CN104650185B - 一条与猪瘟e0蛋白相结合的多肽序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明主要涉及猪瘟病毒E0结合多肽及其应用，该多肽序列为WRYDQ，是一种线性结合多肽，以多肽序列为核心，可以对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定蛋白质。本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株；挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序列为WRYDQ；人工合此多肽进行ELISA结合实验，结果证明此合成多肽能与猪瘟病毒E0蛋白很好的结合；本发明较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地对猪瘟E0蛋白进行定性和定量检测。

Description

一条与猪瘟E0蛋白相结合的多肽序列及其应用
技术领域
本发明属于病毒检测领域，主要涉及猪瘟病毒E0结合多肽及其应用。
背景技术
猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV) E0糖蛋白既是包膜蛋白，又是一种核酸酶，其活性对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系。在CSFV编码的蛋白中，囊膜蛋白E0和E2研究的最为清楚，因为这两个蛋白均位于病毒粒子的表面，对于一个有囊膜的病毒来说，镶嵌在囊膜中的糖蛋白对于病毒识别、吸附并进入宿主细胞是十分重要的。EO糖蛋白从病毒基因组ORF上第268个氨基酸开始到第494个氨基酸为止，共227个氨基酸，其甲基化程度很高，分子量为44-48Kda，依靠二硫键的连接二聚体的形式存在，分子量为97KD。真核细胞上普遍存在着可与E0结合的细胞受体，E0与细胞的结合为不可逆过程。
噬菌体展示技术是当前研究多肽与蛋白质作用的一种有效手段。这一技术将多肽的编码序列克隆到噬菌体壳蛋白的合适位置，并且要保证其正确的翻译序列，也不影响噬菌体壳蛋白的正常功能，这样噬菌体表达的壳蛋白结构中将会存在外源多肽的序列；伴随着噬菌体子代的重新组装，外源多肽序列将展示在噬菌体的表面。在一般情况下，外源展示的多肽具备一定的空间结构和生物活性，可以与相应的靶分子进行结合。展示肽库与靶蛋白分子结合后，洗去未结合的噬菌体，然后将与靶分子结合的噬菌体洗脱下来感染细胞扩增，经过3轮到6轮的“吸附-洗脱-扩增”，噬菌体与靶分子的结合特异性将逐步提高；经过多次筛选之后，最终可以筛选到与靶分子相结合的高亲和噬菌体。
发明内容
本发明借助噬菌体肽库展示技术，利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株，挑选其克隆株进行序列测定，其多肽序列为WRYDQ；人工合成此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，人工合成的多肽可与猪瘟病毒E0蛋白有良好的结合能力。借助本发明的多肽，可用于对猪瘟抗原进行定量和定性的检测。
本发明的技术方案：
一条可与猪瘟病毒E0蛋白结合的多肽序列为WRYDQ。
所述多肽序列为线性结合多肽。
所述的多肽序列中，包括以所述的多肽序列为核心，任何对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
将所述多肽序列用于猪瘟的抗原检测，其中包括但不局限于酶联免疫反应检测。
所述的多肽序列在用于对猪瘟抗原进行定量和定性检测中的应用。
本发明的积极有益效果：
（1）本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的猪瘟E0蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合猪瘟E0蛋白的多肽克隆株。挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序列为WRYDQ；人工合此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，此人工合成的多肽可与猪瘟病毒E0蛋白有很好的结合；其亲和力可达5.54´109L/mol。
（2）由于病毒难以纯化，因此针对病毒的抗体获得非常不易，本发明设计合成的多肽很好地规避了这一难题，可进行人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。
（3）本发明的人工合成多肽与人工接种CSFV、人工表达CSFV E0蛋白均可以结合，而且与其它病毒蛋白均不反应，特异性较高。
（4）本方法较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地对猪瘟E0蛋白进行定性和定量检测。
附图说明
图1：利用多肽测定培养猪瘟病毒、表达蛋白的结果。
图中横坐标上，1为猪瘟病毒接种PK15细胞，2为表达猪瘟病毒E0蛋白，3 为PK15细胞对照；纵坐标为OD值。
图2：利用本发明的多肽与其它病毒交叉反应的结果。
图中横坐标为不同包被ELISA板细胞培养物的病毒各类；纵坐标为OD值。
具体实施方式
实例1 噬菌体随机肽库的筛选
用纯化表达的CSFV E0蛋白包被聚氯乙烯板，每孔100μl（100μl /ml）包被，置于4℃条件下过夜，用PBST洗涤后再用5%的BSA液封闭。
将稀释后的噬菌体肽库100μl加入到相应的孔中，室温条件下孵肓2h，用TBST液冲洗8-10次，每孔加入洗脱液200μl，室温条件下振荡5-8min，吸出洗脱液并中和至中性。
中和后的洗脱液可以用于滴度测定和下一轮培养；将LB培养后的噬菌体进行离心收集，用于下一轮的筛选。
不同筛选轮次的噬菌体富集鉴定见表1，洗脱液的滴度测定结果见表2。
表1 每轮亲和筛选中噬菌体的量
表2 每轮亲和筛选洗脱液的滴度测定
实例2 筛选多肽的鉴定
（1）将接种的猪瘟病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2μg/ml（蛋白量计）进行ELISA板包被；以同样方式将人工表达的猪瘟病毒E0蛋白和未接种病毒的PK15做为对照进行包被。在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被。
（2）将人工合成多肽WRYDQ偶联辣根过氧化物酶，以100ng/ml的量，每孔加入到上述ELISA板中50μl，震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育30min；
（3）用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤6次；
（4）根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100μl，在酶标板震荡器上震荡30秒，室温（23±3℃）10分钟充分显色；
（5）每孔加入50μl 2M 的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
结果表明，人工合成多肽与人工接种CSFV、人工表达CSFV E0蛋白均可以结合（见图1），而且与其它病毒蛋白均不反应，其特异性较高（见图2）。
实例3 筛选多肽的亲和力鉴定
（1）将接种的猪瘟病毒的PK15细胞培养液进行超声破碎，然后以2μg/ml（蛋白量计）进行ELISA板包被；以同样方式将人工表达的猪瘟病毒E0蛋白和未接种病毒的PK15做为对照进行包被。在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被。
（2）将人工合成多肽WRYDQ偶联辣根过氧化物酶，不同浓度的酶标记多肽加入到上述ELISA板中50μl，震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育30min；
（3）用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤6次；
（4）根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100μl，在酶标板震荡器上震荡30秒，室温（23±3℃）10分钟充分显色；
（5）每孔加入50μl 2M 的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
最终利用Scatchard方程分析，不同加入酶标多肽的浓度来计算多肽与病毒的亲和力常数，其中Ka=[结合物]/[抗原][多肽]，（其中[结合物]是指多肽与抗原相结合的浓度，[抗原]是指抗原浓度，[多肽]是指未结合的多肽浓度）。通过计算可知本发明多肽与E0蛋白的亲和力常数可达5.54×109L/mol，说明其亲和力比较好。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 一条与猪瘟E0蛋白相结合的多肽序列及其应用
<130> 酶联免疫反应
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Arg Tyr Asp Gln
1 5

Claims (3)

1.一条可与猪瘟病毒E0蛋白结合的多肽，其特征是，所述多肽序列为WRYDQ。
2.一种权利要求1所述多肽，其特征是，以权利要求1所述的多肽为核心，对该多肽的修饰，所述的修饰材料为纳米材料、荧光材料、酶类及生物素。
3.根据权利要求1所述的多肽在制备用于对猪瘟抗原进行定量和定性检测的试剂中的应用。
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猪瘟病毒糖蛋白Erns中和表位的鉴定和比较;张富强等;《微生物学报》;20050228;第45卷(第1期);第66-71页 *

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