CN103275194A - 一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原及其elisa检测方法 - Google Patents

Abstract

一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原及其ELISA检测方法，它涉及一种生物技术领域的检测方法及抗原。本发明要解决现有的可区别猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体ELISA检测方法步骤繁琐、所耗时间较多的问题。所述ELISA检测方法步骤为：一，重组蛋白包括spike蛋白C抗原位点、D抗原位点，两抗原位点之间用柔性氨基酸序列连接；以该重组蛋白质作为抗原；二，采用间接ELISA方法检测猪血清，确定猪血清中有无猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体；本发明的抗原包括spike蛋白C抗原位点、D抗原位点，之间用柔性氨基酸序列连接。本发明的方法重复性好、灵敏度高、特异性强。

Description

一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原及其ELISA检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的检测方法及抗原，具体是一种可区别检测猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒感染的间接ELISA检测方法及抗原。

背景技术

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）引起的猪的一种急性，高度接触性传染病，各种年龄及品种的猪对本病均易感，其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100%。目前，我国该病的发病率较高，对养猪业的影响较大。spike蛋白形成病毒粒子表面的突起，是3种主要结构蛋白之一。研究表明，spike蛋白携带TGEV主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白。spike蛋白含有4个抗原位点，从氨基末端开始依次定为C、B、D和A。研究表明，位点A和位点B为构象抗原表位，位点C和位点D为线性抗原表位。猪呼吸道冠状病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）被认为是TGEV的基因缺失变异株，流行于欧盟和北美地区。与TGEV基因核酸序列相比，PRCV的基因组主要是在spike基因5′端有一个大的缺失区。缺失区大小因分离株的不同从621-681bp不等，进而丧失了B、C抗原位点。PRCV只能引起轻微的临床症状。TGEV和PRCV能诱导机体产生完全交叉反应的中和抗体。我国几乎每年都要从欧盟和北美地区进口种猪，TGE的检疫是这些猪入境检疫的一个重要组成部分，然而PRCV已经广泛流行于欧美国家，因此有些双边条款明确规定TGEV抗体阳性不影响种猪的进口。但这些国家猪群中TGEV和PRCV共存的现状潜伏着在进口种猪时TGEV强毒株传入国内的危险。我国学者在应用进口诊断试盒检测国内部分猪场猪血清的TGEV抗体和PRCV抗体时发现一部分血清样品为PRCV阳性，表明我国猪群也存在PRCV感染。

TGEV血清抗体可通过多种不同的血清学方法检测，如间接荧光抗体试验（IFAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫沉淀试验（RIP）、血清中和试验（SN）等，最常用的是SN试验。IFAT的敏感性和可靠性不如SN试验，而且需要特殊而昂贵的设备，不适合基层使用。TGEV与PRCV有一定相关性，使SN特异性不强，可能出现假阳性。随着分子生物学的发展，重组抗原应用于TGEV血清学诊断的方法已有报道。针对N蛋白的ELISA诊断方法报道较多，但在理论上不能区分PRCV。目前，已有的商业化试剂盒，如SVANOVIRTM传染性胃肠炎病毒/猪呼吸道冠状病毒鉴别诊断试剂盒是基于阻断ELISA而设计的，与常规间接ELISA相比，步骤更为繁琐，所耗时间更多。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的可区别猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体ELISA检测方法步骤繁琐、所耗时间较多的问题，而提供一种较为简便的猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原及其ELISA检测方法。

本发明的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原，含有spike蛋白C抗原位点、spike蛋白D抗原位点和柔性氨基酸序列；所述的spike蛋白C抗原位点与spike蛋白D抗原位点通过柔性氨基酸序列连接，所述的spike蛋白C抗原位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；spike蛋白D抗原位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；柔性氨基酸的序列如SEQ ID NO：3所示。

所述抗原，在猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的间接ELISA检测方法中使用。

本发明的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原及其ELISA检测方法，包括如下步骤：

将猪血清中的氨基酸序列spike蛋白C抗原位点和D抗原位点，采用柔性氨基酸连接，得重组蛋白质；以重组蛋白质为抗原，采用间接ELISA方法检测猪血清，确定猪血清中是否含有猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体。

本发明包含以下有益效果：

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明将含有猪传染性胃肠炎胃肠炎病毒spike蛋白C、D两个抗原位点的重组蛋白包被，通过1次常规间接ELISA方法区别检测猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒感染；实验证明，本方法重复性好、灵敏度高、特异性强。

附图说明

图1重组蛋白原核表达产物的SDS-PAGE检测；其中，1为蛋白低分子量marker；2为诱导的细菌裂解产物（箭头指示目标条带）；3为未诱导的细菌裂解产物；

图2重组蛋白原核表达产物与TGEV阳性血清免疫反应性的Westernblot分析；其中，1为蛋白低分子量marker；2为纯化的重组蛋白与TGEV阳性血清的免疫反应性；3为空载体表达蛋白对照；

图3重组蛋白原核表达产物与PRCV阳性血清免疫反应性的Western blot分析；其中，1为蛋白低分子量marker；2为纯化的重组蛋白与PRCV阳性血清的免疫反应性；3为空载体表达蛋白对照。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原，含有spike蛋白C抗原位点、spike蛋白D抗原位点和柔性氨基酸序列；所述的spike蛋白C抗原位点与spike蛋白D抗原位点通过柔性氨基酸序列连接，所述的spike蛋白C抗原位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；spike蛋白D抗原位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；柔性氨基酸的序列如SEQ ID NO：3所示。

与现有技术相比，本实施方式具有如下有益效果：本实施方式将含有猪传染性胃肠炎胃肠炎病毒spike蛋白C、D两个抗原位点的重组蛋白包被。

具体实施方式二：本实施方式的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原及其ELISA检测方法，包括如下步骤：

将猪血清中的氨基酸序列spike蛋白C抗原位点和D抗原位点，采用柔性氨基酸连接，得重组蛋白质；以重组蛋白质为抗原，采用间接ELISA方法检测猪血清，确定猪血清中是否含有猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体。

与现有技术相比，本实施方式具有如下有益效果：本实施方式将含有猪传染性胃肠炎胃肠炎病毒spike蛋白C、D两个抗原位点的重组蛋白包被，通过1次常规间接ELISA方法区别检测猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒感染；实验证明，本实施方式的方法重复性好、灵敏度高、特异性强。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的氨基酸序列spike蛋白C抗原位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的氨基酸序列spike蛋白D抗原位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：所述的柔性氨基酸的序列如SEQ ID NO：3所示。其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：所述的抗原的包被量为0.2μg/孔。其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：所述的采用柔性氨基酸连接的具体操作如下：将spike蛋白线性表位C和表位D编码核酸序列，两位点之间插入柔性氨基酸片段的核酸序列；其中，所述的spike蛋白线性表位C的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；spike蛋白线性表位D的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；柔性氨基酸片段的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。其它与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：所述的编码柔性氨基酸片段的核酸序列的5’端与编码spike蛋白线性表位C核酸序列的3’端相连接，编码柔性氨基酸片段的核酸序列的3’端与编码spike蛋白线性表位D核酸序列的5’端相连接。其它与具体实施方式二至七之一相同。

本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

具体操作如下：

步骤一C和D抗原位点片段的串联设计

根据大肠杆菌偏爱密码子表，对spike蛋白线性表位C（核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示）和表位D（核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示）编码核酸序列进行优化，两位点之间插入柔性氨基酸片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示），将上述优化后的核酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

步骤二表达载体的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ分别双酶切pET-32a(+)和步骤一合成的基因片段，对酶切回收的pET-32a(+)和合成片段进行连接，得重组质粒pET-32a-(C-D)；对重组质粒pET-32a-(C-D)进行酶切鉴定，对酶切鉴定后的阳性重组质粒pET-32a-(C-D)交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定；

步骤三重组蛋白的表达

将步骤二鉴定成功后的阳性重组质粒pET-32a-(C-D)转化至BL21(DE3)PlysS感受态细胞中，挑取含有阳性重组质粒的菌落接种于3mL液体LB培养基中37℃震荡培养12小时，然后将200μL菌液按体积比为1:100的比例加入到含有50μg/mL氨苄青霉素的20mLLB液体培养基中，当OD₆₀₀为0.4～0.6时，加入IPTG（终浓度为1.0mmol/L），28℃震荡培养，诱导4小时，收获菌体沉淀，对菌体进行超声波裂解，对裂解物上清及沉淀进行SDS-PAGE分析。经SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，由图1可知，在25kDa有明显的目的带，和预期大小相符；其中，1为蛋白低分子量marker；2为诱导的细菌裂解产物（箭头指示目标条带）；3为未诱导的细菌裂解产物；

其中，所述的大肠杆菌BL21(DE3)PlysS可通过公开市售的商业渠道取得，如天跟生化科技（北京）有限公司，公司地址：北京市海淀区西小口路66号东升科技园（北领地）C7-3；

步骤四重组蛋白的纯化

Ni-NTAAgarose购自Invitrogen公司、尿素购自Sigma公司、NiCl₂-6H₂O购自Fluka公司。

所需配制的试剂如下：

（1）Stock solution A(10×)：13.8g磷酸二氢钠，146.45gNacl，ddH₂O定容至500mL，室温保存；

（2）Stock solution B(10×)：14.2g磷酸氢二钠，146.45gNacl，ddH₂O定容至500mL，室温保存；

（3）盐酸胍：80mLddH₂O中加入0.58mL的Stock solution A(10×)、9.42mLStock solutionB(10×)、57.3g盐酸胍，完全溶解后，调pH至7.8，定容至100mL，0.45um过滤除菌，室温保存；

（4）Denaturing Binding Buffer：80mL的ddH₂O中加入0.58mLStock solution A(10×)、9.42mLStock solution B(10×)、48.1g尿素，50-60℃加热融化后，冷却至室温后，调pH至7.8，定容至100mL，0.45um过滤除菌，室温保存；

（5）Denaturing Wash Buffer pH6.0：80mL的ddH₂O中加入7.38mLStock solution A(10×)、2.62mLStock solution B(10×)、48.1g尿素，50-60℃加热融化后，冷却至室温后，调pH至6.0，定容至100mL，0.45um过滤除菌，室温保存；

（6）Denaturing Wash Buffer pH=5.3：取10mL的Denaturing Wash Buffer pH=6.0用HCl调至pH=5.3备用；

（7）Denaturing Elution Buffer：80mL的ddH₂O中加入10mLStock solution A(10×)、48.1g尿素，50-60℃加热融化后，冷却至室温后，调pH至4.0，定容至100mL，0.45um过滤除菌，室温保存。

对阳性菌进行大量诱导（500mL体系），将诱导后的菌体用PBS（135mM NaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH=7.4）洗涤3次，制备细菌细胞裂解物（变性条件）：

（1）采用平衡盐酸胍裂解缓冲液至pH=7.8，37℃；

（2）5000rpm离心5分钟，50mL菌液，收获沉淀；

（3）用盐酸胍裂解缓冲液8mL重悬沉淀；

（4）缓慢搅动细胞5～10分钟室温进行；

（5）超声裂解，高强度5s/次，共3次；

（6）3000g离心，15分钟离去细胞碎片，回收上清；

（7）取5mL用于SDS-PAGE分析，其余-20℃保存备用；

变性条件下的纯化步骤：

（1）加8mL上述裂解物至已制好的柱中；

（2）室温条件下轻轻地搅动（或震荡）使之结合15-30分钟，使柱中的树脂始终处于悬浮状态，采用重力法或低速离心法(800g离心1分钟)使树脂沉淀，小心吸去上清；

（3）用4mL Denaturing Binding Buffer重悬树脂，晃动2分钟，重力或低速离心沉淀沉淀树脂，小心吸取上清，4℃保存上清液，用做SDS-PAGE分析，重复1次以上；

（4）用4mL Denaturing Wash Buffer pH6.0重悬树脂，晃动2分钟，重力或低速离心沉淀树脂，小心吸取上清，4℃保存，用做SDS-PAGE分析，重复1次以上；

（5）用4mL Denaturing Wash Buffer pH5.3重悬树脂，晃动2分钟，重力或低速离心沉淀树脂，小心吸取上清，4℃保存，用做SDS-PAGE分析，重复2次以上；

（6）垂直固定好柱子，打开底部的小盖，用5mL Denaturing Elution Buffer洗脱蛋白。取1mL洗液，OD280检测洗液，之后将所有洗液于4℃透析，透析过夜以除去尿素。

步骤五重组蛋白浓度的测定

应用碧云天生物技术研究所生产的考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒对纯化的蛋白进行浓度测定，测定步骤按其说明书进行；

步骤六Western blot分析重组蛋白的免疫反应性

分别用TGEV阳性血清和PRCV阳性血清作为一抗，兔抗猪IgG-HRP作为二抗，对重组蛋白进行Western blot分析，操作如下：

（1）取处理好的菌液样品的SDS-PAGE电泳结束后，用蒸馏水洗石墨板，然后用纸巾擦干电极板上的水滴；

（2）戴上手套，剪取6张3mm Whatman滤纸和1张硝酸纤维素膜，其大小较凝胶略小，用铅笔在滤纸一角作标记，确保转印后膜与凝胶的相对方向；

（3）把硝酸纤维素膜漂浮于一盘去离子水中，浸泡5分钟；

（4）在一浅盘中加入少量转印缓冲液（39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris碱，0.037%的SDS），将6张3mm滤纸也浸泡于其中；

（5）戴上手套按如下方法安装转印装置：

a.平放底部电极（阴极）；

b.依次放3层海绵垫、3层3mm滤纸、丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、3层3mm滤纸、3层海绵垫；

c.确保滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜精确对齐，用玻璃棒赶尽气泡；

d.将石墨电极（阳极）盖于上方，接通电源，48V、300mA电转印2.5h；

（6）丽春红染色，在步骤（5）电转印后小心取下硝酸纤维素膜，于去离子水中冲洗2遍后，转移至丽春红S染液中染色，蛋白带出现后，用铅笔标出蛋白质分子量标准的位置，用去离子水漂洗硝酸纤维素膜直至颜色消退；

（7）封闭：将上述硝酸纤维素膜放入含有5%（W/V）脱脂乳的PBS（pH=7.4）中封闭，于平缓摇动的摇床上37℃温育2h；

（8）一抗与膜上靶蛋白的结合：弃取封闭液，用PBST（含0.02%Tween20的0.01mol/L，pH=7.4的PBS）洗涤滤膜3遍，每遍10分钟。将其放入封闭液稀释的猪抗TGEV或猪抗PRCV抗体溶液中，于平缓摇动的摇床上37℃温育2h；

（9）二抗与硝酸纤维素膜的结合：弃取一抗溶液，将滤膜转移到一个干净的平皿内，用PBST洗涤3次，每次10分钟。再用无磷酸盐缓冲液（150mmol/L、50mmol/LTris·Cl，pH=7.5）洗涤1遍，将兔抗猪IgG酶标抗体用无磷酸盐缓冲液稀释后，将膜浸于其中，于平缓摇动的摇床上37℃温育1h；

（10）加酶的底物进行显色：弃取二抗溶液，用无磷酸盐缓冲液洗3遍，每遍10分钟。置于新配制的4-氯-1-萘酚（4CN）溶液中（0.006g4-CN、2mL甲醇、10mLPBS、20μl30%H₂O₂），混匀后于37℃避光显色。4-5分钟后观察，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用去离子水洗涤终止反应。

检测结果证明，纯化的重组蛋白对TGEV（图2）和PRCV（图3）阳性血清具有良好的免疫反应性；其中，图2中的1为蛋白低分子量marker；2为纯化的重组蛋白与TGEV阳性血清的免疫反应性；3为空载体表达蛋白对照；图3中的1为蛋白低分子量marker；2为纯化的重组蛋白与PRCV阳性血清的免疫反应性；3为空载体表达蛋白对照。

步骤七间接ELISA方法的建立

用方阵试验测定纯化后抗原的最佳工作浓度0.2μg/孔，然后进行如下操作：

（1）包被：以磷酸盐缓冲液（pH=7.4）将重组蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，使每孔抗原包被量为0.2μg。以洗涤缓冲液PBST洗涤3次，拍干。

（2）封闭：每孔加入50μL封闭液（含有0.5%PVA，1%明胶的PBST），37℃封闭2小时。以洗涤缓冲液PBST洗涤3次，拍干。

（3）与一抗结合：待检血清样品及阳性和阴性对照用血清稀释液（含有2%PEG6000，0.8%NaCl的PBS）1:100稀释，每孔加入50μL，37℃结合1小时。以洗涤缓冲液PBST洗涤5次，拍干。

（4）与二抗结合：兔抗猪IgG/HRP用PBST1:1600稀释，每孔加入50μL，37℃结合1小时。以洗涤缓冲液PBST洗涤5次，拍干。

（5）显色：每孔加入50μLH₂O₂/OPD，37℃避光10分钟。

（6）终止：每孔加入1.25mol/H₂SO₄，测定双波长OD₄₅₀/OD₆₃₀。

（7）结果判定：按试验测得的最佳反应条件测定血清样本。检测血清的OD值小于0.250判定为TGEV/PRCV阴性，大于0.250并小于0.620判定为PRCV阳性，大于0.620判定为TGEV阳性。

（8）特异性实验：以重组蛋白为检测抗原，与抗猪轮状病毒病毒、抗猪流行性腹泻病毒和抗猪瘟病毒血清和阴性血清进行ELISA试验，结果显示无交叉反应。

（9）重复性试验：间接ELISA的板内及板间变异系数分别为5.2%和8.9%，均小于10%，表明该ELISA重复性较好。

Claims (10)

1.一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原，其特征在于所述的抗原含有spike蛋白C抗原位点、spike蛋白D抗原位点和柔性氨基酸序列；所述的spike蛋白C抗原位点与spike蛋白D抗原位点通过柔性氨基酸序列连接，所述的spike蛋白C抗原位点的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；spike蛋白D抗原位点的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；柔性氨基酸的序列如SEQIDNO：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原，其特征在于所述的采用柔性氨基酸连接的具体操作如下：将编码spike蛋白线性表位C和表位D的核酸序列之间插入编码柔性氨基酸片段的核酸序列；其中，所述的spike蛋白线性表位C的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；spike蛋白线性表位D的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；柔性氨基酸片段的核酸序列如SEQIDNO：6所示。

3.根据权利要求2所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的抗原，其特征在于所述的编码柔性氨基酸片段的核酸序列的5’端与编码spike蛋白线性表位C核酸序列的3’端相连接，编码柔性氨基酸片段的核酸序列的3’端与编码spike蛋白线性表位D核酸序列的5’端相连接。

4.一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于它包括如下步骤：

将猪血清中的氨基酸序列spike蛋白C抗原位点和D抗原位点，采用柔性氨基酸连接，得重组蛋白质；以重组蛋白质为抗原，采用间接ELISA方法检测猪血清，确定猪血清中是否含有猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体。

5.根据权利要求4所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的ELISA检测方法，其特征在于所述的氨基酸序列spike蛋白C抗原位点的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

6.根据权利要求4所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的ELISA检测方法，其特征在于所述的氨基酸序列spike蛋白D抗原位点的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

7.根据权利要求4所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的ELISA检测方法，其特征在于所述的柔性氨基酸的序列如SEQIDNO：3所示。

8.根据权利要求4所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的ELISA检测方法，其特征在于所述的抗原的包被量为0.2μg/孔。

9.根据权利要求4所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的ELISA检测方法，其特征在于所述的采用柔性氨基酸连接的具体操作如下：将编码spike蛋白线性表位C和表位D的核酸序列之间插入编码柔性氨基酸片段的核酸序列；其中，所述的spike蛋白线性表位C的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；spike蛋白线性表位D的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；柔性氨基酸片段的核酸序列如SEQIDNO：6所示。

10.根据权利要求9所述的一种猪血清中猪传染性胃肠炎病毒或猪呼吸道冠状病毒抗体的ELISA检测方法，其特征在于所述的编码柔性氨基酸片段的核酸序列的5’端与编码spike蛋白线性表位C核酸序列的3’端相连接，编码柔性氨基酸片段的核酸序列的3’端与编码spike蛋白线性表位D核酸序列的5’端相连接。

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