CN104098658A - 一种重组猪瘟病毒ns3蛋白、elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组猪瘟病毒NS3蛋白、ELISA试剂盒及其应用，首先通过将CSFV全基因序列中的NS3编码区序列克隆到pET32a-Intein-ELK16质粒载体上并表达后再诱导切割，通过离心收集上清得到重组猪瘟病毒NS3蛋白，该重组猪瘟病毒NS3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；其次，以该重组猪瘟病毒NS3蛋白为基础建立ELISA试剂盒以用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用。本发明的重组猪瘟病毒NS3蛋白纯化效率高，反应性好，花费小、操作流程简单、能够规模化生产。该重组猪瘟NS3和重组腺病毒配套使用，可以用来区分全病毒和重组腺病毒激发机体产生的抗体，对NS3抗体的快速检测具有重要意义。

Description

一种重组猪瘟病毒NS3蛋白、ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组猪瘟病毒NS3蛋白、ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
重组蛋白的生产，无论在工业领域还是实验室规模都十分重要，而重组蛋白的分离与纯化成本约占其全部成本的60％～80％(参考文献：陈浩，陈于红，朱德煦，刘建宁，重组蛋白纯化技术，中国生物工程杂志，2002，22(5):p.87-92.)。
目前蛋白质纯化的方法主要包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析，以及自切割自聚集功能的融合标签表达等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件有一定的要求，通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得超过90％的高收率，使其成为目前最常用的重组蛋白中度纯化方法之一。实验室中常用的亲和纯化技术包括多组氨酸标签(his-tag)或谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)与目的蛋白的融合表达，为不同目的蛋白的生产提供了通用的纯化手段(参考文献：Arnau，J.，C.Lauritzen等，Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for thepurification ofrecombinant proteins.Protein Expression and Purification，2006.48(1):p.1-13.)。然而昂贵纯化柱的使用和为了移除融合表达标签而需要蛋白酶的加入，这两个主要缺点使亲和纯化成本较高，不利于工业领域的应用。
2010年将大良等人(参考文献：将大良，徐兴龙，李润成，等猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立，微生物学通报[J]，2010,37(1):78-84)提供了原核表达猪瘟NS3重组蛋白建立方法，其以pET-32a(+)为原核表达载体，存在以下不足：其一，杆状病毒表达目的蛋白需要在细胞上进行操作，整个过程耗时较长，需要使用His树脂来纯化目的蛋白，花费大，操作麻烦，纯化蛋白量小，不能规模化生产；其二，只是建立了一个方法，没有一个配套使用的疫苗。
发明内容
本发明的其一目的在于提供一种重组猪瘟病毒NS3蛋白。
本发明的又一目的在于提供上述重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，旨在解决现有NS3蛋白蛋白纯化量小、不能规模化生产的问题。
本发明的再一目的在于提供一种包括上述重组猪瘟病毒NS3蛋白为抗原包被的ELISA试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述ELISA试剂盒在鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，该重组腺病毒疫苗仅含有E0和E2蛋白表达基因，可与重组猪瘟病毒NS3蛋白配套使用。
本发明是这样实现的，一种重组猪瘟病毒NS3蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。
本发明进一步提供了上述重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据GenBank登录号为AY775178.2的CSFV全基因序列中的NS3编码区序列设计一对引物N1、N2：
N1：5′-GTGGGTACCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′
N2：5′-AGCCCCGGGTAGACCAACTACTTGTTTTAG-3′；
(2)用引物N1、N2对CSFV的cDNA进行PCR扩增，得到NS3目的片段；
(3)用Kpn I、Sma I双酶切NS3片段和质粒pET32a-Intein-ELK16，回收、连接，得到pET32a-NS3-Intein-ELK16表达载体；
(4)将所述pET32a-NS3-Intein-ELK16表达载体表达的重组蛋白在诱导切割离心后，收集上清得到重组猪瘟病毒NS3蛋白。
优选地，在步骤(3)中，所述质粒pET32a-Intein-ELK16的制备方法包括以下步骤：
将含有Mycobacterium xenopi gyrA基因的Mxe Gy rA(载体中的Intein)内含肽的大肠杆菌表达载体pTXB1用EcoR I和Sma I双酶切获得Mxe Gy rA内含肽；
合成具有16个氨基酸的短肽ELK16-(LELELKLK)2和PT linker，即PTlinker-ELK16，然后将内含肽末端补平后与PTlinker-ELK16连接起来，再将其克隆到pET32a中，构成pET32a-Intein-ELK16；其中，所述短肽ELK16-(LELELKLK)2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PT linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选地，在步骤(4)中，所述诱导切割离心包括以下步骤：将目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白进行融合表达，含有内含肽和自聚集短肽的重组蛋白是以聚集体的形式存在，将表达上述融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心后获得沉淀；然后利用诱导缓冲液在诱导切割位点处的诱导切割，诱导切割位点断裂将目的蛋白从聚集体释放到溶液中，通过离心达到纯化的目的。
本发明进一步提供了一种ELISA试剂盒，包括ELISA板、碳酸盐缓冲液、PBST缓冲液、含5％脱脂乳的PBST缓冲液、辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗、显色液以及终止液；所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白。
优选地，所述显色液为TMB显色液，所述终止液为浓度为2M的H2SO4。
本发明进一步提供了上述ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用。
优选地，所述ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白用碳酸盐缓冲液包被于ELISA板混匀，100μL/孔，于4℃包被过夜后，依次进行洗板、封闭和洗板处理；
(2)加入待检血清，用含5％脱脂乳的PBST稀释，100μL/孔，同时设空白对照，于37℃作用1h后，进行洗板处理；
(3)加入辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗，100μL/孔，于37℃作用50min后，进行洗板处理；
(4)加入TMB显色液，100μL/孔，于室温避光作用30min后，加入终止液，100μL/孔，测定OD450nm值。
优选地，在步骤(1)中，所述洗板为用PBST洗3次，拍干；所述封闭为用含5％脱脂乳的PBS封闭，200μL/孔，于37℃作用1h；
在步骤(2)和(3)中，所述洗板为用PBST洗5次，拍干。
优选地，在步骤(2)中，所述待测血清包含猪瘟病毒或重组腺病毒；其中，所述猪瘟病毒包括疫苗毒和野毒，所述重组腺病毒仅包括猪瘟病毒E0和E2基因。
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明首先提供了一种重组猪瘟病毒NS3蛋白及其制备方法，通过构建一个含有可切割位点的肽段(优选为内含肽)以及具有自聚集功能的短肽的原核表达系统，将具有诱导聚集功能的短肽与有自切割功能的内含肽以及目的纯化蛋白按从左到右或从右到左两种顺序融合表达。诱导聚集功能的短肽会使融合蛋白三联体在微生物胞内表达时形成不可溶的聚集体，可以利用简单的离心或过滤手段使融合蛋白三联体与细菌裂解液中的杂质成分分离。内含肽是一段具有蛋白酶活性的特殊序列多肽，在诱导其蛋白酶活性产生后可以在设计位点的特定氨基酸残基切割，从而释放可溶的目的蛋白到溶液中。大部分融合蛋白三联体可以在表达时以酶聚集体形式表达，在离心分离细胞破碎液后，可以在沉淀中大量获得。之后通过更换缓冲液诱导内含肽剪切相应的识别位点，从而将目的蛋白释放到溶液里，而内含肽-自聚集短肽部分仍然在沉淀之中。最后利用简单的离心或过滤分离溶液和不溶物，从而在溶液中获得较高纯度的目的蛋白。通过本发明的制备方法所纯化目的蛋白具有很好的反应性，花费小、操作流程简单、能够规模化生产。
此外，该重组猪瘟病毒NS3蛋白能有效地区分NS3抗体检测为阳性和阴性的血清。在此基础上，建立间接ELISA方法以及试剂盒，用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗，其中，重组腺病毒疫苗已经在申报农业部的新兽药证书(文献来源：猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究，中国预防兽医学报，2010年第32卷第6期，p419-423)。由于猪瘟病毒基因组中只有NS3、E0和E2可以激发机体的抗体反应，而E0和E2基因已经用在了该重组腺病毒中了，针对NS3重组蛋白的ELISA检测试剂盒可以区分全病毒(包括疫苗毒和野毒)和重组腺病毒激发机体产生的抗体。因为重组腺病毒免疫机体后仅产生针对E0和E2的抗体，而不产生NS3的抗体，而疫苗接种(包括野毒感染)不仅能产生针对E0和E2的抗体，还能产生针对NS3的抗体。目前商品化的检测试剂盒是针对E2基因的，如爱德士猪瘟抗体检测试剂盒。如果用爱德士试剂盒检测为阳性的血清，用本方法检测如为阳性说明是疫苗毒或野毒引起，如本方法检测为阴性，说明是重组腺病毒接种引起，当然用爱德士检测为阴性的血清，用本方法检测也为阴性。本申请和上述重组腺病毒配套使用，可以用来区分全病毒(包括疫苗毒和野毒)和重组腺病毒激发机体产生的抗体，为NS3抗体的快速检测具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例1中目的基因NS3的PCR扩增产物；其中，1：DNAMarker2000；2、3.：NS3基因；4：阴性对照；5：DNA Marker15000；
图2是本发明实施例1中原核表达载体pET32a-NS3-Intein-ELK16的双酶切鉴定图；其中，1：DNA Marker15000；2、3：pET32a-NS3-Intein-ELK16的双酶切产物；
图3是本发明实施例2中重组NS3重组蛋白的SDS-PAGE结果；其中，1：蛋白分子量标准；2：诱导前的菌体；3：诱导后的全菌；4：诱导切割后的上清；5：诱导切割后的沉淀；
图4本发明实施例2中重组NS3重组蛋白的Western blot分析结果图；其中，1：诱导后的pET32a；2：蛋白分子量标准；3：诱导前的全菌；4：诱导后的全菌；5：诱导切割后的上清；6：超声上清；7：诱导切割后的沉淀；
图5为本发明实施例3中抗原包被浓度和血清稀释倍数的结果比较图；
图6为本发明实施例3中酶标抗体稀释倍数的结果比较图；
图7为本发明实施例3中显色时间的结果比较图；
图8为本发明实施例3中间接ELISA的特异性试验结果图；
图9为本发明实施例3中间接ELISA方法检测血清的最低稀释倍数的结果比较图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在以下实施例中，涉及的材料、试剂如下：
1、相关菌株与质粒
菌株大肠杆菌DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司；Rosetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌表达载体pTXB1购自NEB公司；载体pET32a购自宝生物工程(大连)有限公司；
猪瘟病毒CSFV、繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)、猪病毒性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PPRV)、猪细小病毒(PordneParvovirus，PPV)以及重组腺病毒疫苗均由云南农业大学动物科学技术学院微生物实验室保存；
短肽ELK16-(LELELKLK)2，PT linker这三个序列均在专利公开号为：CN102226172B、名称为：“基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法”的专利文件中公开。
2、工具酶和试剂
LA Taq DNA聚合酶、dNTPs、Sma I限制性内切酶、Kpn I限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA分子量标准DL2000、DL15000均购自宝生物工程(大连)有限公司；IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)购自Merck公司，DTT(二硫苏糖醇)购自Amresco公司，异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠IgG的二抗(Anti-mouse-IgG-FITC)购自Sigma公司，96孔酶标板购自Thermo公司，脱脂乳购自BD公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体(rabbitanti-pig-IgG-HRP)购自Sigma公司，TMB显色液-ELISA HRP购自碧云天公司；质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，购自Omega公司；质粒大提试剂盒，购自Qiagen公司；Ni Sepharose树脂购自GE Healthcare公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Solarbia公司。
丙烯酰胺(SDS)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)购自Biotepped公司；蛋白低分子量标准购自Thermo公司；NC膜购自PALL公司；Trizol购自宝生物工程(大连)有限公司；无RNA酶水购自生工生物工程(上海)有限公司；Tris、Tween-20购自Amresco公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇、EDTA、SDS、NaCl、HCl、H2SO4、Na2CO3、NaHCO3其他生化试剂均为分析纯试剂。
3、主要溶液的配置
LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加800mL ddH2O，调节pH值至7.0，定容至1000mL，121℃，20min高压灭菌后4℃备用。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入终浓度为1.5％(W/V)的琼脂粉，121℃，20min高压灭菌后分装到无菌平皿内，凝固后4℃备用。
核酸胶：0.8％琼脂，乙二胺四乙酸(EB)；
75％乙醇：ddH2O，乙醇；
透析液：20mM Na3PO4·12H2O，0.5M NaCl，pH＝7.4；
SDS-PAGE：ddH2O，30％丙烯酰胺，1.5M Tris-HCl，pH＝8.8或1.0MTris-HCl，pH＝6.8，10％十二烷基硫酸钠，10％过硫酸铵，四甲基乙二胺；
SDS-PAGE电泳缓冲液：1.51％三羟甲基氨基甲烷，9.4％甘氨酸，0.5％十二烷基硫酸钠；
膜转移缓冲液：1.51％三羟甲基氨基甲烷，9.4％甘氨酸，0.5％十二烷基硫酸钠，4％乙醇；
4、主要仪器与设备
实施例1pET32a-NS3-Intein-ELK16表达质粒的构建
1、质粒pET32a-Intein-ELK16的构建
首先将含有Mycobacterium xenopi gyrA基因的Mxe Gy rA(载体中的Intein)内含肽的大肠杆菌表达载体pTXB1用EcoR I和Sma I双酶切获得MxeGy rA内含肽，酶切体系如下：
于30℃恒温水浴中酶切过夜。
再将氨基酸序列送往公司合成16个氨基酸的短肽ELK16-(LELELKLK)2和PT linker，即PTlinker-ELK16，然后将内含肽末端补平后，补平体系如下：
混匀后37℃作用3h后65℃作用5min。
与PTlinker-ELK16连接起来，酶切体系如下：
混匀后于16℃连接过夜。即将连接产物转化DH5α感受态细胞中，具体步骤见本实施例步骤3.5，构成pET32a-Intein-ELK16。
2、引物设计与合成
利用引物分析软件primer Premier5.0，根据GenBank上收录的CSFV全基因序列(GenBank登录号为：AY775178.2)中的NS3编码区序列设计一对引物N1、N2，在引物的两端分别添加Kpn I、Sma I酶切位点，可以扩增出2050bp的目的基因片段。引物序列分别为：
N1：5′-GTGGGTACCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′
N2：5′-AGCCCCGGGTAGACCAACTACTTGTTTTAG-3′(下划线处为插入的酶切位点)，上下游引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
3、重组质粒pET32a-NS3-Intein-ELK16的构建
3.1目的基因NS3的扩增
以本实验室保存的CSF毒种接生长状态良好的单层PK-15细胞，接毒60h后，收集细胞，提取RNA。
(1)取400μL细胞混合液于1.5mL无RNA酶的EP管中，加入600μL Trizol，颠倒混匀，冰上孵育5min。
(2)加入200μL氯仿，剧烈点动震荡30s混匀，冰上孵育5min，于4℃，12000rpm/min离心15min。
(3)小心吸取上清夜(500～600μL)加入到另一无RNA酶的EP管中，按上清液与异丙醇体积(1：1)的比例加入异丙醇，颠倒混匀，冰上孵育5min，于4℃，12000rpm/min离心10min。
(4)吸弃上清液，加入1mL75％乙醇(DEPC水无菌配制)，于4℃，9000rpm/min离心5min。
(5)吸弃上清液，倒置于超净工作台中吹干。
(6)用18μL DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水重悬沉淀，立即进行RT-PCR或置于-20℃冻存备用。
RT-PCR(cDNA合成)，采用一步法，20μL体系如下：
将加好的各种试剂混匀，然后瞬离，反应条件为：室温静置10min，42℃水浴60min，-20℃、2min。
以反转录产物为模板进行PCR扩增反应，50μL体系如下：
PCR反应条件
核酸电泳检测分析PCR结果：将PCR产物加入预先准备好的0.8％的琼脂糖凝胶中，120V电泳20min后，于凝胶成像分析系统中观察试验结果。
3.2、PCR产物的纯化回收
在紫外分析仪中切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，此时应尽量切除不含目的片段部分的凝胶，尽量减少凝胶体积。切下的含目的片段的琼脂糖凝胶装于1.5mL EP管中。切胶时不要将DNA长时间暴露在紫外灯下，以防止DNA被损坏。DNA琼脂糖凝胶回收步骤按照胶回收试剂盒操作说明书进行。计算切下的琼脂糖凝胶的重量，根据1g胶加入1mL XP2，加入相应体积的XP2。将加入有XP2的EP管置于55℃水浴锅中，水浴10min左右，每隔3min震荡几下，直至凝胶完全融化。将EP管取出，并将融化后的产物转移到结合柱中，室温，10000rpm/min离心1min，并弃去收集管内的液体，每次加入液体不超过700μL。往EP管中加入500μL XP2到结合柱中，室温，10000rpm/min离心1min，并弃去收集管内液体。往EP管中加入SPW wash buffer700μL，室温，10000rpm/min离心1min，并弃去收集管内液体，重复此操作一次。将EP管于室温，13000rpm/min离心2min，并将结合柱移至新的1.5mL EP管中，加入30μLddH2O，于室温静置5min后，室温，10000rpm/min离心1min，收集回收产物。
3.3、酶切处理目的片段NS3与质粒pET32a-Intein-ELK16
100μL酶切体系如下：
将加好的各种试剂混匀，然后瞬离，置于30℃恒温水浴中酶切过夜。然后按照之前3.2步骤回收酶切处理的片段和载体。
3.4、pET32a-NS3-Intein-ELK16的连接
10μL连接体系如下：
将加好的各种试剂混匀，然后瞬离，于连接仪中，22℃连接2h。
3.5、pET32a-NS3-Intein-ELK16连接产物的转化
取一支大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰水混合物上，待完全融化后，将10μL连接产物加入感受态细胞管中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴中热激90s后立即放在冰上作用3min，切勿晃动。加入800μL无抗LB液体培养基，于37℃，200rpm，振荡培养45min。室温，4000rpm，离心5min，弃部分上清，余100μL左右的上清重悬沉淀。取100μL混合物均匀涂布于含氨苄青霉素(Amp+、100μg/mL)的LB琼脂平板上，待液体完全吹干后，倒置平板于37℃恒温培养中培养过夜(12～16h)。
3.6、阳性重组质粒的筛选
取出LB平板，随机挑取生长于LB琼脂平板上的单个白色菌落，接种于装有5mL含Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基的无菌试管中，做好相应的标记，于37℃，200rpm倾斜振荡培养12～16h。
3.7、重组质粒的抽提及酶切鉴定
3.7.1抽提质粒
取出过夜培养的菌液，按照质粒DNA小量抽提试剂盒说明书提取质粒。取10个2mL灭菌的EP管，对应编号加入菌液2mL，室温，10000rpm/min离心1min，弃去上清，重复此操作一次。往EP管中各加入250μL Solution I，充分重悬菌体。往EP管中各加入250μL Solution Ⅱ，轻微颠倒几次后，室温静置作用2min，使菌体充分裂解。往EP管中各加入350μL SolutionⅢ，轻微颠倒几次后，室温，12000rpm/min离心10min。然后将离心后的上清转入结合柱内，并分别编号，室温，10000rpm/min离心1min，并弃去结合柱内的液体。往EP管中各加入500μL Buffer HB，室温，10000rpm/min离心1min，并弃去结合柱内的液体。往EP管中各加入750μL DNA wash buffer(注意检查是否加入酒精)，室温，10000rpm/min离心1min，并弃去结合柱内的液体。重复此操作一次。将各EP管于室温，13000rpm/min空离2min，并将结合柱转移至新的1.5mLEP管中，各加入30μL ddH2O，室温静置5min后离心，并用分光光度计测算所提取质粒的浓度，提取产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.7.2酶切鉴定
取上述抽提的质粒进行双酶切鉴定，使用Kpn I、Sma I两种限制性内切酶，20μL酶切体系如下：
将加好的各种试剂混匀，然后瞬离，置于30℃恒温水浴中酶切6h。取5μL酶切产物上样0.8％琼脂糖凝胶，120V电泳20min，在凝胶成像分析系统下观察酶切结果。
3.8、基因测序及序列分析
把经过酶切、PCR产生的片段大小与推测完全相符的阳性重组质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。然后用软件DNAstar进行序列的比较分析。将插入正确目的基因的重组原核表达载体命名为pET32a-NS3-Intein-ELK16，并保菌。
4、结果分析
4.1目的基因NS3的扩增
用设计的特异性引物N1、N2，进行PCR扩增，通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出了约2000bp的特异片段，如图1所示，与预期的目的基因片段2050bp大小相符。
4.2重组原核表达载体pET32a-NS3-Intein-ELK16的鉴定
将插入目的基因片段NS3的重组原核表达载体pET32a-NS3-Intein-ELK16用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切，结果得到了约为2000bp的NS3片段，与预期的大小2050bp一致，如图2所示。
4.3重组原核表达载体pET32a-NS3-Intein-ELK16序列测定
通过英潍捷基(上海)贸易有限公司测序结果证明目的基因NS3插入的位置、方向、大小和读码框均正确。
实施例2
1、NS3基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化
将鉴定为阳性的重组原核表达质粒pET32a-NS3-Intein-ELK16和空载体pET32a分别转化宿主表达菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，转化步骤同前转化DH5α。随机挑取单个菌落接种到5mL LB(Amp+、100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养12h～16h，再按1：100的比例将原菌液转接到10mLLB(Amp+、100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.6～0.8，各取出2mL菌液作为诱导前的阴性对照，然后分别加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于16℃，150rpm诱导表达过夜，收集菌液，进行SDS-PAGE和Western blot分析。
按1：100的比例将原菌液转接到含800mLLB(Amp+、100μg/mL)液体培养基的锥形瓶中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于16℃，150rpm诱导表达过夜。收集菌液，将菌液转移至离心管中，室温，8000rpm/min离心20min，弃去上清，收集菌体。用原菌液1/10～1/5体积的缓冲液Buffer B1(20mMTris-HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，PH8.5)重悬菌体，室温，8000rpm/min离心5min，洗去残余的培养基，弃去上清，再用原菌液1/10体积的缓冲液BufferB1重悬菌体，取1mL菌液做全菌对照，于冰上超声15min破碎细胞。超声后，4℃，10000rpm/min离心10min，弃去上清，收集沉淀。再用缓冲液Buffer B1清洗沉淀2遍，室温，8000rpm/min离心5min。然后用等体积的切割缓冲液Buffer B2(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，40mM DTT，PH8.5)充分重悬沉淀，置于4℃旋转混匀器中诱导切割24h。诱导切割后，4℃，10000rpm/min离心15min，收集上清，并取少量沉淀作为对照，进行SDS-PAGE和Western blot分析。
2、表达蛋白的鉴定
2.1、表达蛋白的SDS-PAGE检测
取收集的样品各100μL，然后分别加入25μL5×的Loading Buffer，混匀后沸水煮8～10min，然后冰浴3min，室温，12000rpm/min离心2min。
按照蛋白电泳装置的使用说明，安装好洗净吹干的玻璃板，按配方配制12％的分离胶，待各成分加入后迅速混匀并注入玻璃板间，然后在分离胶上层轻轻加入一层ddH2O以隔绝空气。待分离胶凝固后倒掉覆盖的水层，并用滤纸吸干剩余的水。然后按配方配制5％的浓缩胶，待各成分加入后迅速混匀并注入玻璃板间，小心插上1.5mm的梳子，防止气泡产生。待浓缩胶凝固后，小心拔下梳子。将凝胶固定在电泳装置上，加入足量的1×电泳缓冲液，在加样孔中分别加入处理好的20μL样品。样品在浓缩胶中电泳时，调节电压为稳压90V，待蛋白Marker完全分离开后，将电压调节为稳压120V，直至溴酚蓝到达凝胶底部，电泳结束。取出SDS-PAGE胶，切去上层的浓缩胶和含有溴酚蓝的分离胶，然后转至盛有考马斯亮蓝染液的容器中，置于水平摇床上室温染色1h。染色后取出凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液中，放在水平脱色摇床上室温脱色，其间更换脱色液3～4次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，将凝胶浸入ddH2O中终止脱色，观察记录跑胶结果。
2.2、表达蛋白的Western blot分析
将样品与标准蛋白分子量Marker在同一块凝胶上重复点样，一半凝胶用于染色对照，另一半凝胶用于转印做Western blot检测。取出SDS-PAGE胶，切去上层的浓缩胶和含有溴酚蓝的分离胶，转至盛有转膜液(含20％乙醇或则甲醇的电泳液)的容器中备用。然后剪下适当大小的滤纸2张和NC膜一张，并在盛有转膜液的容器中浸湿。从下往上依次放滤纸、NC膜、SDS-PAGE胶、滤纸，并小心赶去气泡。安装好转膜仪后，调节电压为15v，稳压转膜45min后，关闭转膜仪。取出NC膜，放在盛有PBS的容器中漂洗1次，然后放入预先配好的封闭液(5％脱脂乳+PBS)中，37℃封闭1.5～2h。取出NC膜，用PBS漂洗3次，每次置于水平摇床上洗5min。将NC膜转移至盛有10mL的抗His标签的小鼠单抗(Anti-His Antibody)(用灭菌的PBS稀释2000倍)的容器中，于水平摇床上室温孵育2h。取出NC膜，用PBST漂洗3次，每次置于水平摇床上洗5min，再用PBS漂洗3次，每次置于水平摇床上洗5min，然后转移到盛有10mL异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠IgG的二抗(Anti-mouse-IgG-FITC)(用灭菌的PBS稀释10000倍)的容器中，于水平摇床上室温孵育约50min。用PBST漂洗3次，每次置于水平摇床上洗5min，再用PBS漂洗3次，每次置于水平摇床上洗5min，然后将NC膜保存于PBS中，于扫膜仪中观察试验结果。
2.3、蛋白浓度的测定
将收集的裂解上清移入超滤管中，4℃，3000～3500g离心，浓缩约4倍体积。再将超滤上清移入到透析袋中，置于盛满PBS的容器中透析过夜，期间更换透析液，以去除DTT的影响，再将透析后的蛋白分装保存，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
工作液的配制：根据样品和标准品的数量，将BCA试剂和Cu试剂按体积比(50：1)配制成工作液，并充分混匀。标准品稀释：取适量5mg/mL的BSA蛋白标准品，用PBS稀释10倍，使其终浓度为0.5mg/mL。将稀释好的标准品按0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、12μL、16μL和20μL体积加入到8联孔中，每个浓度做两个平行，不足20μL的孔，用PBS补足。将样品做适当倍数的稀释后，加入20μL于8联孔中，每个浓度做两个平行。每孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30min后取出。酶标仪读数，测A562的吸光值，并绘制标准曲线，计算所测定的蛋白浓度。
2.4纯化与未纯化蛋白的反应性比较
将纯化和未纯化的NS3重组蛋白(400μg/mL)作40倍稀释，分别用碳酸盐缓冲液包被于ELISA板中，100μL/孔，并标记为纯化NS3和未纯化NS3，于4℃冰箱内包被过夜。取出包被的ELISA板，弃去板中液体，用PBST洗3次，拍干。加入预先配制好的封闭液(5％脱脂乳的PBS)，200μL/孔，于37℃温箱内封闭1h。取出ELISA板，弃去板中液体，用PBST洗3次，拍干。加入预先稀释好的猪瘟NS3抗体阴性和阳性血清若干(作100倍稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h。取出ELISA板，弃去板中液体，用PBST洗5次，拍干。加入预先稀释好的辣根过氧化酶标记的兔抗猪的二抗(作5000被稀释)，100μL/孔，37℃孵育50min。取出ELISA板，弃去板中液体，用PBST洗5次，拍干。加入TMB显色液，100μL/孔，室温避光显色30min。加入2M的H2SO4，100μL/孔，终止反应。酶标仪读数，测OD450nm的吸光值，用Excel处理试验结果。
3、结果分析
3.1重组NS3重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析
将鉴定为阳性的重组原核表达质粒pET32a-NS3-Intein-ELK16和空载体pET32a分别转化宿主表达菌Rosetta(DE3)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG于16℃诱导表达。收集菌体，超声破碎细胞后，收集沉淀，用切割缓冲液BufferB2充分重悬沉淀，于4℃诱导切割24h，离心收集上清。电泳结束后，经染色和脱色，发现100KD左右的位置，诱导的重组全菌比未经诱导的重组菌明显多出1条表达条带，分子质量与融合蛋白的理论值100KD大小相符；在约75KD的位置，裂解上清有一条表达条带，分子量与融合蛋白的理论值75KD大小相符，如图3所示。
3.2、重组NS3重组蛋白的Western blot分析
用抗His标签的单抗对诱导表达产物及诱导裂解切割产物进行Western blot检测，结果表明经诱导的重组菌，在100KD处出现1条明显的条带，而阴性未诱导对照和诱导的空载体均无此特异性反应，通过诱导切割裂解后，在75KD处出现1条特异性的条带，如图4所示。
实施例3
1、间接ELISA检测CSFV NS3抗体方法的建立
1.1、间接ELISA操作程序
(1)包被：用碳酸盐缓冲液将抗原—NS3重组蛋白包被于ELISA板，100μL/孔，先放在振荡器上混匀后放入4℃冰箱内包被过夜。
(2)洗板：用PBST洗3次，拍干。
(3)封闭：用含5％脱脂乳的PBS封闭，200μL/孔，于37℃作用1h。
(4)洗板：用PBST洗3次，拍干。
(5)加入待检血清，用PBSTM(含5％脱脂乳的PBST)稀释，100μL/孔，同时设空白对照，于37℃作用1h。
(6)洗板：用PBST洗5次，拍干。
(7)加入辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗(rabbit anti-pig-IgG-HRP)，100μL/孔，于37℃作用50min。
(8)洗板：用PBST洗5次，拍干。
(9)显色：加入TMB显色液-ELISA HRP，100μL/孔，于室温避光作用30min。
(10)终止：加入终止液(2M H2SO4)，100μL/孔，测定OD450nm值。
1.2、棋盘法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数
根据棋盘滴定的方法，ELISA板的横向包被7个不同浓度纯化的NS3重组蛋白(0.3125μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)，100μL/孔，每个稀释度做两个孔的重复，于4℃包被过夜。取出包被的ELISA板，弃去液体，用PBST洗3次，拍干。加入预先配好的封闭液，200μL/孔，37℃封闭1h。取出ELISA板，弃去液体，用PBST洗3次，拍干。加入预先稀释好的猪瘟NS3抗体阴性和阳性血清，ELISA板的纵向为5个稀释度(25倍、50倍、100倍、200倍、400倍)，100μL/孔，每个稀释度做两个孔的重复，37℃孵育1h。其它步骤与步骤1.1相同，用Excel分析试验结果，通过OD450nm值和P/N值确定最佳抗原包被浓度和一抗稀释度。
1.3、酶标抗体的最佳稀释倍数
按照确定好的抗原包被浓度(2.5μg/mL)包被于ELISA板，100μL/孔，4℃包被过夜。取出包被的ELISA板，弃去液体，用PBST洗3次，拍干。加入预先配好的封闭液，200μL/孔，37℃封闭1h。取出ELISA板，弃去液体，用PBST洗3次，拍干。加入预先稀释好的猪瘟NS3抗体阴性和阳性血清(稀释100倍)，100μL/孔，37℃孵育1h。取出ELISA板，弃去液体，用PBST洗5次，拍干。用PBSTM将辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体(rabbitanti-pig-IgG-HRP)做1250倍、2500倍、5000倍、10000倍、20000倍、40000倍、80000倍几个不同的稀释度，100μL/孔，每个稀释度做两个孔的重复，37℃孵育50min。其它步骤同步骤1.1，用Excel分析试验结果，通过OD450nm值和P/N值确定最佳的酶标抗体稀释度。
1.4、显色时间的确定
按照确定好的抗原包被浓度(2.5μg/mL)、血清稀释倍数(稀释100倍)和酶标抗体稀释倍数(稀释5000倍)进行操作，分别在显色后10min、20min、30min、45min、60min这5个不同的时间点加入终止液终止显色，每个显色时间做两个孔的重复，其它步骤同步骤1.1，用Excel分析试验结果，通过OD450nm值和P/N值确定最佳的显色时间。
1.5、cutoff值的确定
按照之前确定好的最佳反应条件进行ELISA检测，选取200份检测为CSFVNS3抗体阴性的血清，将其稀释100倍，测定其OD450nm值，并计算其平均值X和标准差S。经统计学分析，OD450nm≥X+3S时，可以在99.9％的水平上判定为阳性，OD450nm≤X+3S者为阴性，介于两者之间者判为可疑。
2、间接ELISA检测方法的性能评价
2.1、间接ELISA的特异性试验
用建立的间接ELISA检测方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus type2，PCV2)、猪病毒性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PPRV)、猪细小病毒(Pordne Parvovirus，PPV)，每种血清做两个孔的重复，同时设立CSFV阴、阳性血清和空白对照，对该方法的特异性进行分析验证。
2.2、间接ELISA的敏感性试验
按照建立的间接ELISA检测方法，将4份CSFV NS3抗体为阳性的血清和2份阴性血清分别做1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600几个不同的稀释倍数，测定所建立方法对血清最低稀释度的要求。
2.3、间接ELISA的重复性试验
按照建立的间接ELISA检测方法，用同一批次和不同批次纯化的重组NS3重组蛋白包被酶标反应板，对4份阳性血清，2份阴性血清共6份样品进行3次批内重复性试验及3次批间重复性试验，测定OD450nm值，计算每份血清OD450nm值的平均值X和标准差S，以确定批内重复性试验及批间重复性试验的变异系数(CV％)。
2.4、临床样品的检测
按照本试验建立的间接ELISA检测方法，对502份血清进行检测并计算阳性检出率。
3、结果分析
3.1、间接ELISA反应条件的优化
3.1.1、棋盘法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数
根据棋盘滴定的方法，通过OD450nm值和P/N值确定最佳抗原包被浓度为2.5μg/mL，最佳血清稀释倍数为100倍，如图5所示。
3.1.2、酶标抗体的最佳稀释倍数
按照确定好的抗原包被浓度(2.5μg/mL)、血清稀释倍数(稀释100倍)进行ELISA反应，通过OD450nm值和P/N值确定最佳的酶标抗体稀释倍数为5000倍，如图6所示。
3.1.3、最佳显色时间的确定
按照确定好的抗原包被浓度(2.5μg/mL)、血清稀释倍数(稀释100倍)和酶标抗体稀释倍数(稀释5000倍)进行ELISA反应，通过OD450nm值和P/N值确定最佳的显色时间为30min，如图7所示。
3.1.4、cutoff值的确定
按照之前确定好的最佳反应条件进行ELISA检测，共检测200份检测为CSFV NS3抗体阴性的血清，测定其OD450nm值。并计算其平均值X＝0.175，标准差S＝0.057。经统计学分析，cutoff值＝X+3S＝0.175+0.057×3＝0.346。当OD450nm>0.346时，检测结果判定为阳性；当OD450nm<0.346时，检测结果判定为阴性。
3.2、间接ELISA检测方法的性能评价
3.2.1、间接ELISA的特异性试验
由于不同的抗原之间可能存在交叉反应的可能，用建立的间接ELISA检测方法检测PRRSV、PCV2、PEDV、PPRV、PPV抗体阳性血清，同时设立CSFV阴、阳性血清对照。试验表明，该方法有良好的特异性，与常见的猪病毒病血清没有交叉反应，如图8所示。
3.2.2、间接ELISA的敏感性试验
按照建立的间接ELISA检测方法，将4份CSFV NS3抗体为阳性的血清和2份阴性血清分别做1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：600几个不同的稀释倍数。试验表明，测定所建立方法对血清最低稀释度的要求，如图9所示。
3.2.3、间接ELISA的重复性试验
按照建立的间接ELISA检测方法，用同一批次和不同批次纯化的重组NS3蛋白包被酶标反应板，对4份阳性血清，2份阴性血清共6份样品进行3次批内重复性试验及3次批间重复性试验。试验表明，批内重复试验的变异系数均值为3.08％，批间重复试验的变异系数均值为5.10％，重复性良好，如下表1和表2所示：
表1间接ELISA的批内重复性试验结果
表2间接ELISA的批间重复性试验结果
3.3、临床样品的检测
按照本试验建立的间接ELISA检测方法进行检测，对502份血清进行检测并计算阳性检出率。
对包括现地血清(野毒感染)、试验C株免疫和腺病毒重组疫苗(rAd-E0-E2)免疫血清的共计502份血清进行检测，检测结果同IDEXX试剂盒的结果进行统计比较，并计算其符合率。结果表明，现地血清(野毒感染)、试验C株免疫血清共264份，若以IDEXX方法为标准，则本方法的特异性为96.9％，敏感性为89.7％。本方法与IDEXX的符合率为95.8％如表3所示。腺病毒重组疫苗(rAd-E0-E2)免疫血清共238份，经IDEXX试剂盒检测出阳性血清220份，再用间接ELISA方法同时检测这些阳性血清，发现仅有18份检测结果为阳性，其余均为阴性，由于腺病毒重组疫苗(rAd-E0-E2)中不含有猪瘟NS3基因，不会产生针对NS3的抗体，故此结果与理论相符。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明构建了一个杆状病毒表达系统表达NS3重组蛋白并验证其反应性，结果表明真核表达的蛋白的反应性和“无柱纯化”的蛋白反应性相似，均能有效地区分NS3抗体检测为阳性和阴性的血清，但杆状病毒表达目的蛋白需要在细胞上进行操作，整个过程耗时较长，使用His树脂花费较大，纯化蛋白量小，不能规模化生产。本发明利用一种自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法来纯化目的蛋白具有很好的反应性，而且花费小、操作流程简单、能够规模化生产，并且和一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒配套使用，可以用来区分全病毒(包括疫苗毒和野毒)和重组腺病毒激发机体产生的抗体，为NS3抗体的快速检测具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组猪瘟病毒NS3蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)根据GenBank登录号为AY775178.2的CSFV全基因序列中的NS3编码区序列设计一对引物N1、N2：
N1：5′-GTGGGTACCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′
N2：5′-AGCCCCGGGTAGACCAACTACTTGTTTTAG-3′；
(2)用引物N1、N2对CSFV的cDNA进行PCR扩增，得到NS3目的片段；
(3)用Kpn I、Sma I双酶切NS3片段和质粒pET32a-Intein-ELK16，回收、连接，得到pET32a-NS3-Intein-ELK16表达载体；
(4)将所述pET32a-NS3-Intein-ELK16表达载体表达的重组蛋白在诱导切割离心后，收集上清得到重组猪瘟病毒NS3蛋白。
3.如权利要求2所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述质粒pET32a-Intein-ELK16的制备方法包括以下步骤：
将含有Mycobacterium xenopi gyrA基因的Mxe Gy rA(载体中的Intein)内含肽的大肠杆菌表达载体pTXB1用EcoR I和Sma I双酶切获得Mxe Gy rA内含肽；
合成具有16个氨基酸的短肽ELK16-(LELELKLK)2和PT linker，即PTlinker-ELK16，然后将内含肽末端补平后与PTlinker-ELK16连接起来，再将其克隆到pET32a中，构成pET32a-Intein-ELK16；其中，所述短肽ELK16-(LELELKLK)2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PT linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求3所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述诱导切割离心包括以下步骤：将目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白进行融合表达，含有内含肽和自聚集短肽的重组蛋白是以聚集体的形式存在，将表达上述融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心后获得沉淀；然后利用诱导缓冲液在诱导切割位点处的诱导切割，诱导切割位点断裂将目的蛋白从聚集体释放到溶液中，通过离心达到纯化的目的。
5.一种ELISA试剂盒，其特征在于，包括ELISA板、碳酸盐缓冲液、PBST缓冲液、含5％脱脂乳的PBST缓冲液、辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗、显色液以及终止液；所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白。
6.如权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB显色液，所述终止液为浓度为2M的H2SO4。
7.权利要求5或6所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用。
8.如权利要求7所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白用碳酸盐缓冲液包被于ELISA板混匀，100μL/孔，于4℃包被过夜后，依次进行洗板、封闭和洗板处理；
(2)加入待检血清，用含5％脱脂乳的PBST稀释，100μL/孔，同时设空白对照，于37℃作用1h后，进行洗板处理；
(3)加入辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗，100μL/孔，于37℃作用50min后，进行洗板处理；
(4)加入TMB显色液，100μL/孔，于室温避光作用30min后，加入终止液，100μL/孔，测定OD450nm值。
9.如权利要求8所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述洗板为用PBST洗3次，拍干；所述封闭为用含5％脱脂乳的PBS封闭，200μL/孔，于37℃作用1h；
在步骤(2)和(3)中，所述洗板为用PBST洗5次，拍干。
10.如权利要求9所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述待测血清包含猪瘟病毒或重组腺病毒；其中，所述猪瘟病毒包括疫苗毒和野毒，所述重组腺病毒仅包括猪瘟病毒E0和E2基因。
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