CN105085621B - 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明主要涉及乙脑病毒E蛋白结合多肽及其应用，该多肽序列为HRHHV，是一种线性结合多肽，以多肽序列为核心，可以对此多肽序列进行延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定蛋白质。本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的乙脑E蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合乙脑E蛋白的多肽克隆株；挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序列为HRHHV；人工合成此多肽进行ELISA结合实验，结果证明此合成多肽能与乙脑病毒E蛋白很好的结合；本发明较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地对乙脑E蛋白进行定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，主要涉及一种乙脑病毒E蛋白相结合的多肽及其应用。
背景技术
流行性乙型脑炎病毒简称乙脑病毒，它是流行性乙型脑炎的病原体。该病毒为单链RNA，外层具包膜，包膜表面有血凝素。幼猪是乙脑病毒的主要传染源和中间宿主，蚊子是乙脑病毒的传播媒介。当人受带病毒的蚊子叮咬后，乙脑病毒进入人体，在血管内皮细胞、淋巴结、肝、脾等吞噬细胞内增殖，并经血液循环到达脑部而引起炎症。病毒核心部分有核心蛋白C和RNA组成，外膜部分中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白M，向表面突起，具有血凝素活性。E蛋白是病毒主要抗原成分，它具有特异性的中和及血凝功能抗原的决定簇，M和C蛋白虽然也有抗原性，但在致病机制方面所起的作用不大。
噬菌体展示技术是当前研究多肽与蛋白质作用的一种有效手段。这一技术将多肽的编码序列克隆到噬菌体壳蛋白的合适位置，并且要保证其正确的翻译序列，也不影响噬菌体壳蛋白的正常功能，这样噬菌体表达的壳蛋白结构中将会存在外源多肽的序列；伴随着噬菌体子代的重新组装，外源多肽序列将展示在噬菌体的表面。在一般情况下，外源展示的多肽具备一定的空间结构和生物活性，可以与相应的靶分子进行结合。展示肽库与靶蛋白分子结合后，洗去未结合的噬菌体，然后将与靶分子结合的噬菌体洗脱下来感染细胞扩增，经过3轮到6轮的“吸附-洗脱-扩增”，噬菌体与靶分子的结合特异性将逐步提高；经过多次筛选之后，最终可以筛选到与靶分子相结合的高亲和噬菌体。
发明内容
本发明借助噬菌体肽库展示技术，利用表达纯化的乙脑E蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合乙脑E蛋白的多肽克隆株，挑选其克隆株进行序列测定，其多肽序列为HRHHV；人工合成此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，人工合成的多肽与乙脑病毒E蛋白有良好的结合能力。借助本发明的多肽，可用于对乙脑抗原进行定量和定性的检测。
本发明的技术方案：
一条可与乙脑病毒E蛋白结合的多肽，所述多肽的氨基酸序列为HRHHV。
所述多肽为线性结合多肽。
编码权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。
以所述的多肽为核心，任何对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
将所述多肽用于乙脑的抗原检测，其中包括但不局限于酶联免疫反应和放射免疫测定及其形成的免疫学试纸检测、western blot检测、ELISA检测等检测方法及产品。
所述的多肽在用于对乙脑抗原进行定量和定性检测中的应用。
本发明的积极有益效果：
（1）本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的乙脑E蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合乙脑E蛋白的多肽克隆株。挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序列为HRHHV；人工合此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，此人工合成的多肽可与乙脑病毒E蛋白有很好的结合；其亲和力可达4.96×109L/mol。
（2）由于病毒难以纯化，因此针对病毒的抗体获得非常不易，本发明设计合成的多肽很好地规避了这一难题，可利用人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。
（3）本发明的人工合成多肽与人工接种JEV、人工表达JEV E蛋白均可以结合，而且与其它病毒蛋白均不反应，特异性较高。
（4）本方法较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地对乙脑E蛋白进行定性和定量检测。
附图说明
图1：利用多肽测定培养乙脑病毒、表达蛋白的结果。
图中横坐标上，1为乙脑病毒接种PK15细胞，2为表达乙脑病毒E蛋白，3 为PK15细胞对照；纵坐标为OD值。
图2：利用本发明的多肽与其它病毒交叉反应的结果。
图中横坐标为不同包被ELISA板细胞培养物的各类病毒；纵坐标为OD值。
图3利用本发明多肽测定JEV E蛋白的标准曲线。
具体实施方式
实例1 噬菌体随机肽库的筛选
用纯化表达的乙脑病毒E蛋白（JEV E蛋白）包被聚氯乙烯板，每孔100μl（100μl /ml）包被，置于4℃条件下过夜，用PBST洗涤后再用5%的BSA液封闭；
将稀释后的噬菌体肽库100μl（约含噬菌体 2×1011pfu））加入到相应的孔中，室温条件下孵肓2h，用TBST液冲洗8-10次，每孔加入洗脱液200μl（TBST 缓冲液，含 50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.2%的 Tween-20），室温条件下振荡5-8min，吸出洗脱液并中和至中性；
中和后的洗脱液可以用于滴度测定和下一轮培养（在 LB-Tet 培养基上挑取单菌落于 5~10mL 的 LB 培养液中，37℃震荡培养至对数期（OD600=0.5））；将LB培养后的噬菌体进行离心收集，用于下一轮的筛选。（用灭菌的TBS溶液10倍系列稀释洗脱液。建议的稀释范围是：测定未扩增的淘选洗脱液为 101~104，扩增后的洗脱液为 108~1011。当菌体达到对数期时，分 200μL 等份于青霉素小瓶中，每个菌体稀释度一瓶，每瓶中 10μL 的不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀形成受噬菌体感染的细菌）。
不同筛选轮次的噬菌体富集鉴定见表1，洗脱液的滴度测定结果见表2。
表1 每轮亲和筛选中噬菌体的量
| 轮次 | 蛋白包被量（μg/ml） | 加入噬菌体量（pfu/ml） | 洗脱噬菌体的量（pfu/ml） | 回收率（%） |
| 1 | 120 | 1×1011 | 7.4×103 | 6.2×10-8 |
| 2 | 60 | 1×1011 | 4.7×104 | 4.2×10-7 |
| 3 | 30 | 1×1011 | 6.3×107 | 5.8×10-4 |
| 4 | 15 | 1×1011 | 7.7×108 | 6.2×10-3 |
| 5 | 10 | 1×1011 | 6.5×109 | 6.3×10-2 |
表2 每轮亲和筛选洗脱液的滴度测定
| 轮次 | 洗脱液滴度（pfu/ml） | 扩增后滴度（pfu/ml） |
| 1 | 6.32×103 | 7.52×1013 |
| 2 | 4.95×104 | 4.31×1013 |
| 3 | 5.88×107 | 5.23×1013 |
| 4 | 8.86×108 | 6.79×1013 |
| 5 | 7.67×109 | 4.67×1013 |
实例2 筛选多肽的鉴定
（1）将接种的乙脑病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2μg/ml（蛋白量计）进行ELISA板包被；以同样方式将人工表达的乙脑病毒E蛋白和未接种病毒的PK15做为对照进行包被；在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被；
（2）将人工合成多肽的HRHHV偶联辣根过氧化物酶（采用商业化偶联试剂盒偶联），将偶联产物加入上述ELISA板中，每孔50μl，浓度为100ng/ml，加入到上述ELISA板中，震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育30min；
（3）用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤6次；
（4）根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100μl，在酶标板震荡器上震荡30秒，室温（23±3℃）10分钟充分显色；
（5）每孔加入50μl 2M 的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
结果表明，人工合成多肽与人工接种JEV、人工表达JEV E蛋白均可以结合（见图1），而且与其它病毒蛋白均不反应，其特异性较高（见图2）。
实例3 筛选多肽的亲和力鉴定
（1）将接种的乙脑病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2μg/ml（蛋白量计）进行ELISA板包被；以同样方式将人工表达的乙脑病毒E蛋白和未接种病毒的PK15做为对照进行包被。在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被；
（2）将人工合成多肽HRHHV偶联辣根过氧化物酶，不同浓度的酶标记多肽加入到上述ELISA板中50μl，震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育30min；
（3）用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤6次；
（4）根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100μl，在酶标板震荡器上震荡30秒，室温（23±3℃）10分钟充分显色；
（5）每孔加入50μl 2M 的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
最终利用Scatchard方程分析，不同加入酶标多肽的浓度来计算多肽与病毒的亲和力常数，其中Ka=[结合物]/[抗原][多肽]，（其中[结合物]是指多肽与抗原相结合的浓度，[抗原]是指抗原浓度，[多肽]是指未结合的多肽浓度）。通过计算可知本发明多肽与E2蛋白的亲和力常数可达4.96×109L/mol，说明其亲和力比较好。
实例4 JEV E蛋白的定量测定
（1）将接种的乙脑病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2μg/ml（蛋白量计）进行ELISA板包被；
（2）将不同浓度的JEV E蛋白加入到微量孔中（浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml），将人工合成多肽的HRHHV偶联辣根过氧化物酶（采用商业化偶联试剂盒偶联），将偶联产物加入上述ELISA板中，每孔50μl，浓度为100ng/ml，加入到上述ELISA板中，震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育30min；
（3）用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤6次；
（4）根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100μl，在酶标板震荡器上震荡30秒，室温（23±3℃）10分钟充分显色；
（5）每孔加入50μl 2M 的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
（6）标准曲线绘制：以JEV E蛋白的浓度对数值为X轴，以选定浓度的吸光值/阳性值的强光值的百分率为Y轴，绘制各个浓度的点，并计算其标准曲线方程（见图3）。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
<120> 一条与乙脑病毒E蛋白相结合的多肽及其应用
<130> 噬菌体肽库筛选技术
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
His Arg His His Val
1 5
Claims (5)
1.一条可与乙脑病毒E蛋白结合的多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列为HRHHV。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征是，所述多肽为线性结合多肽。
3.编码权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征是，将所述多肽用于乙脑的抗原检测，其中包括酶联免疫反应、放射免疫测定、免疫学试纸检测、western blot检测。
5.根据权利要求1-4任一项所述的多肽在制备对乙脑病毒E蛋白进行定量和定性检测的试剂、试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510496005.2A CN105085621B (zh) | 2015-08-14 | 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510496005.2A CN105085621B (zh) | 2015-08-14 | 一条与乙脑病毒e蛋白相结合的多肽及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105085621A CN105085621A (zh) | 2015-11-25 |
| CN105085621B true CN105085621B (zh) | 2018-08-31 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104597256A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-06 | 河南省农业科学院 | 一条与牛病毒性腹泻病毒e2蛋白相结合的多肽序列及其应用 |
| CN104650185A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-27 | 河南省农业科学院 | 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104597256A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-06 | 河南省农业科学院 | 一条与牛病毒性腹泻病毒e2蛋白相结合的多肽序列及其应用 |
| CN104650185A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-27 | 河南省农业科学院 | 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Neutralizing peptide ligands selected from phage-displayed libraries mimic the conformational epitope on domain Ⅲ of the Japanese encephalitis virus envelope protein;Wu SC et al;《Virus Research》;20010731;59-69 * |
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