CN103487582A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及其方法，其包括供体微珠、受体微珠、猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体及带His标签的N蛋白抗原。本发明通过优化供体微珠、受体微珠、单克隆抗体、抗原以及血清等试验反应条件，建立了检测PRRSV抗体的竞争AlphaLISA检测方法。利用本发明的试剂盒进行PRRSV抗体的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗涤，不受溶血影响，检测成本低，检测时间短。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的免疫学检测，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及其方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征病（PRRS）的主要病原。该病主要引起怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪呼吸道症状，感染猪免疫抑制和亚临床感染，并对其它致病因子的易感性增加。自1987年美国首次报道了猪繁殖与呼吸综合征以来，该病呈世界性流行，给养猪业造成巨大损失。我国自1996年首次分离到该病毒以来，已先后在广东、上海、福建等省暴发和流行，目前该病在我国已普遍存在。现有的检测方法主要有病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶技术，免疫胶体金技术，免疫荧光抗体染色技术，核酸探针杂交技术（ISH），ELISA、PCR和real time PCR等，各有优缺，且特异性差异较大。同时，方法对样品和人员的要求较高。由于猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒或免疫猪繁殖与呼吸综合征疫苗均能产生相应的抗体，且抗体能较好的反应其免疫或感染病毒的情况，因此，可以通过检测PRRSV 的抗体来反应其免疫感染病毒情况。
AlphaLISA技术主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用。当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近时, 激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号。具体来说，在680nm 的激光照射下, 供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，发射波长为615nm。在生物分子不存在特异的互相作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。AlphaLISA技术凭借一种专有的基于微珠的技术，将传统的ELISA 转化为均相的“无需洗涤”的检测。
AlphaLISA技术所使用的稀土元素铕（Eu），发射波长非常尖锐，为615nm，从而大大减少了检测样品中杂质的干扰，可直接检测复杂样品（血清和体液）中的生物分子。在临床上，这非常适合测定人和动物的血清和体液样本。而此技术的高通量、高灵敏度、操作简便，能更准确、更省时的测定细胞因子等生物标志物。目前，已广泛用于药物筛选、细胞因子、病变基因、血清抗体等的检测。
中国发明专利（申请号为：201210031802.X、201210047016.9）分别公开了采用AlphaLISA技术检测肠道病毒71型衣壳蛋白（Anti-EV71 VP1 IgM）和甲型肝炎病 IgM 的方法。但是，目前尚无利用AlphaLISA技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的试剂盒及检测方法的报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测用试剂盒，第二目的是提供一种用于食品安全检测的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测方法。
猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，包括供体微珠、受体微珠、猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体及带His标签的N蛋白抗原。
其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE,AS101D（即Nickel chelate Donor beads(PE,AS101D)），浓度为80μg/mL，500μL；所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE,AL105C（即Anti-mouse IgG Acceptor beads(PE,AL105C)），浓度为80μg/mL，500μL。
所述带His标签的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体是针对猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的特异性抗体。
前述试剂盒，包括供体微珠80μg/mL、受体微珠80μg/mL、猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体100nM/L及带His标签的N蛋白抗原180nM/L。使用时，以总体系20μL计，每孔添加量为：80μg/mL受体微珠3μL、80μg/mL供体微珠5μL、180nM/L带His标签的N蛋白抗原 5μL、100nM/L猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体 5μL及待测样本2μL。待测样本可以是血清、体液等。
具体地，编码前述带His标签的N蛋白抗原的基因为PRRSV N基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
更具体地，前述PRRSV N基因是通过RT-PCR扩增反应得到的；RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤：
1）反应板的待测孔中每孔加入2μL待测样本，反应板的对照孔中加入2μL 1×稀释缓冲液；
2）每孔加入5μL 180nM/L带His标签的N蛋白抗原和5μL 100nM/L猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育1h；
3）每孔加入80μg/mL受体微珠3 μL 、80μg/mL供体微珠5μL，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育30 min；
4）结果读取：将反应板置Enspire（PE）AlphaLISA检测系统中读值。
采用上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：利用本发明的试剂盒进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗涤，不受溶血影响。
本发明的优点是（1）、操作简单，不需要洗涤；（2）、高特异性：抗原与抗体的特异性结合，均相的反应，所需样本体积小，仅需2 ??L；（3）、检测时间短：检测时间比传统的ELISA时间短，仅需1.5 h即可完成检测；（4）、灵敏度高：最低检测极限比普通ELISA高5～10倍；样本检测的检出率达到96.7%；（5）、背景低，抗淬灭能力强：采用长波长激发，短波长发射，不会有来自荧光的背景；且利用时间分辨荧光的检测模式，进一步降低了背景，确保结果的真实性，615nm的发射波长，非常尖锐，基本没有来自样品的淬灭干扰，是进行血清、血浆、体液等复杂样品检测的理想选择；（6）、用途：可用于血清及其相关样本中猪繁殖与呼吸综合征抗体的快速检测。
附图说明
图1为PRRSV N基因全长的核酸扩增电泳图；
图2为PRRSV N蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果；图中M-为预染蛋白分子量标准，从上至下分子量依次为170KD、95KD、72 KD、55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、10KD；1-为未诱导的对照；2-为诱导的全菌液，3-为诱导的上清液，4-为沉淀；2、3、4泳道均为PRRSV N全长1-372，分子量大小约为31 KD，与预期结果一致；         
图3为His-标签PRRSV N全长蛋白的Western blot鉴定结果;图中1和2为His标签的PRRSV N蛋白全长1-372，分子量大小约为31 KD； M为Western blot蛋白分子标准，从上至下分子量依次为170KD、95KD、72 KD、55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、10KD；
图4为重组质粒pET-32a-PRRSV N经XhoΙ、KpnΙ双酶切后电泳图；图中1-为pET-32a-PRRSV N进行双酶切后，2-为空载体，3-为pET-32a-PRRSV N进行双酶切前，M-为15000DL Marker。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施中使用的猪繁殖与呼吸综合征病毒VR2332株购自美国ATCC，保存于重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心。
实施例
一、PRRSV N重组蛋白原核表达质粒的构建及鉴定
1、目的片段扩增
1.1 RT-PCR扩增
以毒株PRRSV VR2332（GenBank No. ：EF536003.1）的基因组为模板，进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增所需目的片段PRRSV N基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
上下游引物分别引入Kpn I和Xho I酶切位点，引物设计采用Primer Preier5(一种引物设计软件)，引物由宝生物（大连）公司合成，引物序列见表1。
表1 引物序列
                                                
Figure 2013104712513100002DEST_PATH_IMAGE001
RT-PCR反应体系如表2所示（总体积25μL)
表2 RT-PCR反应体系
反应体系 体积(μL)
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1
2×1 Step Buffer 12.5
上游引物(20μM) 0.5
上游引物(20μM) 0.5
模板RNA（或阳性质控RNA） 3
Rnase Free dH2O 7.5
反应条件为：50℃ 30min，94℃ 2min，94℃ 30sec，56℃ 30sec,72℃ 1min；30个循环；72℃延伸10min。
扩增的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在紫外线透射仪中切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块，将其放进1.5mL的离心管中，用核酸凝胶回收试剂盒回收纯化。
1.2 T-A克隆
将回收的PCR扩增产物与（克隆载体）pMD19-T-vector连接构成重组质粒pMD19-PRRSV-N，连接反应体系如下（总体积10μL，4℃连接过夜）。
表3 T载体连接体系
反应体系 体积（μL）
pMD19-T-vector 1
回收DNA片段（PCR扩增产物） 4
SolutionⅠ 5
合计 10
1.3 双酶切反应
采用限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ对构建的阳性重组质粒pMD19-PRRSV-N和表达载体pET-32-a(+)进行双酶切，总体积30??L，37℃水浴酶切3h。
表4 双酶切反应体系
反应体系 体积（μL）
阳性重组质粒 8
10×M缓冲液 3
Kpn I 1
Xho I 1
ddH2O 17
将酶切产物加入10×DNA上样缓冲液在1.2%的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳。待目的产物与pMD19T载体相分离后，切下目的片段并回收。
2、N全长1-372的表达载体的构建
将带有双酶切位点的目的基因片段与经相同酶切（XhoⅠ、KpnⅠ）的组氨酸（His）标签融合蛋白表达载体PET-32-a(+)（为可以购买）进行连接，反应体系如下（总体积20μL，连接2h）。
表5 连接反应体系
反应体系 体积（μL）
10×T4 DNA连接缓冲液 2
T4 DNA连接酶 2
pET-32-a（双酶切后） 3
目的基因片段 13
将与pET-32-a(+)原核载体连接的连接产物转化入BL21（DE3）感受态细胞中，转化方法采用常用手段（37℃震荡培养2h后），取200μL涂于固体LB琼脂培养板上（含50μg/mL Amp），37℃温箱倒置培养12 h ～16h。挑取单个细菌菌落，置于5mL含100μg/mL Amp的液体LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养过夜，提取重组质粒DNA pET-32a-PRRSV N(1-372)，并将重组质粒DNA送宝生物（大连）有限公司测序。
3、酶切鉴定
将构建好的重组质粒pET-32a-PRRSV N(1-372)用Kpn I、Xho I双酶切，全长1-372共372bp，送宝生物（大连）有限公司测序确认。Marker从上到下依次为10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、250bp。电泳结果如图4所示。
4、PRRSV N全长重组蛋白的小量表达鉴定
分别将测序鉴定正确的单克隆菌液以1:1000（v/v）的比例接种到含有Amp的5 mL LB液体培养基，放入摇床37℃，170 rpm震荡培养过夜，再以1:100（v/v）的比例转接至含有Amp的5 mL LB液体培养基中，37℃，170 rpm震荡培养1.5～2h至菌液光密度值600（OD600）达到0.6～0.8，然后加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），其中另一管作为未诱导的对照不加入IPTG，37℃，170rpm继续培养3～4h。将每管各吸出1000 μL菌液至1.5 mL离心管，12000 rpm离心1 min，收集菌液，再用25μL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬起沉淀，然后加入25μL 2×蛋白上样缓冲液充分混匀后100℃煮沸10 min，再12000 rpm离心1 min。取15μL上样，常规进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色，根据诱导前与诱导后对比分析蛋白电泳结果，观察是否有蛋白表达，选取阳性菌种保存于-80℃备用。
5、PRRSV N全长重组蛋白的纯化
5.1 试剂准备
(1)变性液：6M盐酸胍，20mM磷酸氢钠，500mM氯化钠，Ph7.8；
(2)缓冲液A：20mM Tris-HCl(pH8.5)，500mM KCl ，20mM imidazole ，5mM β-ME，10%(v/v)甘油，8M Urea；
(3)缓冲液B：20mM Tris-HCl(pH8.5)，1M KCl，5mM β-ME，10%(v/v)甘油，8M Urea；
(4)缓冲液C：20mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，200mM imidazole ，5mM β-ME，10%(v/v)甘油，8M Urea；
(5)透析缓冲液：8M Urea溶于1×PBS缓冲液中；
(6)0.2mM Ni2SO4；
(7)2%（w/v）NaHCO3和1mM EDTA，pH8.0；
(8)1Mm EDTA，pH8.0。
5.2 试验步骤
5.2.1 蛋白诱导表达
(1)阳性表达菌种以1:1000（v/v）的比例加入5 mL含50??g/mL Amp的液体LB培养基中，37℃，150 rpm震荡培养过夜；
(2)将培养物按1:100（v/v）的比例加入100 mL含有Amp的液体 LB培养基中，37℃，150 rpm震荡培养2～3h至菌液的OD600达到0.6～0.8；
(3)加入终浓度为0.5mmol/L 的IPTG后，150 rpm，37℃诱导表达3 h；
(4)收集培养液，10000 rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀（称取收集离心管前后离心瓶的重量，以计算出沉淀湿菌重量）；
(5)用20 mL预冷PBS重悬菌体沉淀，4℃ 10000 rpm离心10 min，此步重复两次；
(6)每1g湿菌加入250 μL Cocktail II和250 μL Triton-100(一种去污剂)，于冰浴中超声破碎细菌，每超声5 sec，间歇10 sec，共超声20 min，超声功率为300W。超声后4℃以10000 rpm 离心10 min；
(7)上清先存放于4℃冰箱，1g沉淀应加入7 mL变性液，重悬沉淀，室温轻摇变性1 h～2 h，4℃以10000 rpm离心10 min；
(8)取上清与处理好的镍柱结合，常温结合2h。
5.2.2 蛋白纯化（离心均为3000 rpm离心3 min）
 (1) 缓冲液A洗6次（10倍柱体积）；每次4℃，3 min。
（2）缓冲液B洗6次（10倍柱体积）；每次4℃，3 min。
（3）缓冲液A洗2次（10倍柱体积）；每次4℃，3 min。
（4）缓冲液C洗脱。至少洗10次。每次1～2 min。
5.1.3 蛋白透析
 根据蛋白溶液的体积，选取适当截留量及长度的透析袋，用无菌蒸馏水清洗后，先用透析袋夹封住一端，将含有蛋白溶液装入透析袋后再封闭另一端。在4℃条件下，先用含8 mol/L 尿素的PBS（pH8.0）透析4h，再用PBS(pH8.0)逐步稀释，使尿素的浓度以每4h递减2 mol/L的速度直至最终浓度为0 mol/L，其中在4 mol/L时透析过夜。在4℃以10000rpm离心10 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
6、PRRSV N全长重组蛋白的Western Blot 鉴定
6.1 操作方法：
 （1）样品加样前处理：取纯化后的PRRSV N全长重组蛋白100μL加入等体积的1×SDS蛋白上样缓冲液，混匀，100℃变性5min；
 （2）SDS-PAGE凝胶的制备：配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。在浓缩胶80V，分离胶110V电压条件下电泳，直至指示剂溴酚蓝迁移至胶底部；
（3）蛋白的电转移：将凝胶放入电转缓冲液中平衡10 min，依凝胶大小，剪裁出相同大小聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），将其先在甲醇溶液中浸润5min活化后，再置电转缓冲液中平衡10min；同时，准备同样大小的3层滤纸，置电转缓冲液平衡10min，在电转仪的正极极板上依次放置3层滤纸、PVDF膜、凝胶和3层滤纸，赶走各层间气泡，压上负极极板，以1.5mA/cm2稳流进行电转90 min；
（4）PVDF膜的封闭，一抗作用：转移完毕，PVDF膜用10mL含5%脱脂乳的封闭液，4℃封闭过夜；
（5）一抗孵育： 弃封闭液，1×TBST室温漂洗3次，每次5min。加入5mL稀释后的PRRSV N蛋白单克隆抗体，用Western blot一抗稀释液1:1000稀释PRRSV N蛋白单克隆抗体。37℃在摇床上缓慢摇动，孵育1 h。
（6）二抗孵育：取出PVDF膜，1×TBST室温漂洗3次，每次5min。将PVDF膜放入杂交袋中，加入稀释后（1:2500）的辣根过氧化氢酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG(二抗)，用Western blot二抗稀释液1：2500倍稀释羊抗鼠IgG-HRP，37℃摇动孵育1h。
(7) 显色：取出PVDF膜，1×TBST洗液洗3次，每次5 min。加入新鲜配制的显色液(显色液A液200uL，C液20uL，混匀)。将PVDF膜置于显色液中，室温避光显色。10min后观察，至蛋白条带显出后，用双蒸水终止反应。显色后拍照打印存档。
6.2 结果
将洗脱的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，一方面用考马斯亮蓝染色，蛋白分子量大小与预期相似。考马斯亮蓝结果见图2，Western Blot鉴定结果见图3。
二、Anti-PRRSV N  IgG  AlphaLISA反应条件的摸索
1、试验原理
在该方法中，带His标签的PRRSV N抗原可与PRRSV N 蛋白单克隆抗体反应，与anti-mouse IgG Acceptor beads和Nickel chelate Donor beads相互作用，通过680nm的激光照射，供体微珠anti-mouse IgG上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧，单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，通过615nm的发射波长测定吸光度值。如果被测样品中存在PRRSV 抗体，则可以与PRRSV N 蛋白单克隆抗体竞争带His标签的PRRSV N抗原，则检测值降低（与受体微珠和供体微珠的对照孔相比较，值降低2倍以上），如果被测样品中不存在PRRSV抗体，则检测值较高（与受体微珠和供体微珠的对照孔相比较，差异不明显）。如果生物分子不存在特异的相互作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号产生。
本试验分析物为PRRSV N抗体阳性对照（来自ELISA试剂盒）。我们选择了经ELISA方法证明PRRSV N抗体阳性的血清样本和阴性的血清样本各10份进行体系的摸索。
2、操作方法
1）待测孔中每孔加入2μL血清样本，对照孔加入2μL 1×稀释缓冲液；
2）每孔加入5μL 180nM/L带His标签的N蛋白抗原和5μL 100nM/L猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育1h； 
3）每孔加入80μg/mL受体微珠3 μL 、80μg/mL供体微珠5μL，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育30 min；
4）置于Enspire读板机进行检测。
  在总体系为20μL的条件下，得到一个比较稳定的检测体系。即受体微珠的终浓度为12 μg/mL，每孔3μL；供体微珠的终浓度为20μg/mL，每孔5μL；180nM/L带His标签的N蛋白抗原量每孔5μL；100nM/L的猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体5μL；血清2μL；总体系为20μL。
三、Anti-PRRSV  Ab  AlphaLISA检测方法的初步应用
1、用ELISA法初筛部分阳性血清
为了有效的评价已建立的Anti-PRRSV Ab  AlphaLISA检测方法的有效性。本发明使用商业化的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒（IDEXX）对50份猪血清样本进行初步筛选。
1.1 检测原理
本试剂盒采用间接酶联免疫吸附试验原理。微孔条上预包被重组的PRRSV抗原（即重组蛋白），被检测样品在包被孔中孵育时，如果存在特异性的PRRSV抗体，则PRRSV的特异性抗体可与包被的抗原形成抗原抗体复合物，洗去未结合的成分；加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪IgG抗体，可与孔中的PRRSV抗体结合，当样品中存在PRRSV抗体时，则形成“抗原-抗猪IgG抗体-PRRSV抗体 ”复合物，洗去未结合的成分；加入显色剂TMB，复合物上连接的HRPO催化显色剂反应，生产蓝色产物，加入终止液（SDS），终止反应，颜色不变。
1.2 操作方法
(1)洗液的配制：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水10倍稀释；
(2)样品编号：将样品对应微孔板按序编号，每板设阴性对照2孔，阳性对照2孔和空白对照1孔；
(3)样品的稀释：每孔加入样品稀释液195μL，样品5μL，对照孔和空白孔除外；
(4)加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL，空白对照加入100μL样品稀释液，轻轻震荡混匀。用封板膜封板后，室温孵育30min.±2min；
(5)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干；
(6) 加二抗：每孔加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪IgG抗体100μL，轻轻震荡混匀，室温孵育30min.±2min；
(7)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干；
(8)显色：每孔加入TMB底物显色液100μL，轻轻震荡混匀，室温避光显色15min；
(9)终止：每孔加终止液100μL，轻轻震荡混匀，10min内测定结果。
(10)测定：设定酶标仪波长于650nm处，测定各孔A（650）值。
1.3 结果
  经检测PRRSV IgG阳性样本为36例，主要为疫苗免疫的猪和有临床发病症状的猪。同时，使用18份未免疫疫苗且无临床症状的猪血清作为对照，结果显示18份样本全部为阴性。
2、竞争AlphaLISA检测方法的初步应用
将上述ELISA方法建立的36例PRRSV样本的IgG阳性样本和18份健康猪的血清（IgG阴性）作为AlphaLISA检测方法的初步评价。检测样本为2μL血清，按照之前优化过的试验条件建立的20μL检测体系进行样本的检测。
  检测结果发现，36例PRRSV  IgG阳性的样本，AlphaLISA检测方法检测的结果也为阳性，18份健康猪的血清通过AlphaLISA检测方法检测结果也显示为阴性，符合率达到100%。为进一步了解AlphaLISA检测的敏感性，试验将经过核酸检测阳性，而IgG检测结果阴性的PRRSV的血清，进行了AlphaLISA检测，结果检测出8份阳性样本（表6）。
表6 样本结果比较
 
Figure 2013104712513100002DEST_PATH_IMAGE002
四、Anti-PRRSV N  IgG  AlphaLISA方法的评价
1、样本检测
 为了评价所建的Anti-PRRSV N  IgG  AlphaLISA方法，将PRRSV核酸和ELISA检测结果同时阳性的样本确定为IgG阳性样本。通过此方法筛选出30份阳性样本。同时，以100份健康的进口种猪的样本为阴性样本建立130份样本的PRRSV IgG 评价样本库（表7）
表7  PRRSV IgG 样本库组成
样本组成 样本数量（份） 核酸检测 ELISA（IgM ） AlphaLISA(IgM)
阳性样本 45 45（+） 30（+） 29（+）
健康样本 130 130（-） 无 3（+）
2、Anti-PRRSV N  IgG  AlphaLISA方法的评价
  使用上述样本对建立的Anti-PRRSV N  IgG AlphaLISA方法进行评价。检测样本为2μL血清，按照已优化好的试验条件建立20μL检测体系进行检测。检测结果显示：30例PRRSV IgG阳性的样本，AlphaLISA方法的检测结果有29份为阳性。100份健康猪的血清通过Anti-PRRSV N  IgG AlphaLISA检测方法检测结果97份显示为阴性，3份为阳性（表8）。
表8  Anti-PRRSV N  IgG  AlphaLISA方法评价
 
Figure 2013104712513100002DEST_PATH_IMAGE003
检测结果显示：建立的 Anti-PRRSV N  IgG AlphaLISA方法，其灵敏度=96.7%、特异性=97.0%、假阳性率=3.3%、假阴性率=3.0%、阳性预测值=90.6%、阴性预测值=99.0%、准确度=96.9%。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>  猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及其方法
<160>  4   
 
<210>  1
<211>  123
<212>  PRT
<213>  猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白抗原
 
 
<400> SEQ ID NO.1
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly
1                          6                         11                        16
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
                     21                        26                      31
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys
                36                       41                        46
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
          51                        56                       61
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln
     66                       71                        76
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
81                        86                        91                       96
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
                    101                      106                     111
Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala
               116                     121
 
<210>  2
<211>  372
<212>  DNA
<213>  猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因
 
 
<400>  SEQ ID NO.2
atgccgaaca acaacggtaa acagcagaaa cgtaagaaag gtgacggtca gccagtgaac    60
caactgtgcc agatgctggg taaaatcatt gctcagcaga accagagccg cggtaaaggc    120
cctggcaaaa agaacaagaa aaaaaacccg gagaaaccgc acttcccgct ggctaccgaa    180
gatgatgtcc gtcaccactt cacgccgtct gaacgtcagc tgtgcctgtc ctccattcaa    240
accgccttta atcagggtgc aggcacctgt actctgtctg acagcggccg catctcctac    300
accgtagaat tcagcctgcc gactcaccat accgttcgtc tgatccgtgt tactgcgtct    360
ccgtctgcgt aa                                                        372
        
 
<210>  3
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  SEQ ID NO.3
cgcggtaccg acgacgacga caagatgccg aacaacaacg gtaaacag                 48
 
 
<210>  4
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  SEQ ID NO.4
cgcctcgagt tacgcagacg gagacgcagt aac                                  33

Claims (5)

1. 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：包括供体微珠、受体微珠、猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体及带His标签的N蛋白抗原；
其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE,AS101D；所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE,AL105C；
所述带His标签的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有与N蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：所述供体微珠80μg/mL、受体微珠80μg/mL、猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体100nM/L及带His标签的N蛋白抗原180nM/L；
使用时，以总体系20μL计，每孔添加量为：80μg/mL供体微珠5μL、 80μg/mL受体微珠3μL、180nM/L带His标签的N蛋白抗原 5μL、100nM/L猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体 5μL及待测样本2μL。
3.根据权利要求1或2所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：编码所述带His标签的N蛋白抗原的基因为PRRSV N基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
4.根据权利要求3所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于：所述PRRSV N基因是通过RT-PCR扩增反应得到的；RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
5.利用权利要求1或2所述试剂盒进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争AlphaLISA检测的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤：
1）反应板的待测孔中每孔加入2μL待测样本，反应板的对照孔中加入2μL 1×稀释缓冲液；
2）每孔加入5μL 180nM/L带His标签的N蛋白抗原和5μL 100nM/L猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育1h；
3）每孔加入80μg/mL受体微珠3 μL 、80μg/mL供体微珠5μL，1000rpm 离心10 sec，室温23℃避光孵育30 min；
4）结果读取：将反应板置Enspire（PE）AlphaLISA检测系统中读值。
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