CN104650185A - 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 - Google Patents
一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104650185A CN104650185A CN201510078013.5A CN201510078013A CN104650185A CN 104650185 A CN104650185 A CN 104650185A CN 201510078013 A CN201510078013 A CN 201510078013A CN 104650185 A CN104650185 A CN 104650185A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- protein
- swine fever
- peptide sequence
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明主要涉及猪瘟病毒E0结合多肽及其应用,该多肽序列为WRYDQ,是一种线性结合多肽,以多肽序列为核心,可以对此多肽序列的延长和修饰,修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定蛋白质。本发明借助噬菌体肽库筛选技术,利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选,最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株;挑选其克隆株进行序列测定,其多肽的核心序列为WRYDQ;人工合此多肽进行ELISA结合实验,结果证明此合成多肽能与猪瘟病毒E0蛋白很好的结合;本发明较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便,更易操作;通过对多肽进行标记,可快速地对猪瘟E0蛋白进行定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域,主要涉及猪瘟病毒E0结合多肽及其应用。
背景技术
猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV) E0糖蛋白既是包膜蛋白,又是一种核酸酶,其活性对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系。在CSFV编码的蛋白中,囊膜蛋白E0和E2研究的最为清楚,因为这两个蛋白均位于病毒粒子的表面,对于一个有囊膜的病毒来说,镶嵌在囊膜中的糖蛋白对于病毒识别、吸附并进入宿主细胞是十分重要的。EO糖蛋白从病毒基因组ORF上第268个氨基酸开始到第494个氨基酸为止,共227个氨基酸,其甲基化程度很高,分子量为44-48Kda,依靠二硫键的连接二聚体的形式存在,分子量为97KD。真核细胞上普遍存在着可与E0结合的细胞受体,E0与细胞的结合为不可逆过程。
噬菌体展示技术是当前研究多肽与蛋白质作用的一种有效手段。这一技术将多肽的编码序列克隆到噬菌体壳蛋白的合适位置,并且要保证其正确的翻译序列,也不影响噬菌体壳蛋白的正常功能,这样噬菌体表达的壳蛋白结构中将会存在外源多肽的序列;伴随着噬菌体子代的重新组装,外源多肽序列将展示在噬菌体的表面。在一般情况下,外源展示的多肽具备一定的空间结构和生物活性,可以与相应的靶分子进行结合。展示肽库与靶蛋白分子结合后,洗去未结合的噬菌体,然后将与靶分子结合的噬菌体洗脱下来感染细胞扩增,经过3轮到6轮的“吸附-洗脱-扩增”,噬菌体与靶分子的结合特异性将逐步提高;经过多次筛选之后,最终可以筛选到与靶分子相结合的高亲和噬菌体。
发明内容
本发明借助噬菌体肽库展示技术,利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选,最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株,挑选其克隆株进行序列测定,其多肽序列为WRYDQ;人工合成此多肽进行ELISA结合实验,结果证明,人工合成的多肽可与猪瘟病毒E0蛋白有良好的结合能力。借助本发明的多肽,可用于对猪瘟抗原进行定量和定性的检测。
本发明的技术方案:
一条可与猪瘟病毒E0蛋白结合的多肽序列为WRYDQ。
所述多肽序列为线性结合多肽。
所述的多肽序列中,包括以所述的多肽序列为核心,任何对此多肽序列的延长和修饰,修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
将所述多肽序列用于猪瘟的抗原检测,其中包括但不局限于酶联免疫反应检测。
所述的多肽序列在用于对猪瘟抗原进行定量和定性检测中的应用。
本发明的积极有益效果:
(1)本发明借助噬菌体肽库筛选技术,利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选,最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株。挑选其克隆株进行序列测定,其多肽的核心序列为WRYDQ;人工合此多肽进行ELISA结合实验,结果证明,此人工合成的多肽可与猪瘟病毒E0蛋白有很好的结合;其亲和力可达5.54′109L/mol。
(2)由于病毒难以纯化,因此针对病毒的抗体获得非常不易,本发明设计合成的多肽很好地规避了这一难题,可进行人工合成方法快速取得,检测成本也非常低廉。
(3)本发明的人工合成多肽与人工接种CSFV、人工表达CSFV E0蛋白均可以结合,而且与其它病毒蛋白均不反应,特异性较高。
(4)本方法较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便,更易操作;通过对多肽进行标记,可快速地对猪瘟E0蛋白进行定性和定量检测。
附图说明
图1:利用多肽测定培养猪瘟病毒、表达蛋白的结果。
图中横坐标上,1为猪瘟病毒接种PK15细胞,2为表达猪瘟病毒E0蛋白,3 为PK15细胞对照;纵坐标为OD值。
图2:利用本发明的多肽与其它病毒交叉反应的结果。
图中横坐标为不同包被ELISA板细胞培养物的病毒各类;纵坐标为OD值。
具体实施方式
实例1 噬菌体随机肽库的筛选
用纯化表达的CSFV E0蛋白包被聚氯乙烯板,每孔100μl(100μl /ml)包被,置于4℃条件下过夜,用PBST洗涤后再用5%的BSA液封闭。
将稀释后的噬菌体肽库100μl加入到相应的孔中,室温条件下孵肓2h,用TBST液冲洗8-10次,每孔加入洗脱液200μl,室温条件下振荡5-8min,吸出洗脱液并中和至中性。
中和后的洗脱液可以用于滴度测定和下一轮培养;将LB培养后的噬菌体进行离心收集,用于下一轮的筛选。
不同筛选轮次的噬菌体富集鉴定见表1,洗脱液的滴度测定结果见表2。
表1 每轮亲和筛选中噬菌体的量
表2 每轮亲和筛选洗脱液的滴度测定
实例2 筛选多肽的鉴定
(1)将接种的猪瘟病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎,然后以2μg/ml(蛋白量计)进行ELISA板包被;以同样方式将人工表达的猪瘟病毒E0蛋白和未接种病毒的PK15做为对照进行包被。在进行特异性试验时,将不同病毒蛋白进行包被。
(2)将人工合成多肽WRYDQ偶联辣根过氧化物酶,以100ng/ml的量,每孔加入到上述ELISA板中50μl,震荡器上混匀,37℃条件下避光孵育30min;
(3)用酶标板洗板机洗6次,或手工甩掉酶标板孔中的液体,用稀释后的缓冲液加满各孔,再甩干,如此重复洗涤6次;
(4)根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中,每孔加100μl,在酶标板震荡器上震荡30秒,室温(23±3℃)10分钟充分显色;
(5)每孔加入50μl 2M 的硫酸液终止反应,在酶标板震荡器上震荡30秒,然后用酶标仪读取各孔在450纳米处的吸光值,判定结果。
结果表明,人工合成多肽与人工接种CSFV、人工表达CSFV E0蛋白均可以结合(见图1),而且与其它病毒蛋白均不反应,其特异性较高(见图2)。
实例3 筛选多肽的亲和力鉴定
(1)将接种的猪瘟病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎,然后以2μg/ml(蛋白量计)进行ELISA板包被;以同样方式将人工表达的猪瘟病毒E0蛋白和未接种病毒的PK15做为对照进行包被。在进行特异性试验时,将不同病毒蛋白进行包被。
(2)将人工合成多肽WRYDQ偶联辣根过氧化物酶,不同浓度的酶标记多肽加入到上述ELISA板中50μl,震荡器上混匀,37℃条件下避光孵育30min;
(3)用酶标板洗板机洗6次,或手工甩掉酶标板孔中的液体,用稀释后的缓冲液加满各孔,再甩干,如此重复洗涤6次;
(4)根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中,每孔加100μl,在酶标板震荡器上震荡30秒,室温(23±3℃)10分钟充分显色;
(5)每孔加入50μl 2M 的硫酸液终止反应,在酶标板震荡器上震荡30秒,然后用酶标仪读取各孔在450纳米处的吸光值,判定结果。
最终利用Scatchard方程分析,不同加入酶标多肽的浓度来计算多肽与病毒的亲和力常数,其中Ka=[结合物]/[抗原][多肽],(其中[结合物]是指多肽与抗原相结合的浓度,[抗原]是指抗原浓度,[多肽]是指未结合的多肽浓度)。通过计算可知本发明多肽与E2蛋白的亲和力常数可达5.54×109L/mol,说明其亲和力比较好。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 一条与猪瘟E0蛋白相结合的多肽序列及其应用
<130> 酶联免疫反应
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Arg Tyr Asp Gln
1 5
Claims (5)
1. 一条可与猪瘟病毒E0蛋白结合的多肽序列,其特征是,所述多肽序列为WRYDQ。
2. 根据权利要求1所述的多肽序列,其特征是,所述多肽序列为线性结合多肽。
3. 根据权利要求1所述的多肽序列,其特征是,其中包括以所述的多肽序列为核心,任何对此多肽序列的延长和修饰,修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
4. 根据权利要求1所述的多肽序列,其特征是,将所述多肽序列用于猪瘟的抗原检测,其中包括但不局限于酶联免疫反应检测。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的多肽序列在用于对猪瘟抗原进行定量和定性检测中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510078013.5A CN104650185B (zh) | 2015-02-14 | 2015-02-14 | 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510078013.5A CN104650185B (zh) | 2015-02-14 | 2015-02-14 | 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104650185A true CN104650185A (zh) | 2015-05-27 |
CN104650185B CN104650185B (zh) | 2017-11-10 |
Family
ID=53241869
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510078013.5A Active CN104650185B (zh) | 2015-02-14 | 2015-02-14 | 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104650185B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085621A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-11-25 | 郑州大学 | 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 |
CN106749519A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-05-31 | 河南省农业科学院 | 基于计算机模拟的csfve2蛋白靶向结合的肽配基序列设计及应用 |
CN106749520A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-05-31 | 河南省农业科学院 | 针对猪瘟病毒e2蛋白高亲和性多肽序列的设计及应用 |
CN107353324A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-11-17 | 河南牧业经济学院 | 与禽白血病病毒p27蛋白相结合的多肽及其应用 |
CN105085621B (zh) * | 2015-08-14 | 2018-08-31 | 郑州大学 | 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 |
CN112625091A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-09 | 河南中泽生物工程有限公司 | 一条结合猪瘟病毒Erns蛋白的多肽序列及应用 |
CN112707948A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-27 | 河南中泽生物工程有限公司 | 一条结合猪瘟病毒e0蛋白的多肽序列及应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104098658A (zh) * | 2014-07-07 | 2014-10-15 | 云南农业大学 | 一种重组猪瘟病毒ns3蛋白、elisa试剂盒及其应用 |
-
2015
- 2015-02-14 CN CN201510078013.5A patent/CN104650185B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104098658A (zh) * | 2014-07-07 | 2014-10-15 | 云南农业大学 | 一种重组猪瘟病毒ns3蛋白、elisa试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
F. ZHANG ET AL: "Characterization of epitopes for neutralizing monoclonal antibodies to classical swine fever virus E2 and Erns using phage-displayed random peptide library", 《ARCHIVES OF VIROLOGY》 * |
LONG YIN ET AL: "Specific ligands forclassical swine fever virus screened from landscape phage display library", 《ANTIVIRAL RESEARCH》 * |
XUEWU LI ET AL: "Identification of host cell binding peptide from an overlapping peptide library for inhibition of classical swine fever virus infection", 《VIRUS GENES》 * |
张富强等: "猪瘟病毒糖蛋白Erns中和表位的鉴定和比较", 《微生物学报》 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085621A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-11-25 | 郑州大学 | 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 |
CN105085621B (zh) * | 2015-08-14 | 2018-08-31 | 郑州大学 | 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 |
CN106749519A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-05-31 | 河南省农业科学院 | 基于计算机模拟的csfve2蛋白靶向结合的肽配基序列设计及应用 |
CN106749520A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-05-31 | 河南省农业科学院 | 针对猪瘟病毒e2蛋白高亲和性多肽序列的设计及应用 |
CN106749519B (zh) * | 2016-11-15 | 2020-04-07 | 河南省农业科学院 | 基于计算机模拟的csfv e2蛋白靶向结合的肽配基序列设计及应用 |
CN106749520B (zh) * | 2016-11-15 | 2020-04-14 | 河南省农业科学院 | 针对猪瘟病毒e2蛋白高亲和性多肽序列的设计及应用 |
CN107353324A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-11-17 | 河南牧业经济学院 | 与禽白血病病毒p27蛋白相结合的多肽及其应用 |
CN107353324B (zh) * | 2017-07-05 | 2020-05-15 | 河南牧业经济学院 | 与禽白血病病毒p27蛋白相结合的多肽及其应用 |
CN112625091A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-09 | 河南中泽生物工程有限公司 | 一条结合猪瘟病毒Erns蛋白的多肽序列及应用 |
CN112707948A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-27 | 河南中泽生物工程有限公司 | 一条结合猪瘟病毒e0蛋白的多肽序列及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104650185B (zh) | 2017-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104650185A (zh) | 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 | |
CN107344968B (zh) | 一种用于检测禽流感病毒h7n9的时间分辨荧光免疫分析方法 | |
CN108473540B (zh) | 突变的hev多肽及其用于测定抗hev抗体的用途 | |
CN104007261A (zh) | 禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒及应用 | |
Pohanka et al. | Diagnosis of tularemia using piezoelectric biosensor technology | |
CN108761076A (zh) | 乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用 | |
CN106279378B (zh) | 水痘带状疱疹病毒gE抗原及其在检测抗水痘带状疱疹病毒抗体中的用途 | |
CN105542014A (zh) | Tp重组抗原及其制备方法和应用 | |
CN104597256B (zh) | 一条与牛病毒性腹泻病毒e2蛋白相结合的多肽序列及其应用 | |
CN101085812B (zh) | 一种sars冠状病毒多肽抗原及其应用 | |
JPWO2013018836A1 (ja) | 生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法、当該方法に使用するための剤 | |
CN104198736A (zh) | 高效活性表达的鸭坦布苏病毒e蛋白核心抗原域蛋白的用途 | |
CN104610443B (zh) | 一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途 | |
CN102033057A (zh) | 基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法 | |
CN105968205B (zh) | 一种抗前列腺特异性膜抗原的纳米抗体 | |
CN104808001A (zh) | 血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法及检测试剂盒 | |
CN107664694B (zh) | 一种基于e2蛋白检测猪非典型瘟病毒抗体的elisa试剂盒 | |
CN109679970A (zh) | 猫疱疹i型病毒快速检测的制备方法 | |
CN105315346B (zh) | 可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇的多肽分子及其应用 | |
CN104804070B (zh) | 可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其应用 | |
CN114773460A (zh) | 靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体及其应用 | |
CN103834667A (zh) | 化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用 | |
Wang et al. | Data for peptide-binding assay with oriented immobilization of GRP78 in Biacore | |
CN101186644B (zh) | H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位及其应用 | |
CN105085621A (zh) | 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |