CN104592389A - 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体制备及其应用,其氨基酸序列SEQ ID NO.:1，还涉及编码该氨基酸的核苷酸。本发明纳米抗体可以替代价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测，该纳米抗体具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，效果良好。纳米抗体相比于传统的基于多肽的抗原模拟表位及基于IgG的传统抗独特型抗体，具有结构更加稳定、耐酸碱和高温、检测灵敏度高等特性，因此其免疫检测稳定性得到了极大的提升，同时对环境的耐受能力也得到了提升。

Description

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体(anti- deoxynivalneol Monoclonal antibody, anti-DON McAb)的纳米抗体（Variable domain of heavy chain of heavychain antibody, VHH）制备及其应用。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalneol，DON)是一种单端孢霉烯族毒素，主要由镰刀菌产生，广泛存在于大麦、小麦、玉米、燕麦和大米等农作物及其制品中。DON具有细胞毒性、胚胎毒性和免疫毒性等，可引起厌食、呕吐、腹泻、发烧和生长缓慢等症状，严重威胁人类及动物的健康。由于DON的高污染率和高毒性，对食品中DON的检测具有重要意义。

目前，检测食品中DON的方法主要有薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、表面等离子共振及免疫学检测等方法，免疫学检测方法由于其检测方便、成本低廉、灵敏度高等优势在DON的检测应用广泛。然而，在建立免疫学检测方法的过程中，必不可免的需要以DON标准品为原料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，DON标准品不仅价格昂贵而且具有较强的毒性，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。因此，人们开始利用抗独特型抗体和抗原模拟表位来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶分子特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。

本发明通过用噬菌体展示技术，从驼源天然单域重链抗体库中筛选能与靶分子（抗DON单克隆抗体）特异性结合的纳米抗体（VHH），以纳米抗体作为DON抗原的替代物应用于免疫学分析检测领域。该方法避免了传统抗独特型抗体制备所需的动物免疫过程，且具有普遍适用性，筛选得到的纳米抗体具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，可替代价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测。

发明内容

本发明提供了一种可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体。

本发明以抗DON单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入驼源天然单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种可特异性结合抗DON单克隆抗体的纳米抗体（A31），其具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。

其氨基酸序列的IMGT编号和结构域划分如图1所示。

本发明所提及的纳米抗体包括四个框架区（Framework region, FR）和三个互补决定区（Complementarity-determining region, CDR）。其中，框架区（FR1-FR4）分别选自SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :6和SEQ ID NO. :8，互补决定区（CDR1-CDR3）分别选自SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。

本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :6和SEQ ID NO. :8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有90%同源性。

本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80%同源性。

本发明还涉及编码该纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO. :9。

本发明提及的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。

本发明还涉及所述纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。

本发明所述的纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。

本发明还涉及该纳米抗体在免疫学检测分析中的应用，具体为纳米抗体在制备DON的模拟物试剂中的应用。

本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质（亲和力、特异性和稳定性等）更好的突变体。

本发明中所叙述的一些术语具有如下含义 ：

同源性：描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间的同源性百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以【100%】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、 插入、 替换或添加 （与第一氨基酸相比）被认为是有差别。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计算机运算程序（如：NCBI Blast） 获得。

结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。

IMGT 编号：IMGT 数据库 （The International ImMunoGeneTics Database）中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献 （Ehrenmann, F., Q. Kaas, et al.  (2010). "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF." Nucleic Acids Res 38(Database issue): D301-307. Lefranc, M. P., C. Pommie, et al. (2003). "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains." Dev Comp Immunol 27(1): 55-77.）中的描述。

密码子（codon）：亦称三联体密码(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。

前述纳米抗体可以替换价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测，该纳米抗体具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，效果良好。

本发明的有益效果是：本发明纳米抗体可以替代价格昂贵且毒性强的DON标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于DON的免疫学检测。该纳米抗体具有与天然DON分子相似的免疫反应特性，可提高DON检测灵敏度，减少DON标准品对操作人员健康和环境的危害，节约成本。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质抗原替代物的筛选和制备，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为纳米抗体(A31)的氨基酸编号及结构域示意图。

图2为以纳米抗体(A31)建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围为5.02-80.37 ng/mL，IC₅₀为19.97 ng/mL。

具体实施方式

实施例1.  驼源天然单域重链抗体库的构建

1）驼源白细胞的分离：在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入等体积血液样品，1000 g离心50 min；小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入1/2体积的PBS，1000g离心1 5min；弃上清，用PBS洗下离心管壁上的白细胞，1000g离心10min；弃上清，加入500 μL PBS重悬白细胞并计数；以体积比1：15加入裂解液（RNAiso）保存备用。

2）总RNA提取：向上述裂解液中加入1/4体积的氯仿，剧烈震荡20 s 使其充分乳化，室温静置 5 min；4℃ 12000g 离心 15 min，取上清转移至另一新鲜离心管中；加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min；4℃ 10000g 离心 20 min，弃上清，缓慢加入75%乙醇1mL，小心洗涤离心管管壁；4℃，12000g 离心 5 min 后弃去乙醇；室温干燥沉淀 5 min，加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于 -80 ℃ 保存。

3）cDNA的合成：将反转录用的引物、dNTP Mixture和模板RNA混合，65 ℃ 5min，迅速冰浴。具体配制如下：

Oligo dT Primer（2.5 μM）	1 μL
		dNTP Mixture（10 mM each）	1 μL
Total RNA	< 5 μg
		RNase free dH2O	5 μL
Total	10 μL

然后在上述 Microtube 中配置下列反转录反应液：

上述变性后反应液	10 μL
		5×PrimeScript Buffer	4 μL
RNase Inhibitor（40 U/μL）	0.5 μL
		PrimeScript RTase（200 U/μL）	1 μL
RNase free dH2O	4.5 μL
		Total	20 μL

PCR 仪上按下列条件进行反转录反应：42 ℃ 35 min，50 ℃ 45 min，70 ℃ 10 min。PCR 产物于 -20 ℃ 保存备用。

4）抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应：

第一轮PCR：

5×PrimeSTAR Buffer	10 μL
		dNTP Mixture（each 2.5 μM）	4 μL
Primer AlpVh-LD（10 μM）	1 μL
		Primer CH2-R（10 μM）	1 μL
1 st-Strand cDNA	1 μL
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL）	0.5μL
ddH2O	32.5μL
		Total	50 μL

PCR 反应条件：96 ℃ 1 min；98 ℃ 6s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 65s，35 cycles；75 ℃ 10 min；

采用试剂盒回收 PCR 扩增产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板。

 第二轮PCR：

5×PrimeSTAR Buffer	10 μL
		dNTP Mixture（each 2.5 μM）	4 μL
Primer AlpVh-SfiⅠ	1 μL
		Primer AlpVHHR1-NotⅠ/AlpVHHR2-NotⅠ	1 μL
第一轮PCR产物	1 μL
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL	0.5μL
ddH2O	32.5μL
		Total	50 μL

PCR 反应条件：94 ℃5 min；98 ℃ 8 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，6 cycles；98 ℃ 10 s ，68 ℃ 45 s ，30 cycles ； 72 ℃ 7 min。

5) 文库构建：

A. VHH编码基因及载体的双酶切

分别采用Sfi I和Not I 酶对VHH编码基因和pHEN1载体进行双酶切。

B. 酶切后产物的连接

将载体pHEN1和VHH片段混匀（摩尔比1∶7），于 16 ℃ 连接 8 h。先后加入 5 μL（1/10 量）的 3 M CH₃COONa（pH 5.2）和 125 μL（2.5 倍量）的冷无水乙醇，-20 ℃ 静置 2h，10000 rpm 离心回收沉淀，用 70 % 的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于10 μL 去离子水中。

C. 电转化

取5 μL连接产物加至80 μL感受态细胞E.coli TG1中，充分混匀，冰上放置1min。转入0.1 cm 的电击杯中电击转化（电压为 1.8 kV），立即向电击杯中加入900μL LB培养基，37 ℃ 160 rpm 培养1 h 。将菌液涂布于LB-AG平板，37 ℃倒置培养过夜。

6）文库的救援：接种超过10倍库容量的细胞于100mL 2×YT/amp/2%葡萄糖，培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体（20:l感染复数），37℃，静置15min后，220rpm培养45min；4℃，1000g离心10min；弃上清，加入100mL新鲜的2×YT/amp/kan培养基重悬沉淀，30℃培养过夜；4℃ 10000rpm离心10min，取上清；加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，4℃静置3-4h；4℃ 10000rpm离心15min，弃上清，沉淀用1mL PBS重悬；取10μL测定库容，其余加入终浓度50%甘油，-80℃保存。

实施例2.  纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

1）纳米抗体的亲和淘选：首先，用PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至终浓度100 μg/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST (10mM PBS，0.1% Tween-20 (v/v) ) 洗涤5次后，加入5% BSA-PBS（或5 % OVA-PBS）37℃封闭1小时。然后用PBST洗涤6次，每孔加入100 μL驼源天然单域重链抗体库（滴度约2.0×10¹¹ cfu），37℃孵育2小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，加入100μL的Glycine-HCl (0.2M, pH 2.2) 洗脱8min后，立即用15 μL Tris-HCl (1M，pH 9.1) 中和。取10 μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染25 mL生长至对数期的E. coli TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。

在第二、第三和第四轮的淘选过程中，包被的抗DON单克隆抗体浓度分别为50 μg/mL， 25 μg/mL和10μg/mL，加入噬菌体孵育后用PBST洗涤次数分别为12次，15次和18次，其余步骤同上。

2）阳性噬菌体克隆的鉴定： 从第三轮和第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取50个克隆，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法（Indirect Enzyme Linked immunoasorbent assay, I-ELISA）进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：首先，用PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至 10 μg/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) )洗涤3次后，加入300μL的5%脱脂奶粉，37℃封闭2小时；弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100 μL噬菌体扩增液（2.0×10¹¹ cfu），以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μL，37 ℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min；加入50μL终止液（2M H₂SO₄）终止反应；用酶标仪（Thermo Scientific Multiskan FC）测定450 nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

3) 阳性纳米抗体的鉴定：采用间接竞争ELISA的方法进行阳性纳米抗体的鉴定，具体方法为：用PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至5 μg/mL， 4℃包被过夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤5次后，加入300μL的5%脱脂奶粉，37℃封闭1小时；加入50 μL经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆（1.0×10¹¹ cfu）和50 μL DON标准品（浓度范围为0-100 ng/ml），37℃孵育1小时；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min，测定OD₄₅₀，能结合抗DON单克隆抗体，且能被DON标准品所阻断的噬菌体，鉴定为阳性纳米抗体，结果显示获得1株阳性纳米抗体，命名为A31。

实施例3.  纳米抗体编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经过间接竞争ELISA鉴定展示有阳性纳米抗体的噬菌体克隆进行DNA测序，根据DNA测序结果及密码子表可获得纳米抗体的氨基酸序列，序列如SEQ ID NO. :1所示。

实施例4.  阳性纳米抗体的大量制备

（1）以噬菌体扩增的方式进行制备

将展示有阳性纳米抗体的噬菌体加入至20 mL接种有E.coli TG1的培养物中，37℃ 220 rpm振荡培养6 h。将培养物转入另一离心管中，4 ℃ 10000 rpm离心10 min，将上清的上部80 %转入一新鲜的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4 ℃静置120 min后，4℃ 10000 rpm离心10min，弃上清；再加入少量PBS清洗噬菌体。4℃ 10000 rpm离心10min，弃上清，加入1mL PBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。

（2）以蛋白表达的形式进行制备

分别采用Nco I和Not I 酶对外源编码VHH基因和表达载体（pET-25b）进行双酶切，将VHH编码基因克隆至表达载体pET-25b，经PCR和酶切验证后，将重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta（DE3）。从转化平板上挑一单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37℃，220 r/min振荡培养过夜，将过夜培养物按1 %接种量（v/v）接种于50 mL的LB/Amp，2 %葡萄糖培养基中，37℃，220 r/min振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入0.1mM的IPTG，30℃，220 r/min振荡培养8-12h；将培养物于4℃，8000rpm，离心20 min收集菌体沉淀。重悬细胞于5mL 预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心20min取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的纳米抗体。

实施例5.  纳米抗体的耐酸碱实验

（1）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至10 μg/mL，100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

 （2）活性检测

将纳米抗体分别用pH 5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的PBS稀释至10 μg/mL，取100μL加入步骤（1）处理好的板条中，37℃孵育1小时。加入1:3000稀释HRP标记的抗His二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。比较不同pH条件下的吸光度值，得出纳米抗体的耐酸碱能力。

实施例6.  纳米抗体耐热实验

（1）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4) 将抗DON单克隆抗体稀释至10 μg/mL，100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

（2）活性检测

用10 mM PBS (pH 7.4) 将纳米抗体稀释至10 μg/mL，分别置于50，60，70，80和90℃水浴5min，恢复到室温后，再分别取100μL加入步骤（1）处理好的板条中，37℃孵育1小时。加入1:3000稀释HRP标记的抗His二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。比较不同温度处理条件下的吸光度值，得出纳米抗体的耐热能力。

实施例7.  纳米抗体作为竞争抗原在ELISA中的应用

 (1) 样品提取

称取1g 样品（谷物及其相关制品），加入5 毫升PBS（pH 7.4）溶液，充分振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤，取1毫升滤液加入1毫升 PBS混匀后，即为样品提取液，待用。

（2）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4)将抗DON单克隆抗体稀释至10 μg/mL， 4℃包被过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次，加入300μL的5%脱脂奶粉， 37℃封闭1小时后，用PBST洗板6次待用。

（3）标准曲线的建立

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μL展示有纳米抗体的噬菌体（1.0×10¹¹ cfu）/VHH蛋白表达物（10μg/mL）及一系列不同浓度的50 μL DON标准品，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/抗VHH的组氨酸标签二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以DON浓度对数为横坐标，结合率（加入DON的孔的OD₄₅₀/未加入DON的孔的OD₄₅₀×100%）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

（4）样品的检测

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μL展示有纳米抗体的噬菌体（1.0×10¹¹ cfu）/纳米抗体蛋白表达物（10μg/mL）及待测样品提取液，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/抗VHH的组氨酸标签二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中DON的含量。

实施例8.  纳米抗体作为固相包被抗原在ELISA中的应用

(1) 样品提取

称取1g 样品（谷物及其相关制品），加入5 毫升PBS（pH 7.4）溶液，充分振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤，取1毫升滤液加入1毫升 PBS混匀后，即为样品提取液，待用。

（2）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4) 将表达的纳米抗体稀释至10μg/mL，100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

（3）标准曲线的建立

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μL 抗DON单克隆抗体（5μg/ml）和一系列不同浓度的50 μL DON标准品，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以DON标准品浓度对数为横坐标，结合率（加入DON的孔的OD₄₅₀/未加入DON的孔的OD₄₅₀×100%）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围为5.02-80.37 ng/mL，IC₅₀为19.97 ng/mL（图2）。

（4）样品的检测

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μL 抗DON单克隆抗体（5μg/ml）和待测样品提取液，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中DON的含量。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  南昌大学

 

<120>  抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体

 

 

<130>  2014

 

<160>  9   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  115

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

<400>  1

 

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1               5                10               15     

 

 

Ser Leu Gly Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

            20               25               30         

 

 

Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

        35                40               45             

 

 

Ala Ser Ile Ser Arg Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Gln

    50               55               60                 

 

 

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65                70               75               80

 

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Asn

                85               90               95     

 

 

Ile Arg Thr Pro Trp Ser Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

           100              105              110        

 

 

Val Ser Ser

        115

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

 

<220>

<221>  Domain

<222>  (1)..(25)

<223>  FR1

 

<400>  2

 

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1               5               10                15     

 

 

Ser Leu Gly Leu Ser Cys Ala Ala Ser

            20               25 

 

 

<210>  3

<211>  8

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

 

<220>

<221>  Domain

<222>  (1)..(8)

<223>  CDR1

 

<400>  3

 

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1               5              

 

 

<210>  4

<211>  17

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

 

<220>

<221>  Domain

<222>  (1)..(17)

<223>  FR2

 

<400>  4

 

Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1               5               10                 15      

 

 

Ser

   

 

 

<210>  5

<211>  7

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

 

<220>

<221>  Domain

<222>  (1)..(7)

<223>  CDR2

 

<400>  5

 

Ile Ser Arg Ser Gly Thr Thr

1               5          

 

 

<210>  6

<211>  38

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

 

<220>

<221>  Domain

<222>  (1)..(38)

<223>  FR3

 

<400>  6

 

Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1               5               10               15     

 

 

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

            20                25               30         

 

 

Thr Gly Val Tyr Tyr Cys

        35             

 

<210>  7

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

 

<220>

<221>  Domain

<222>  (1)..(9)

<223>  CDR3

 

<400>  7

 

Asn Ile Arg Thr Pro Trp Ser Asp Ser

1               5                   

 

 

<210>  8

<211>  11

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

 

<220>

<221>  Domain

<222>  (1)..(11)

<223>  FR4

 

<400>  8

 

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1               5               10 

 

 

<210>  9

<211>  345

<212>  DNA

<213>  Lama pacos

 

<400>  9

cagttgcagc tcgtggagtc gggaggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgggactc     60

 

tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt agctatgcct tgggctggtt ccgccaggct    120

 

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcaagt attagccgga gtggtaccac atactatgaa    180

 

gactccgttc agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg    240

 

caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg ggcgtctatt actgtaatat tcgcacccca    300

 

tggtctgatt cctggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcg                    345

Claims (6)

1.可特异性结合抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的纳米抗体，其特征在于具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述纳米抗体的氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO. :9。

3.如权利要求1所述纳米抗体的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。

4.权利要求1所述纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于该纳米抗体以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

6.如权利要求4所述应用，其特征在于该纳米抗体在制备DON模拟物试剂中的应用。