检测羊MVV及所引起的传染病的重组蛋白制备而成。

4.一种检测羊MVV及所引起的传染病的试剂盒，其特征在于，根据权利要求1或2所述的检测羊MVV及所引起的传染病的重组蛋白或者权利要求3所述的检测羊MVV及所引起的传染病的试剂制备而成。

5.根据权利要求1所述的检测羊MVV及所引起的传染病的试剂盒，其特征在于，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、酶浓缩液稀释液、显色液和终止液，包被酶标板以所述的重组蛋白作为包被抗原。

6.根据权利要求5所述的检测羊MVV及所引起的传染病的试剂盒，其特征在于，所述的重组蛋白按以下操作制备：对env蛋白氨基酸序列进行优化，通过全基因合成并通过限制性酶切位点Nde I和Hind III将env蛋白基因插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到Top10克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株中，通过IPTG诱导表达env蛋白，之后通过亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化具有生物学活性的重组env蛋白。

7.根据权利要求6所述的检测羊MVV及所引起的传染病的试剂盒，其特征在于，包被酶标板每孔包被重组蛋白4μg，包被缓冲液采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，并用5％的脱脂乳和1％的蔗糖的0.01M的PBS溶液作为封闭液进行封闭。

8.根据权利要求6或7所述的检测羊MVV及所引起的传染病的试剂盒，其特征在于，阴性对照血清2mL，为健康未免疫犊羊血清，经IDVET MVV总抗体检测试剂盒检测为阴性，样本稀释液50倍稀释；阳性对照血清2mL，成年羊免疫env蛋白后1月采集的血清，湖州英创生物科技有限公司HRP藕联物稳定/稀释剂I 20倍稀释，1.8≦OD450nm≦2.3；样品稀释液为含有50％马血清，2.5％脱脂乳，1％吐温和0.002mol/lEDTA的0.01M的PBS溶液，共120mL；酶标二抗浓缩液为0.6mL，由美国Jackson ImmunoResearch公司生产的兔抗羊IgG稀释100倍而得，兔抗羊IgG稀释液为湖州英创生物科技有限公司HRP藕联物稳定/稀释剂I；酶标二抗浓缩液稀释液为含有5％马血清的0.01M的PBS溶液，共60mL；浓缩洗涤液为20×洗涤液，为含0.5％吐-20pH 7.2-7.4的0.2M的PBS溶液，共100mL；显色液包括显色液A和显色液B，显色液A：称取200mg四甲基联苯胺，溶于100mL的无水乙醇中，双蒸水定容至1000mL；显色液B：称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75％过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至1000mL，调节PH值为4.5-5.0，显色液A和显色液B均为30mL；终止液为2M的H2SO4溶液，共30mL。