CN105315346B - 可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇的多肽分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalneol,DON)的多肽分子及其应用，该多肽分子的氨基酸序列为CAHHGIPQC。本发明采用液相亲和淘选并结合DON抗体竞争性洗脱的方式，快速淘选获得可特异性结合DON的多肽分子，所述的多肽分子可以替代传统的DON抗体并应用于DON的免疫学分析体系中，并具有更好的酸碱耐受及热稳定性，该多肽分子的获得无需免疫过程、制备简单、成本低、周期短，该多肽分子既可通过生物培养的方式大量扩增，也可以通过化学合成或者基因工程的方法进行大量制备，为DON抗体的制备提供了新的路径，具有较好的应用价值。

Description

可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇的多肽分子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalneol,DON)的多肽分子及其应用。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalneol,DON)，又称为呕吐毒素(Vomitoxin)，属单端孢烯族化合物，由于它可引起猪的呕吐而得名，对人体也具有一定的危害，欧盟分类标准为三级致癌物。DON主要由镰刀菌产生，广泛存在于大麦、小麦、玉米、燕麦和大米等农作物及其制品中。DON具有细胞毒性、胚胎毒性和免疫毒性等，可引起厌食、呕吐、腹泻、发烧和生长缓慢等症状，严重威胁人类及动物的健康。由于DON的高污染率和高毒性，对食品中DON的检测具有重要意义。

目前比较常用的检测DON的方法主要包括：高效液相色谱法(High performanceliquid chromatography，HPLC)，气相色谱法(Gaschromatography，GC)，薄层层析法(Thinlayer chromatography，TLC)，高效液相色谱-质谱联用法(High performance liquidchromatography-mass sepectrum，HPLC-MS)，微生物检测法和免疫检测法等，其中免疫学分析方法以其灵敏度高、操作简单以及可实现规模化筛选等优点，在DON的快速检测领域中得到了广泛的应用。

免疫学分析方法的核心在于抗原-抗体间的特异性识别及结合，因此制备特异性结合抗原的抗体就成为发展免疫学分析方法的前提与核心。抗体的研究近年来发展迅猛，已经从传统的多克隆、单克隆抗体，发展至以单链抗体、噬菌体展示抗体、单域重链抗体、抗独特型抗体等为代表的基因工程抗体领域。相比于传统抗体制备必须经历动物免疫、细胞融合、阳性克隆筛选等复杂程序，基因工程抗体以其可定向改造、淘选方便等优点已成为目前研究的热点。除此以外，近年来包括我国在内的众多学者已经开始着眼于不以免疫球蛋白为主体组成结构的新型抗体研究，例如基于SELEX技术的核酸适配体、基于分子印迹聚合体技术的人工抗体以及基于Lipocalin蛋白家族的抗体类似物等都取得了可喜的进展，为传统抗体的替代性研究提供了扎实的理论和方法学基础。纵观抗体的发展动态，可以看出新型抗体具有分子量小、结构简单、可自我进化、制备快捷的特点及发展趋势。例如，单克隆抗体、单链抗体、单域重链抗体的分子量逐渐减少，分别为150、30-50、15-20kDa，以Lipocalin 为骨架蛋白的抗体类似物为18-20kDa，而核酸适配体则仅为一小段核酸序列。

近年来人们热衷于研究发展肽模拟物(peptido-mimetics)，目的之一是将具有生物活性的复杂分子逐步修饰、取代、改造、最终压缩至仅包含功能单位的小分子，称之为肽模拟物的合理设计。因此，多肽分子可成为潜在的新型抗体分子。随着噬菌体展示多肽库技术的迅速发展，通过噬菌体展示肽库的淘选，可快速、简单地获得与特定靶体分子特异性结合的多肽分子。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛，但是上述噬菌体展示多肽技术的应用大多局限于以大分子蛋白质为靶体分子进行亲和淘选。由于蛋白质表面具有多个拷贝的表位，因此非常容易获得与之对应结合的多肽分子。目前的多肽分子大多作为抗原的模拟表位(抗原替代物)应用于免疫学分析中，而将多肽分子作为小分子物质抗体的替代物应用于免疫学分析的报道较少，其原因在于，小分子物质体积过小，且表面没有丰富的氨基、羧基基团，难以与多肽分子结合，从而造成淘选困难。

本发明通过噬菌体展示多肽库技术，采用亲和淘选的方式，从噬菌体展示多肽库中快速筛选到能与DON特异性结合的多肽分子，该多肽分子具有与传统的DON多克隆、单克隆抗体分子相似的免疫学检测特性，可作为传统DON抗体的替代物应用于DON 的免疫学分析体系。该方法避免了制备传统的单克隆抗体分子所需要的动物免疫、细胞融合、单克隆筛选等流程，具有无需免疫过程、筛选方便、周期短、制备成本低等特点。

发明内容

本发明以DON全抗原(DON与卵清白蛋白的偶联物DON-Ovalbumin)为靶分子，将靶分子结合到酶标板载体上，投入噬菌体随机展示环七肽库，进行液相亲和淘选，获得了一种可特异性结合DON的多肽分子，其氨基酸序列为：AHHGIPQ(在构建环七肽库的过程中，其展示的七肽序列首尾还各有一个C残基，以成环状结构，若将首尾半胱氨酸残基也计入在内，则其氨基酸序列为CAHHGIPQC)

上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即A代表丙氨酸残基，H代表组胺酸残基，P代表脯氨酸残基，G代表甘氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，C代表半胱氨酸残基。

本发明还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列(CAHHGIPQC)的核苷酸，其序列为:

TGT GCT CAT CAT GGT ATT CCG TAG TGT。

本发明提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。

本发明还涉及所述多肽分子在非疾病诊断目的免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测等基于抗原-抗体特异性反应的非疾病诊断目的免疫学分析检测类型。

本发明的有益效果是：本发明所提及的多肽分子可替代传统的DON抗体分子，作为DON的结合分子直接应用于免疫学检测分析，该多肽分子具有结构稳定性好、耐酸碱、耐高温，制备简单、快速等特点。

附图说明

图1基于多肽分子的DON间接竞争ELISA标准曲线。

具体实施方式

实施例1.与DON特异性结合多肽分子的亲和淘选及其鉴定

1)亲和淘选与DON特异性结合多肽分子的具体方法为：取0.5mg DON-OVA全抗原(偶联比为15:1)，包被于酶标板孔(100μL/孔)，37℃孵育2小时。用PBST(10mM PBS pH 7.4包含0.1％Tween-20(v/v))洗涤10次后，加入350μl封闭液(5％明胶溶液)37℃孵育 2小时。用PBST洗涤5次，每孔加入100μl噬菌体肽库(噬菌体展示环七肽库，购自 NEB公司，用PBS10倍稀释噬菌体原液，约2.0×10¹¹pfu)，37℃振荡反应2小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤15次，结合上的噬菌体用100ng溶于PBS的DON 抗体进行竞争洗脱。取10μl洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E.coli ER2738菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。

然后依次进行第2轮和第3轮淘选，淘选步骤与第一轮大体相同，每次加入的噬菌体量均为2×10¹¹pfu，不同之处在于：第2、3轮筛选的噬菌体展示多肽与包被了DON-OVA的板条孵育时间分别为60min、30min，竞争洗脱液(DON抗体)的浓度分别为75ng/mL， 25ng/mL。

2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取70个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10mM PBS(pH 7.4)稀释DON-OVA抗原，2μg/mL包被 96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3 次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100μl噬菌体斑扩增液(1.0×10¹²pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1：5000 倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育1小时；加入100μl TMB底物液，避光显色5min，酶标仪读取450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

3)特异性结合DON多肽分子的鉴定：采用间接竞争ELISA的方法进行与DON特异性结合噬菌体展示多肽的鉴定，具体方法为：用10mM PBS(pH 7.4)稀释DON-OVA， 2μg/mL包被酶标板100μL，4℃孵育过夜；第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入50μl 经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆(1.0×10¹¹pfu)和50μl DON标准品(浓度范围为0-1000ng/mL)，37℃孵育1小时；加入1：5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育1小时；加入100μl TMB底物液，避光显色5min，读取OD₄₅₀。若噬菌体展示的的多肽分子可特异性结合DON，则加入了DON标准品的孔的OD值要低于对照孔(未加入DON标准品)。

实施例2.与DON特异性结合的多肽分子编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

1.将经过间接竞争ELISA鉴定展示有特异性结合DON多肽分子的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800μl含噬菌体上清转入一新离心管。加入200μl PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100μl碘化物缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI)，加入250μl无水乙醇沉淀DNA，离心后再用70％乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20μl灭菌水，取2μl进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5μL 噬菌体模板进行DNA测序，其-96gIII测序引物为：5’-^HOCCC TCATAG TTA GCG TAA CG-3’。DNA测序核苷酸序列为:TGT GCT CAT CAT GGT ATT CCG TAG TGT依据 DNA测序结果及密码子表可获得多肽分子(含首尾半胱氨酸)的氨基酸序列：CAHHGIPQC。

实施例3.特异性结合DON多肽分子在ELISA中的应用

(1)样品提取

称取5g待测样品，加入25ml PBS溶液，200rpm振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取1ml滤液加入1ml PBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.2) 混匀后，即为样品提取液，待用。

(2)包被及封闭

用10mM PBS(pH 7.4)稀释的DON-OVA(2μg/ml)，包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的 PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

(3)标准曲线的建立

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μl展示有特异性结合DON多肽分子的噬菌体(1.0×10¹²pfu)和一系列不同浓度的50μL DON标准品(0-10,000ng/ml)， 37℃孵育20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以DON浓度对数为横坐标，结合率(加入DON 的孔的OD₄₅₀/未加入DON的孔的OD₄₅₀×100％)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(4)样品的检测

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μl展示有特异性结合DON多肽分子的噬菌体(1.0×10¹²pfu)和待测样品提取液，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释 HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中DON的含量。

实施例4与DON特异性结合多肽分子的的大量制备

1)以噬菌体扩增的方式

将与DON特异性结合的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738的培养物中，37度220rpm振荡培养4.5h。将培养物转入另一离心管中，4℃10000rpm离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃下静置120min。4℃ 10000rpm离心PEG/NaCL静置溶液15min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入1mL TBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。

2)以多肽-融合蛋白的方式进行制备

A.PCR扩增多肽分子的外源编码基因

PCR反应体系：(50μL)

PCR反应条件：

采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。多肽分子(含首尾半胱氨酸)的编码基因序列为：TGT GCT CAT CAT GGT ATT CCG TAG TGT，

B.外源编码基因及表达载体的双酶切

分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII,NEB公司，可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。

C.酶切后产物的连接及转化

将质粒pMal-PIII和目的片段以1∶15(摩尔比)混匀，于20℃水浴连接12h,取 15μL连接产物加至100μL感受态细胞DH5α中，充分混匀。冰浴35min后，42℃水浴热激60s，立即冰浴3min后补加800μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养1h， 8000rpm离心5min，吸去上清留取约300μL，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中， 37℃过夜培养，得到亚克隆阳性克隆。

D.克隆转化

将上述步骤得到的亚克隆用天根试剂盒提取目的质粒，取10μL至100μL感受态细胞TB1中，充分混匀。冰浴20min后，45℃水浴热激60s，立即冰浴5min后补加 800μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养45min，7000rpm离心6min，吸去上清留取约300μL，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆。

E.多肽-MBP融合蛋白的表达

将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mL LB-A，0.5％蔗糖中，37℃，220r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的 LB-A，0.2％蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37℃，220r/min振荡培养，当培养物细菌浓度OD600达到0.6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，120r/min 振荡培养，将诱导物(IPEG溶液)于4℃，5000g，离心15min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400mL 30mM Tris-HCl，25％蔗糖，pH 8.0(80mL/g细胞湿重)，加入 EDTA至1mM，室温下震荡5-10min，8000g，4℃离心15min，弃上清，沉淀重悬于 400ml预冷的5mM MgSO₄ ，冰上震荡15min，8000g，4℃，离心20min，保留上清，向上清液中加入8mL 1M Tris-HCl,pH 7.4，获得多肽-MBP融合蛋白。

实施例5与DON特异性结合多肽分子的免疫学检测稳定性实验

1)耐酸碱性实验

将可与DON特异性结合的多肽分子及DON单克隆抗体分别用pH＝4.0，5.0，6.0，7.4， 8.0的缓冲液稀释成工作液，分别进行间接竞争ELISA测定，具体方法为：用10mM PBS(pH 7.4)稀释的DON-OVA(2μg/ml)，包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10 mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37 ℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。取出处理好的板条，每孔分别投入50μl可特异性结合DON的多肽分子/DON单克隆抗体(20μg/ml)和一系列不同浓度的50μl DON标准品(0-10,000ng/ml)，37℃孵育20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13 噬菌体二抗/HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以DON浓度对数为横坐标，结合率(加入DON的孔的OD₄₅₀/未加入DON 的孔的OD₄₅₀×100％)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

实验结果显示：以多肽分子作为DON识别元件的间接竞争ELISA，在pH＝4.0，5.0，6.0，7.4，8.0时，其IC₅₀分别为2100，2300，2290，2180ng/ml；以DON单克隆抗体为识别元件的间接竞争ELISA，在pH＝4.0，5.0，6.0时未有良好的阻断效应，呈现平滑曲线，抗体的免疫学分析性能受到显著影响，表明DON抗体替代物的多肽分子具有更好的酸碱耐性。

2)高温耐受性实验

将可与DON特异性结合的多肽分子及DON单克隆抗体分别置于温度为37℃，45℃，50 ℃，60℃，70℃的水浴中孵育30min，取出后分别进行间接ELISA实验，具体方法为：用10mM PBS(pH 7.4)稀释的DON-OVA(2μg/ml)，包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS 进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。取出处理好的板条，每孔分别投入经过不同温度孵育过的50μl可特异性结合DON的多肽分子/DON单克隆抗体 (20μg/ml)，37℃孵育20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/HRP 标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀，，以37 ℃时的OD值为100％，计算不同温度下OD₄₅₀值的稳定度％。

实验结果显示:以多肽分子作为DON识别元件的间接ELISA，在温度为37℃，45℃，50℃，60℃，70℃时，其稳定度分别为100％，93％，88％，80％，72％；以DON单克隆抗体作为DON识别元件的间接ELISA，在温度为37℃，45℃，50℃，60℃，70℃时，其温度度分别为100％，70％，50％，20％,10％，表明相比于传统的DON单克隆抗体，DON抗体替代物的多肽分子具有更好的高温耐受性。

Claims (4)

1.可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalneol,DON) 的多肽分子，其特征在于其氨基酸序列为： CAHHGIPQC。

2.如权利要求1所述多肽分子的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇多肽分子的噬菌体粒子；所述化学合成指依据多肽分子的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成；所述基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽- 融合蛋白的形式进行大量制备。

3.权利要求 1 所述多肽分子在非疾病诊断目的免疫学检测分析中的应用。

4.如权利要求 3 所述应用，其特征在于多肽分子替代传统的脱氧雪腐镰刀菌烯醇多克隆、单克隆抗体在非疾病诊断目的免疫学检测分析中的应用。