CN109762065A - 针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种针对河流弧菌的单域重链抗体和多肽，其具有所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，可用于免疫检测、抗原富集纯化等领域。本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和性、特异性、稳定性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

Description

针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72

技术领域

本发明涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别是针对河流弧菌的单域重链抗体或多肽。

技术背景

单域抗体是指由普通抗体可变区(VH或VL)组成的基因工程抗体。单域重链抗体(又称为纳米抗体，VHH抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)是指仅由重链抗体(heavy-chain antibody)可变区(Variable region)组成的基因工程抗体，其中，重链抗体(heavy-chain antibody)是一种存在于骆驼、鲨鱼等动物体内天然缺失轻链的抗体。单域重链抗体具有分子量小、渗透性好等特点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。

河流弧菌(Vibrio fluvialis，VF)是海洋中一种常见的条件致病菌，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌。它是一种革兰氏阴性兼性厌氧细菌，可引起人类河弧菌肠炎，临床症状与霍乱样腹泻极为相似。河弧菌于1975年首次分离于巴林一名腹泻患者粪便中，同年从孟加拉国的腹泻患者粪便中及英国的海产品和水产品中也分离得到。河流弧菌能够对免疫功能健全或艾滋病患者引起多种疾病，如菌血症、肠道感染和急性腹泻等，由这类病原菌引起的疾病还包括化脓性胆管炎、腹膜炎。古巴的一项研究表明河流弧菌是不同外肠道样品中主要病原菌之一。

目前，已有针对河流弧菌的单克隆抗体的公开报道，但现有的针对河流弧菌的单克隆抗体与单域重链抗体相比，存在生产成本相对较高，制备过程复杂等缺点。单域重链抗体具有分子量小、易表达等性质，显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供针对河流弧菌的单域重链抗体(包括含有所述单域重链抗体全部或部分功能区域的蛋白质或多肽)及其氨基酸序列，其可以被用于制备检测河流弧菌的试剂和工具。

本发明提供一种针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72，该单域重链抗体具有如SEQID NO：8所示的氨基酸序列。

上述氨基酸序列通过标准化的氨基酸序列编号法进行IMGT编号和结构域的划分，如图1所示。

本发明所提供的单域重链抗体分别包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)。SEQ ID NO：8中，框架区(FR1-FR4)分别选自1～34，43～59，68～105，123～133氨基酸序列，互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自35～42，60～67和106～122氨基酸序列，其中，FR1序列如SEQ ID NO：1所示，FR2序列如SEQ ID NO：2所示，FR3序列如SEQ ID NO：3所示，FR4序列如SEQ ID NO：4所示，CDR1序列如SEQ ID NO：5所示，CDR2序列如SEQ ID NO：6所示，CDR3序列如SEQ ID NO：7所示(见序列表或图1)。互补决定区主要负责抗原的识别，框架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。本发明还涉及编码针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72氨基酸序列的核苷酸，其序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明还提供一种针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计特异性引物，通过PCR技术从羊驼来源的cDNA文库中扩增；

(2)将得到的PCR产物的基因片段克隆到表达载体pET25b-CTB，并将该充足质粒转化宿主细胞，诱导表达针对河流弧菌的纳米抗体Nb72，并对其纯化。

本发明还提供一个核酸分子，该核酸分子是编码SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。

本发明还提供一个核酸分子，该核酸分子是编码SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9部分结构域，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。

本发明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。

本发明还提供一种组合物，该组合物包含所述核酸序列和任选载体。该组合物可以用于诊断等多方面用途中。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。

本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。

本发明还提供一种富集河流弧菌的方法，其特征是含有上述蛋白质或多肽。基于本发明提供的蛋白质或多肽与河流弧菌结合的能力，建立河流弧菌的富集方法，建立的富集方法可与免疫荧光定量PCR结合用于对河流弧菌进行快速检测。

本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

本发明所叙述的一些术语具有如下含义：

结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。

IMGT编号：IMGT数据库(The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenman，F.，Q.Kaas，et al.(2010).”IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign：adatabaseand a tool for immunoglobulins or antibodies，T cell receptors，MHC，IgSF and MhcSF.”Nucleic Acids Res38(Database issue)：D301-307.Lefranc，M.P.，C.Pommie，et al.(2003).”IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cellreceptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains“Dev comp Immunol27(1)：55-77.)中的描述。

本发明的有益效果在于：

本发明制备的单域重链抗体具有分子量小、易表达等优良性质，同时，相对与传统的单克隆抗体的制备，其生产成本相对较低，制备过程较为简单，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1氨基酸编号及结构与示意图

图2间接ELISA鉴定Nb72结合活性及特异性

图3为Nb72单域重链抗体表达鉴定图，左边泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1为镍柱纯化后蛋白。

具体实施方式

下面通过单域重链抗体(多肽)的制备、分析及应用，对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。

应用实例1

抗河流弧菌单域重链抗体的淘选与鉴定

采用固相淘选的方法从驼源天然抗体噬菌体展示文库中淘选针对河流弧菌的单域重链抗体。利用热酚水法提取河弧菌脂多糖，以其为靶标淘选得到单域重链抗体。具体的单域重链抗体淘选包括如下步骤：

将提取的河弧菌脂多糖使用无菌的磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)稀释到100μg/mL，将其加入酶标板孔中，100μL/孔，4℃包被过夜，首轮淘选包被3孔，以后的淘选包被1孔，吸出包被液，PBS洗板3次。在每轮淘选过程中，均以1％明胶作为封闭剂，37℃封闭2h，PBS洗板3次，加入噬菌体抗体库100μL(约含2×10¹¹PFU)，37℃孵育1.5h，首轮淘选只使用PBS洗涤，后面各轮淘选使用PBST(含1％Tween-20)洗板3次(逐轮增加1次)，再用PBS洗板3次(逐轮增加2次)。以100μL甘氨酸-盐酸洗脱液(Gly-HCl，pH2.2)洗脱结合的噬菌体，用20μL的Tris-HCl(pH9.1)中和洗脱物，取10μL用于滴度测定，其余洗脱物进行扩增，并将扩增产物用于下一轮淘选。

经过三轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑选的单克隆进行救援，分别得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒，用噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆。当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上，判为阳性克隆孔。

表1间接phage-ELISA加样表

将ELISA阳性克隆送测序公司进行序列测定，得到抗河流弧菌单域重链抗体噬菌体阳性克隆的插入片段的DNA序列，其中Nb72核苷酸序列SEQ ID NO：9所示，Nb72氨基酸序列SEQ ID NO：8所示，Nb72分别包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)，框架区(FR1-FR4)分别选自1～34，43～59，68～105，123～133氨基酸序列，互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自35～42，60～67和106～122氨基酸序列，其中，FR1序列如SEQ ID NO：1所示，FR2序列如SEQ ID NO：2所示，FR3序列如SEQ ID NO：3所示，FR4序列如SEQ ID NO：4所示，CDR1序列如SEQ ID NO：5所示，CDR2序列如SEQ ID NO：6所示，CDR3序列如SEQ ID NO：7所示。具体见下表。

应用实例2

抗河流弧菌的单域重链抗体在大肠杆菌中的表达。

编码抗河流弧菌的DNA片段的获得：设计特异性引物，针对阳性克隆的纳米抗体序列进行扩增。将得到的PCR产物的基因片段克隆到表达载体pET25b-CTB，并将该充足质粒转化宿主细胞，经测序验证后，命名为pET25-CTB-Nb72。

重组质粒pET25-CTB-Nb72转化到大肠杆菌Rosetta中，并挑取单菌落进行诱导表达。将单菌落接入含5mL液体LB培养基的试管中，37℃、220rpm/min振荡培养过夜；以1％的接种量将其转接到150mL的LB液体培养基中，37℃、220rpm/min振荡培养至OD约为0.5后，加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃、180rpm/min诱导过夜。

菌液通过6000rpm/min，离心5分钟得到菌体，菌体使用无菌PBS洗涤3次，并用15mL无菌PBS进行重悬菌体，冰上超声破碎菌体，超声破碎条件为200W，破碎2s，间歇3s，共40个循环，在4℃下对细胞裂解液进行离心，离心条件为8000rpm/min，时间为10min，取上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图3。

通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导时间、诱导温度及IPTG浓度等)，可以进一步提高目的蛋白(单域重链抗体)的表达量，为大量制备抗河流弧菌的单域重链抗体提供了途径。

应用实例3

抗河流弧菌单域重链抗体的突变与亲和力的提高

设计特异性引物，以重组质粒pET25-CTB-Nb72为模板，利用易错PCR进行随机突变，总共进行4组，每组的体系不同，调整了dNTP的浓度，每管100μL体系，如表1所示。将4组易错PCR产物合并，用DNA片段回收试剂盒回收。取部分回收产物连接到载体pHEN-1，电转化大肠杆菌TG1感受态细胞中，涂布5块含氨苄青霉素平板，每块平板上加入1mL 2×YT培养基，用灭菌的药匙将细菌洗脱，将所有平板的细菌悬液合并，混匀。取5mL细菌悬液转移至一50mL的离心管中，用含抗生素和葡萄糖的培养基调整OD600至0.3，37℃振荡培养1h；按phage：cell＝20：1加入辅助噬菌体，37℃振荡培养2h；离心弃上清，用50mL培养基轻轻悬浮细胞，30℃振荡培养8h；10000g离心20min，将上清转移至10mL离心管中，加入1/5体积的PEG/NaCl，充分混匀，4℃沉淀过夜；离心弃上清，加入PBS溶液重悬噬菌体，此即为Nb72随机突变噬菌体文库；淘选亲和力提高的突变蛋白按应用实例1中的方案进行，以脂多糖为包被抗原时ELISA反应的OD值高于噬菌体展示的Nb72时即为阳性克隆，将阳性克隆送测序公司进行序列测定，得到突变的DNA序列，将其翻译成蛋白质序列与Nb72序列进行比较。

表1易错PCR反应体系

序列表

<110> 南昌大学

<120> 针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 2

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val

20 25 30

Ala Ser

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 3

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 4

Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 1

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 5

Gly Arg Ala Phe Arg Arg Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 6

Ile Asn Trp Ser Gly Arg Asn Thr

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 7

Ala Gln Ser Arg Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Pro Ala Gly Tyr Asn

1 5 10 15

Ile

<210> 8

<211> 133

<212> PRT

<213> 羊驼(Lama pacos)

<400> 8

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val

20 25 30

Ala Ser Gly Arg Ala Phe Arg Arg Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln

35 40 45

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Asn Trp Ser Gly

50 55 60

Arg Asn Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys

85 90 95

Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gln Ser Arg Ala Ile Thr

100 105 110

Gly Gly Thr Val Pro Ala Gly Tyr Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 9

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatggccca tggcccaggt gcagctcgtg gagtcaggcg gaggattggt gcaggctggg 60

ggctctctga gactctcctg tgtagcctct ggacgcgcct ttcgtagata taccatgggc 120

tggttccgcc aggctccagg gaaggagcgt gagtttgtag caacaattaa ctggagtggt 180

cgtaatacag cgtatgccga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacagccgc 240

aaaaacaccg cgtatctcca aatgaacagc ctgaaacctg aagatacggc cgtttattat 300

tgtgcacaat cgcgagcgat tacaggtggc acagttcccg ccggttataa catctggggc 360

caggggaccc aggtcaccgt ctcctcagaa cccaagacac caaaaccaca agcggccgc 419

Claims (8)

1.一种针对河流弧菌的纳米抗体Nb72，其特征在于，所述针对河流弧菌的纳米抗体Nb72包含框架区和互补决定区，其中，框架区包括如下4段氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3和SEQ ID NO：4所示的FR4，互补决定区包括如下3段氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2和SEQ IDNO：7所示的CDR3。

2.一种针对河流弧菌的纳米抗体Nb72，其特征在于，述针对河流弧菌的纳米抗体Nb72具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

3.一种针对河流弧菌的纳米抗体Nb72，其特征在于，该针对河流弧菌的纳米抗体Nb72。一种将SEQ ID NO：8中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有针对河流弧菌结合活性的由SEQ ID NO：8衍生的与SEQ ID NO：8具有90％以上同源性的氨基酸序列。

4.一种编码如权利要求1-3中任意一项所述的针对河流弧菌的单域重链抗体Nb71氨基酸序列的核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

5.一种组合物，其特征在于，包含如权利要求3所述的核苷酸和至少一种的任选载体。

6.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求5所述的组合物。

7.如权利要求1-3中任意一项所述的针对河流弧菌单域重链抗体Nb72的应用，其特征在于，可应用于建立富集及检测河流弧菌的方法。

8.如权利要求1-3中任意一项所述的针对河流弧菌的纳米抗体Nb72的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计特异性引物，通过PCR技术从羊驼来源的cDNA文库中扩增；

(2)将得到的PCR产物的基因片段克隆到表达载体pET25b-CTB，并将该充足质粒转化宿主细胞，诱导表达针对河流弧菌的纳米抗体Nb72。