CN102757481A - 金黄色葡萄球菌肠毒素b的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开金黄色葡萄球菌肠毒B的功能表位¹⁹⁵SFWYDMMP²⁰²、¹²HKSSKFTGL²⁰、¹⁸TGLMEN²³和⁴³QFLFYFIY⁵¹、与其特异性结合的单克隆抗体4A3和3E2及其在制备治疗SEB诱导中毒性休克综合症药物中的应用。

Description

金黄色葡萄球菌肠毒素B的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了4种SEB蛋白的功能表位、与这个表位特异性结合的单克隆抗体及其在治疗SEB诱导的中毒性休克综合症中的应用。 

背景技术

革兰阳性(G)菌脓毒症的发病率逐年上升，其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是烧伤创面感染和急性肝功能衰竭的重要病原菌。由于其致病因素复杂、耐药性不断增强，特别是中间型抗万古霉素金黄色葡萄球菌的出现，金黄色葡萄球菌感染所致脓毒症的防治已成为现代创伤外科和危重病医学面临的棘手难题之一。近年发现，造成医院感染的耐青霉素金黄色葡萄球菌，80％以上产生金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin)。个别医院分离株几乎100％产肠毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素，尤其是肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B，SEB)因其“超抗原”特性以及在中毒性休克综合征发病中的特殊意义而倍受关注。 

SEB属于超抗原家族，这是一类具有多种免疫活性的蛋白分子。与普通抗原相比，细菌毒素超抗原有显著不同的特点：只需极低浓度(1-10ng/ml)即可刺激强烈的初次免疫应答，可激活的T淋巴细胞数量比普通抗原多达10³-10⁵倍；不经抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)加工处理，可以完整的蛋白分子形式直接与抗原提呈细胞膜上的MHC II类分子及T细胞受体(T cell receptor， TCR)Vβ区特异性结合，刺激T细胞增殖；结合部位不在抗原肽结合的沟槽内，而在沟槽外；T细胞对超抗原的反应不受MHC 1I类分子的限制等。SEB可直接与MHC II类分子及TCRVβ链结合(Swaminathan S，Furey W，Pletcher J and Sax M.Crystal structure of staphylococcal enterotoxin B，a superantigen.Nature 1992；359：801-6)，刺激机体T细胞大量增值，从而释放大量的细胞因子。TCRVβ与SEB结合后，引起T细胞大量扩增并释放过量细胞因子，如IL-2，IL-6，TNF-β，INF-γ和TNF-a，这些细胞因子的过量扩增导致T细胞衰竭，并引发严重的中毒性休克症状。 

SEB是一种细菌外毒素，为单一多肽链，耐酸，耐热。在沸水中，几分钟不变性，在冰点能保存一年以上。编码SEB的entB基因由1709个碱基对组成(Shafer WM，Iandolo JJ.Chromosomal locus for staphylococcal enterotoxin B.Infect Immun 1978；20：273-8)。起始密码子ATG位于244bp处，TAG终止密码在在1042bp处，开放阅读框架共798bp，编码266个氨基酸。分子量约为28366道尔顿。 

SEB的二级结构含29残基α螺旋，71-β折叠，88-β-转角，55不规则构象。最稳定的结构是二硫桥连周围的β-折叠，有一半以上二硫桥与蛋白质三维结构和肽链B一构象有关。经x线衍射分析SEB的晶体结构显示，SEB分子由两个结构域组成[2]。结构域1(N末端)由氨基酸1-120组成，结构域2(C末端)由氨基酸127-239组成，两者之间有6个氨基酸组成的桥。结构域1含有3个β折叠层，由β1、β4和β5组成，也含有螺旋α1、α2、α3和1个二硫键。两个折叠层形成一个圆柱状管。此外SEB氨基末端结构域内存在一个二硫环，二硫环内和附近的氨基酸残基与毒素的致吐效应有关，其确切机制尚不清楚。结构域2由两部分组成：第1部分由α4和α5螺旋及β8和β11两个短链组成，第2部分由β6、β7、β9、β10和β12链组成。 SEB属于超抗原，不需要APC的加工处理，以完整的蛋白质分子直接与在MHC II类分子的α1结构域和TCR的β链V区结合，从而刺激T细胞活化增殖，同时释放大量细胞因子。SEB通过与MHC II类分子和TCR形成一个三元复合物激活T细胞，对T细胞的激活效率比普通抗原高10³-10⁵倍，因此，微量的SEB就能诱导机体产生免疫应答。SEB引起T细胞早期的活化过程，类似普通抗原与TCR的结合，包括磷脂酶C的活化，PKC的激活，从而使细胞内Ca²⁺浓度增高。这些早期活化的过程诱导淋巴因子的产生或淋巴因子受体表达，释放大量细胞因子。SEB是NF-κB的强激活剂。NF-κB的拮抗剂可以减弱金葡菌SEB诱导的T细胞激活。 

SEB对不同的白细胞抗原分子有不同的亲和力，亲和力强弱依次为HLA-DR-DP。SEB与MHC II类分子的α1结构域和SEB分子的N末端结构域之间，以低亲和力结合。SEB和HLA-DR1间的主要作用是SEB的谷氨酸(Glu)67，酪氨酸(Tyr)89和赖氨酸(Lys)39HLA-DR1的间形成的盐桥作用和SEB疏水端的侧链与HLA-DR1的α1螺旋和β片层间区域相互作用。SEB与MHC II作用位点还涉及到疏水区域的亮氨酸(Leu)45和急性区域谷氨酸(Glu)67，酪氨酸(Tyr)89和酪氨酸(Tyr)115。SEB与TCRVβ相互作用的氨基酸残基是：结构域1的天冬氨酸(Asn)60，酪氨酸(Tyr)90和酪氨酸(Tyr)91。结构域2的苏氨酸(Thr)18，甘氨酸(Gly)19，亮氨酸(Leu)20，谷氨酸(Glu)22，天冬氨酸(Asn)23，酪氨酸(Tyr)26，天冬酰胺(Asn)60，酪氨酸(Tyr)90，酪氨酸(Tyr)91苯丙氨酸(Phe)176和谷氨酸(Glu)210。点突变这些氨基酸中任何关键区域，都破坏SEB与MHC II和TCR的结合。 

目前针对SEB诱导的中毒性休克尚无有效的方法在人体中应用。静脉输注混合人体血清在一定程度上能缓解症状，但由于其来源的有限性和效果的多变 性，它的应用受到的很大限制(LeClaire RD，Bavari S.Human antibodies to bacterial superantigens and their ability to inhibit T-cell activation and lethality.Antimicrob Agents Chemother 2001；45：460-3；Darenberg J，Soderquist B，Normark BH and Norrby-Teglund A.Differences in potency of intravenous polyspecific immunoglobulin G against streptococcal and staphylococcal superantigens：implications for therapy of toxic shock syndrome.Clin Infect Dis 2004；38：836-42)。有多个研究组也获得了一些小鼠抗SEB的中和性单克隆抗体(Hamad AR，Herman A，Marrack P and Kappler JW.Monoclonal antibodies defining functional sites on the toxin superantigen staphylococcal enterotoxin B.J Exp Med 1994；180：615-21；Pang LT，Kum WW and Chow AW.Inhibition of staphylococcal enterotoxin B-induced lymphocyte proliferation and tumor necrosis factor alpha secretion by MAb5，an anti-toxic shock syndrome toxin 1 monoclonal antibody.Infect Immun 2000；68：3261-8)，但只能达到部分的中和保护效果(63％)。在SEB诱导的小鼠中毒性休克综合症模型中，SEB的中和性肽段(Arad G，Levy R，Hillman D and Kaempfer R.Superantigen antagonist protects against lethal shock and defines a new domain for T-cell activation.Nat Med 2000；6：414-21)和T细胞受体拮抗剂展示了较好的中和保护效果(Buonpane RA，Churchill HR，Moza B，et al.Neutralization of staphylococcal enterotoxin B by soluble，high-affinity receptor antagonists.Nat Med 2007；13：725-9)。此外，有MHC IIDR1区域和TCRVβ区域通过连接子构成的双特异性嵌合型抑制体，能有效阻止SEB与抗原递呈细胞上的MHC II分子和T细胞上的TCR的结合(Hong-Geller E，Mollhoff M，Shiflett PR and Gupta G.Design of chimeric receptor mimics with different TcRVbeta isoforms.Type-specific inhibition of superantigen pathogenesis.J Biol Chem 2004；279：5676-84)。但是，由于其无法清除人体内的SEB，因而有一定的局限性。 

发明内容

本发明的目的之一是公开了SEB蛋白的功能表位¹⁹⁵SFWYDMMp²⁰²、 ¹²HKSSKFTGL²⁰、¹⁸TGLMEN²³和⁴³QFLFYFIY⁵¹。 

本发明的另外一个目的是公开了与上述功能表位特异性结合的抗SEB蛋白的单克隆抗体，更具体地为4A3和3E2。 

本发明还公开了上述4A3和3E2单抗的重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8，轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.10。 

更具体地，本发明公开了抗SEB蛋白的单克隆抗体4A3和3E2，其重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8，轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.10，恒定区均为为小鼠IgG。 

本发明还公开了两种DNA分子，编码上述的抗SEB蛋白的单克隆抗体4A3和3E2。 

本发明更进一步公开了上述编码SEB蛋白单克隆抗体4A3和3E2的DNA分子其包含编码重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7和编码轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.9。 

本发明的另外一个目的是公开了上述抗SEB蛋白的单克隆抗体在制备治疗SEB诱导中毒性休克综合症药物中的应用。 

本发明所述的与本发明中公开的上述SEB蛋白功能表位特异性结合的抗 SEB蛋白的单克隆抗体4A3和3E2，包括但不限于利用重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10通过现有的分子生物学技术得到的单克隆抗体，还包括与本发明中公开的上述SEB蛋白功能表位特异性结合的利用现有的分子生物学技术可以得到的嵌合的单克隆抗体及人源化抗体。 

本发明所称SEB相关疾病有急性胃肠炎，食物中毒，中毒性休克综合症。 

具体地，本发明的申请人首先利用分子生物技术克隆SEB基因，利用原核细胞表达了SEB蛋白，并通过细胞融合-杂交瘤的方法制备了10株鼠抗SEB单克隆抗体。进一步研究了1A5、4A3、3C1和3E24株抗体的体内外中和实验，还对4A3和3E22株单克隆抗体的基因进行了克隆并测定了其序列。由于4A3和3E2抗体识别不同的抗原表位，我们采用基因工程技术构建的双特异性抗体可以同时阻断两个靶点。设计了一种新型的可同时结合TCR和MHC II结合域的双可变区的人源化抗体DVD-Ig 4A3-3E2，并在哺乳动物细胞表达系统中获得高效表达。针对SEB表面不同功能表位的双功能抗体DVD-Ig 4A3-3E2或单抗联合使用在体内外对SEB的中和活性具有显著的协同作用。抗SEB双功能抗体有潜力成为一种新的免疫治疗候选策略。 

本发明的申请人利用PBMC细胞进行了一系列实验，来验证本发明公开的鼠抗人SEB单克隆抗体1A5、4A3、3C1和3E2，对SEB刺激的PBMC细胞的增殖和细胞因子释放的抑制作用。³H掺入实验显示抗SEB抗体1A5、4A3、3C1和3E2可有效抑制PBMC的增殖，细胞因子的检测实验结果表明抗SEB抗体1A5、4A3、3C1和3E2可有效抑制SEB诱导PBMC细胞的细胞因子释放，从而说明了本发明公开的上述抗SEB抗体1A5、4A3、3C1和3E2在体外有明显的中和保护作用。 

本发明的申请人利用SEB诱导的中毒性休克综合症小鼠模型进行了一系列实验，验证本发明公开的鼠抗SEB单克隆抗体1A5、4A3、3C1和3E2能有效提高小鼠的生存率。SEB诱导的中毒性休克综合症小鼠模型的血清细胞因子检测实验结果表明抗SEB抗体可以在体内抑制细胞因子释放；相应地，作为对照的无关抗体则没有上述作用，从而说明了本发明公开的上述抗SEB抗体在体内可有效中和SEB的作用。 

本发明的申请人还利用噬菌体展示技术鉴定了抗SEB抗体1A5、4A3、3C1和3E2作用的SEB的功能表位，1A5的功能表位¹⁹⁵SFWYDMMp²⁰²，4A3功能表位为¹²HKSSKFTGL²⁰，3C1的功能表位¹⁸TGLMEN²³和3E2功能表位为 ⁴³QFLFYFIY⁵¹。进一步阐明了SEB分子的作用靶点。更具体地，本发明的申请人通过单克隆抗体抗原表位的淘选、phage clones ELISA和测序及序列分析推测出SEB的功能表位。 

本发明的申请人还利用基因工程技术构建了同时识别SEB上TCR和MHC II结合域的双功能抗体DVD-Ig 4A3-3E2。 

我们构建的该人源化DVD-Ig 4A3-3E2来源于两个特异的人源化抗体，即抗SEB的人源化单克隆抗体hu4A3和hu3E2。将hu4A3的重链可变区通过ASTKGPSVF构成的linker与hu3E2的重链可变区的N末端串联在一起构成了DVD-Ig 4A3-3E2的重链可变区，然后与抗体的Fc段连接，构建出DVD-Ig 4A3-3E2的重链基因；将hu4A3的轻链可变区通过TVAAPSVFI构成的linker与hu3E2的轻链可变区的N末端串联在一起构成了DVD-Ig 4A3-3E2的轻链可变区，然后用overlap的方法连接上CK，构建出DVD-Ig 4A3-3E2的轻链基因。将上述轻重链基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1(+)，共转染CHO细胞，western blot 检测正确表达后，挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达，收集培养上清以ProteinA凝胶层析柱纯化，SDS-PAGE检测蛋白，鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符，纯度可达90％。ELISA竞争实验表明该DVD-Ig可同时结合SEB上TCR和MHC II的结合域，且与SEB的亲合力和hu4A3与hu3E2相似，说明该DVD-Ig结构既可有原来两种抗体的特异性，又保留了母源抗体的亲合力。 

附图说明

图1.SEB原核表达纯化后的SDS-PAGE电泳图；M代表蛋白质标准分子量； 

图2.10株抗SEB单克隆抗体的亚型； 

图3.抗SEB单克隆抗体的Western blot结果； 

图4.10株抗体与SEB蛋白的相对亲和力； 

图5.抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2与SEB蛋白的亲和力常数； 

图6.SEB刺激T细胞增殖曲线； 

图7.鼠抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2对SEB诱导的T淋巴细胞增殖的抑制作用； 

图8.鼠抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2对SEB体外诱导PBMC释放细胞因子的抑制作用； 

图9.SEB诱导的中毒性休克综合症小鼠模型； 

图10.鼠抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2在SEB诱导的中毒性休克综合症模型中，能有效提高小鼠生存率； 

图11.鼠抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2对SEB体内诱导的小鼠血清中细胞因子的抑制作用； 

图12.抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2淘选三轮后的产出效率比较图； 

图13.Align X软件序列分析抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2的结合表位结果； 

图14.抗SEB单抗1A5、4A3、3C1和3E2SEB结合的表位模式图； 

图15.DVD-Ig抗体结构设计图； 

图16.DVD-Ig的性质和结合活性 

图17.DVD-Ig对SEB诱导的T淋巴细胞增殖的抑制作用； 

图18.DVD-Ig对SEB体外诱导PBMC释放细胞因子的抑制作用； 

图19.DVD-Ig在SEB诱导的中毒性休克综合症模型中，能有效提高小鼠生存率； 

图20.DVD-Ig对SEB体内诱导的小鼠血清中细胞因子的抑制作用； 

具体实施方式

以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press. 

实施例抗SEB单克隆抗体的制备 

实验例1.SEB基因的克隆 

参照GENEBANK提供的SEB的资料及序列，合成引物：SEB引物有义4Tsense-1：5′-ATT 

T ATGTATAAGCGTCTGTTT-3′；4Tantisene：5′-ATT FTACTTTTTCTT GGTGGTCAG-3′。扩增SEB基因片段，通过凝胶回收试剂盒(上海生工)回收片段后，用限制型内切酶Sal I和Not I酶切，凝胶电泳回收后，与经Sal I和Not I双酶切的质粒载体连接，转化大肠杆菌DH5α后，筛选获得有插入片段的阳性克隆。DNA序列测定确认，SEB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

实验例2.SEB的原核细胞表达纯化 

将实施例1所得的序列正确的SEB基因片段用相应的限制性内切酶酶切回收后，装入pGEX-4T-2质粒中。转化DH5α感受态细胞，铺LB-Amp平板。从平板上挑取单克隆进行Sal I和Not I双酶切鉴定，阳性克隆转入BL21(DE3)工程菌中，做SEB诱导表达，经GST亲和层析柱纯化后得到GST-SEB融合蛋白，用EK蛋白酶酶切，GST亲和层析回收流穿液，去除GST，SDS-PAGE证实得到SEB纯蛋白。 

结果见附图1。 

实验例3.鼠抗SEB单克隆抗体的筛选与制备 

100μg纯化的SEB和等体积弗氏佐剂乳化后，腹腔注射BALB/C小鼠免疫接种，每二周后加强免疫一次，剂量均同第一次免疫，共免疫3次后，选取血清中抗SEB抗体滴度较高小鼠，分离其脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG法，将小鼠脾脏淋巴细胞与NS-1细胞进行细胞融合。用5μg/ml SEB包被96孔板，采用ELISA法反复筛选获得可稳定表达抗SEB抗体的杂交瘤细胞株10 株。大量扩增单克隆细胞株，腹腔注射BALB/C小鼠5×10⁶/只，10天左右开始收集小鼠腹水，利用Protein A柱，亲和层析纯化抗SEB的单克隆抗体。ELISA试验结果显示10株抗体的亚型均为IgG/κ，结果见附图2。Western blot试验结果显示，10株小鼠抗SEB单克隆抗体与SEB蛋白均有反应。结果见附图3。 

实验例4.鼠抗SEB单克隆抗体的相对亲和力测定 

以1μg/ml SEB蛋白包被96孔酶联板(NaCO₃盐包被液，pH 9.6)，每孔100μl，4℃孵育过夜。倾去包被液，加入封闭液10％的脱脂奶粉，4℃封闭2h。倾去封闭液，PBST洗6次。梯度稀释的10株单克隆抗体，每孔100μl，37℃，1h。倾去液体，PBST洗6次。每孔加入羊抗鼠HRP抗体(1∶12000)100μl，室温孵育1h。按照上述方法洗涤后，加入TMB显色，测定A₄₅₀nm处的吸光值。通过ELISA试验结果示，10株抗SEB单克隆抗体都能与SEB抗原结合，但它们之间的结合力有着较大差别，其中1A5、4A3、3C1和3E24株单克隆抗体与SEB的相对亲和力高于其他抗体。结果见附图4.

实验例5.1A5，4A3，3C1和3E24株抗体亲和力常数测定 

SEB蛋白包被：装入新的Chips，50nM的SEB蛋白配置于不同pH的20mMNaAC溶液中(pH4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)，分别注射于Phamacia仪器BIACORE 3000，流速10μl/min，回应(response)最强的包被条件为最佳抗原与Chips结合的条件。发现对照抗原和SEB的包被与Chips结合的最佳pH是4.5。 

Chips的再生：分别用100mM Glycine-HCL(pH2.2)、0.1mM HCL(pH2.2)及6M盐酸胍作为再生溶液摸索Chips再生的最佳条件，流速30μl/min，观察基线是否稳定，以各点Responses之差小于5的再生系统为最佳系统。发现6M盐酸胍条件下基线最稳定，各点Responses之差小于5，为最佳再生系统。 

样品亲和活性的测定：单克隆抗体样品经系列稀释成不同浓度(1μM，800nM，400nM，200nM，100nM，50nM，25nM)分别注入BIACORE仪器，流速30μl/min，再生溶液为6M盐酸胍，再生后稳定时间为3min，注入时间2min，解离时间为10min，同时以BSA作为参照。 

4株单克隆抗体经不同系列稀释浓度(1μM，800nM，400nM，200nM，100nM，50nM，25nM)分别注入BIACORE仪器，根据抗体与抗原之间相互作用响应值，利用软件BIAevaluation 3.1对其相应曲线进行拟合，测得4株单克隆抗体的亲和常数见附图5。4株单克隆抗体与SEB的亲和力均在nM水平，它们之间无显著差异。 

实施例抗SEB单克隆抗体的体外实验 

实验例1SEB刺激T细胞增殖实验 

外周血单核细胞的分离和纯化(PBMC)的纯化。无菌采取区静脉血6ml，用负压采血管，立即混匀防止血液凝固。加入等体积的无菌PBS，等倍稀释血液，提高分离效果。加入温浴好的淋巴细胞分离液(分离液∶混合液＝2∶3)于15ml离心管，管壁倾斜45度，缓慢加入血液混合液，注意保持两者界面清晰。室温2000rpm，20min(不开刹车)。用吸管将单核细胞层抽出，到新的15ml离心管。离心后管内分为四层：上层为血浆，血液和血小板；下层为红细胞和粒细胞；中间层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位灰白层即单个核细胞层。PBMC悬液用5倍体积的无血清1640洗涤2次，分别以2000rpm，1500rpm室温离心10min，可以去掉大部分混杂的血小板。用含10％FBS 1640培养基定容细胞，计数细胞后调整细胞浓度1×10⁶cells/ml。重悬细胞铺倒96孔细胞培养板，1×10⁵ cells/well含10％FBS 1640培养基。加入各种浓度SEB蛋白，37℃，5％CO₂，培养72h。加1μCi[³H]thymidine(体积50μl)，18h。培养结束后，离心吸去上清液，用200μl的预冷的PBS洗涤2次，2000rpm，10min。用多头细胞收集仪收集样品，用玻璃纤维滤纸抽洗至少2次，减压抽滤，依次以生理盐水，10％三氯醋酸(若有颜色物质用30％H₂O₂)和无水乙醇。取出滤膜，排列好，置于干燥箱中，60-80℃，30min烘干。对号剪下各个滤膜片，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中。闪烁瓶暗处放置15min。β液闪仪计数测定放射性cpm值。 

实验结果见图6：表达纯化的SEB可以激活T淋巴细胞并刺激T淋巴细胞增殖，具有浓度依赖性，随着SEB浓度的升高，T细胞的扩增也随之增强，SEB浓度为0.1ng/ml时，T细胞有明显增殖反应。 

实验例2抗体抑制SEB诱导的T细胞增殖 

外周血单核细胞的分离和纯化(PBMC)的纯化。无菌采取区静脉血6ml，用负压采血管，立即混匀防止血液凝固。加入等体积的无菌PBS，等倍稀释血液，提高分离效果。加入温浴好的淋巴细胞分离液(分离液∶混合液＝2∶3)于15ml离心管，管壁倾斜45度，缓慢加入血液混合液，注意保持两者界面清晰。室温2000rpm，20min(不开刹车)。用吸管将单核细胞层抽出，到新的15ml离心管。离心后管内分为四层：上层为血浆，血液和血小板；下层为红细胞和粒细胞；中间层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位灰白层即单个核细胞层。PBMC悬液用5倍体积的无血清1640洗涤2次，分别以2000rpm，1500rpm室温离心10min，可以去掉大部分混杂的血小板。用含10％FBS 1640培养基定容细胞，计数细胞后调整细胞浓度1×10⁶cells/ml。重悬细胞铺倒96孔细胞培养板，1×10⁵cells/well含10％FBS 1640培养基。SEB蛋白与4株单克隆抗体孵育2h，抗体 做梯度稀释。SEB与抗体混合物，加到96孔PBMC细胞培养的相应孔中，37℃，5％CO₂，培养72h。加1μCi[³H]thymidine(体积50μl)，18h。培养结束后，离心吸去上清液，用200μl的预冷的PBS洗涤2次，2000rpm，10min。用多头细胞收集仪收集样品，用玻璃纤维滤纸抽洗至少2次，减压抽滤，依次以生理盐水，10％三氯醋酸(若有颜色物质用30％H₂O₂)和无水乙醇。取出滤膜，排列好，置于干燥箱中，60-80℃，30min烘干。对号剪下各个滤膜片，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中。闪烁瓶暗处放置15min。β液闪仪计数测定放射性cpm值。 

实验结果见图7，4株抗体抑制SEB诱导的T细胞增殖具有浓度依赖性，即使抗体浓度低至0.005ng/ml，其抑制效率与对照抗体相比仍有显著差异。其中3E2，3C1和4A3抑制T细胞增殖的作用强于1A5抗体。 

实验例3抗体对SEB体外诱导PBMC释放细胞因子的抑制作用 

外周血单核细胞的分离和纯化(PBMC)的纯化。无菌采取区静脉血6ml，用负压采血管，立即混匀防止血液凝固。加入等体积的无菌PBS，等倍稀释血液，提高分离效果。加入温浴好的淋巴细胞分离液(分离液∶混合液＝2∶3)于15ml离心管，管壁倾斜45度，缓慢加入血液混合液，注意保持两者界面清晰。室温2000rpm，20min(不开刹车)。用吸管将单核细胞层抽出，到新的15ml离心管。离心后管内分为四层：上层为血浆，血液和血小板；下层为红细胞和粒细胞；中间层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位灰白层即单个核细胞层。PBMC悬液用5倍体积的无血清1640洗涤2次，分别以2000rpm，1500rpm室温离心10min，可以去掉大部分混杂的血小板。用含10％FBS 1640培养基定容细胞，计数细胞后调整细胞浓度1×10⁶cells/ml。重悬细胞铺倒48孔细胞培养板，5×10⁵ cells/well含10％FBS 1640培养基，总体积为：500μl。SEB和mAb混合物，加到48孔板对应孔中。37℃，7％CO₂，培养到48h收集细胞上清液。吸取上清液到1.5ml离心管，1400rpm，5min离心，上清转移到1个新的离心管，-80℃保存，待测细胞因子时取出。 

血清中细胞因子检测：每孔各加入标准品(TNF-α，INF-γ和IL-2)或待测样品(平分成3份)100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，120min。用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。每孔加入第一抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，60min。洗板同前。每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，30min。每孔加入底物工作液100μl，置37℃，暗处反应15min。每孔加入100μl终止液。30min内用酶标仪在A₄₅₀nm处测吸光值。 

实验结果见图8，4株抗体均可以抑制SEB诱导PBMC细胞的细胞因子释放，其中3E2，3C1和4A3对TNF-α，INF-γ和IL-2抑制作用达到60％，而1A5仅有50％的抑制效果，这与抗体抑制PBMC细胞增殖的实验结果一致。提示3E2，3C1和4A3比1A5有较强的中和保护作用。 

实施例抗SEB单克隆抗体体内实验 

实验例1SEB诱导的中毒性休克综合症模型 

选取6-8周，雌性，Balb/c小鼠，每只Balb/c小鼠腹腔注射20mg的D-GalN，溶于PBS溶液，总体积200μl。随后，注射各个浓度比例混合的SEB与LPS的混合物，溶入PBS溶液，总体积300μl。每组5只小鼠。观察72h，并记录小鼠的死亡数。实验处理组如下表： 

实验结果见图9，通过不同剂量的比较和统计，确定了中毒性休克综合症的半数致死剂量是20mg D-GalN，0.001ng LPS和2μg SEB(图10)。为体内试验提供了参考依据。 

实验例2抗SEB单克隆抗体对SEB诱导的小鼠的保护作用 

6-8周，雌性Balb/c小鼠，每只Balb/c小鼠腹腔注射20mg D-GalN，0.001ngLPS和20μg SEB混合物，溶于PBS溶液，总体积200μl。2h，注射总体积为300μl的抗体或PBS溶液。观察72h，并记录小数死亡数。 

实验结果见图10，在SEB诱导的中毒性休克综合症模型中，4株单克隆抗体均能提高小鼠的存活率。3E2和3C1保护效率达到70％，4A3的保护效率是60％，而1A5保护效率仅有50％。 

实验例3抗SEB单克隆抗体在体内对细胞因子的抑制试验 

每只Balb/c小鼠腹腔注射20mg D-GalN，0.001ng LPS和20μg SEB混合物，溶于PBS溶液，总体积200μl。2h，注射的总体积为300μl的抗体或PBS溶液。9h时，收集小鼠血清，保存于-80℃，直到检测。每孔各加入标准品(TNF-α，INF-γ和IL-2)或待测样品(平均分成3份)100μl，将反应板充分混匀后置于37℃， 120min。用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。每孔加入第一抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，60min。洗板同前。每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，30min。每孔加入底物工作液100μl，置37℃，暗处反应15min。每孔加入100μl终止液。30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。 

实验结果如图11所示，结果显示：4A3，3C1和3E2抗体可以使血清中INF-γ水平明显下降65％，血清中TNF-α和IL-2水平也可以下降70％和60％。1A5抗体仅能是血清中TNF-α，INF-γ和IL-2水平下降50％。这些体内实验结果与体外实验结果一致，4A3，3C1和3E2抗体的中和活性强于1A5。 

实施例1A5、4A3、3C1和3E2单抗抗原表位的鉴定实验 

实验例1抗SEB单克隆抗体1A5、4A3、3C1和3E2抗原表位的淘选 

采用随机肽库免疫淘选法，整个过程在96孔板上进行。100μg/ml，100μl/孔1A5、4A3、3C1和3E2抗体4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit)4×10¹⁰pfu+100μl正常小鼠血清，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween-20 0.1％)15次；用含1mg/ml BSA的Glycine-Cl PH 2.2洗脱，室温轻摇15min，15μl Tris-Cl PH 9.1中和。10μl用于测滴度，其余扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。经过三轮亲和淘选，与单克隆抗体1A5，4A3，3C1和3E2特异结合的噬菌体克隆被富集，滴度与得率均逐步升高。对结果进行了总结：与1A5特异结合的噬菌体克隆第一轮至第三轮的滴度依次为5×10⁶pfu；3.6×10⁸pfu；1.5×10⁹ pfu；从图12中可以看出，第三轮的富集效率是第一轮的750倍。与4A3特异结合的噬菌体克隆第一轮至第三轮的滴度依次为1×10⁶pfu；6×10⁷pfu；5×10⁸pfu；从图12中可以看出，第三轮的富集效率是第一轮的500倍。与3C1特异结合的噬菌体克隆第一轮至第三轮的滴度依次为1×10⁵pfu；1.0×10⁶pfu；2.0×10⁸pfu；从图12中可以看出，第三轮的富集效率是第一轮的2000倍。与3E2特异结合的噬菌体克隆第一轮至第三轮的滴度依次为2.5×10⁵pfu；1.3×10⁶pfu；4.2×10⁸pfu；从图12中可以看出，第三轮的富集效率是第一轮的1680倍。结果表明：经过三轮淘选，特异性结合于单克隆抗体1A5，4A3，3C1和3E2的噬菌体得到了有效富集。 

实验例2抗体识别表位的测序及序列分析 

我们将第三轮的淘选产物铺板，随机挑取了96个分隔良好的蓝色噬菌斑，扩增后上清进行噬菌体ELISA，经ELISA检测，得到1A5，4A3，3C1和3E2抗体特异的阳性噬菌体克隆各选取为100个。将阳性克隆扩增后，提取单链DNA(单链DNA提取试剂盒MBI)，以-96gIII primer为测序引物测序。测序结果显示，所选的1A5，4A3，3C1和3E2的阳性克隆中，均有多个单一序列(unique sequence)，经过序列分析比对结果图13所示：在1A5特异结合的肽中，SFWXXMMP出现的频率为94％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中 ¹⁹⁵SFWYDMMP²⁰²区域同源；在4A3特异结合的肽中，HKSXXFXXL出现的频率为96％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中¹²HKSSKFTGL²⁰区域同源；在3C1特异结合的肽中，TGLXXN出现的频率为97％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中¹⁸TGLMEN²³区域同源；在3E2特异结合的肽中，QFLXFXXIY出现的频率为95％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中⁴³QFLYFDLIY⁵¹区域同源；序列比对的结果表明：SFWXXMMP，HKSXXFXXL，TGLXXN和QFLXFXXIY 可能是单克隆抗体1A5，4A3，3C1和3E2与SEB蛋白的结合位点；经ELISA检测，得到1A5，4A3，3C1和3E2抗体特异的阳性噬菌体克隆分别为50个，36个，50个和49个。将阳性克隆扩增后，提取单链DNA，以-96gIII primer为测序引物测序。测序结果显示，所选的1A5，4A3，3C1和3E2的阳性克隆中，均有多个单一序列(unique sequence)，经过序列分析比对结果如表7所示：在1A5特异结合的肽中，SFWXXMMP出现的频率为94％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中¹⁹⁵SFWYDMMP²⁰²区域同源；在4A3特异结合的肽中，HKSXXFXXL出现的频率为96％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中¹²HKSSKFTGL²⁰区域同源；在3C1特异结合的肽中，TGLXXN出现的频率为97％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中¹⁸TGLMEN²³区域同源；在3E2特异结合的肽中，QFLXFXXIY出现的频率为95％，并且这与SEB蛋白的氨基酸序列中⁴³QFLYFDLIY⁵¹区域同源；序列比对的结果表明：SFWXXMMP，HKSXXFXXL，TGLXXN和QFLXFXXIY可能是单克隆抗体1A5，4A3，3C1和3E2与SEB蛋白的结合位点； 

实验3抗体与SEB蛋白的结合位点的计算机辅助模拟 

根据PDB数据库中SEB的晶体结构，以及文献报道的SEB与TCR和MHC II的结合域所涉及的氨基酸序列，用Discovery Studio 2.0(Accelrys，San Diego，CA)软件模拟SEB蛋白上TCR和MHC II与SEB蛋白的结合位点；根据表位筛选的结果，在SEB蛋白三维结构模式图中，标明单克隆抗体与SEB的结合位点。 

结果见附图14，通过Discovery Studio 2.0(Accelrys，San Diego，CA)软件模拟抗体识别表位与蛋白结构的关系，结果如图20所示，4A3和3C1表位定 位SEB蛋白N端与TCRVβ的结合位点；3E2的表位定位与SEB蛋白与MHC II结合位点；而1A5的表位位于MHC II与SEB蛋白结合位点的附近。据此证明，4A3，3C1和3E2抗体的中和活性强于1A5，是由于结合表位的差异而非与SEB间亲和力的差异造成的。 

实验例44A3和3E2单抗的可变区基因克隆和序列测定 

收集4A3和3E25×10⁶～1×10⁷杂交瘤细胞；用Trizol(Invitrogen Cat.No.15596-026)抽提其总RNA，根据小鼠抗体恒定区序列，设计引物如下： 

HGSP1：5’-GATACTGTGATCTGTTTG-3’(SEQ ID NO.11) 

HGSP2：5’-TCGCAGATGAGTCTGGAC-3’(SEQ ID NO.12) 

HGSP3：5’-ATGAACACACTCACATTG-3’(SEQ ID NO.13) 

LGSP1：5’-GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3’(SEQ ID NO.14) 

LGSP2：5’-AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3’(SEQ ID NO.15) 

LGSP3：5’-TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3’(SEQ ID NO.16) 

采用Invitrogen 5’RACE kit(Cat.No.18374-058)，分别以HGSP1，LGSP1为引物，合成第一链cDNA；在TdT和dCTP作用下，给第一链cDNA 3’端加poly C尾；分别以HGSP2，HGSP3、LGSP2，LGSP3为5’引物，通过巢式PCR得到VH、VL的PCR产物；将PCR产物装入pGEM-T easy载体中；挑取克隆抽提质粒，限制性内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。4A3和3E2单抗的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7，氨基酸序列为SEQ ID NO.4，和SEQ ID NO.8。4A3和3E2单抗的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9，氨基酸序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.10。 

实施例DVDV-Ig抗体的构建及结合作用 

实验例1DVD-Ig抗体的性质 

为了能使DVD抗体的各个重轻链可变区最大程度地保持亲本抗体的亲合力，需要对优化两个可变区的顺序。因为两个来源抗体可变区的不同排列顺序，会影响DVD抗体的活性。因此，我们设计了两种不同结构的DVD抗体，抗SEB的抗体。一种为4A3的轻重链可变区在N末端，通过linker串联上3E2的可变区，随后为抗体的恒定区，命名为4A3-3E2，其中两个抗体的重链可变区由ASTKGPSVF连接，两个轻链可变区由TVAAPSVFI连接；另一种是3E2的可变区在N末端，串联上4A3的可变区，随后为抗体的恒定区，命名为3E2-4A3.具体结构示意图如图15。 

从健康人淋巴细胞中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)基因，以及重链Fc区基因，将其插入pGEM-T(Promega)质粒中，构建质粒pGEM-T/CH、pGEM-T/CL和pGEM-T/Fc。 

用PCR方法分别得到4A3和3E2的轻重链可变区基因，4A3的可变区在N末端。用overlap PCR的方法将4A3和3E2的轻链由linker TVAAPSVFI串联起来，再与抗体轻链恒定区(CL)用PCR的方法连接，装入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)(4A3-3E2-L)；将4A3和3E2的重链可变区基因由linker ASTKGPSVF用overlap的方法串联起来，然后与重链恒定区(CH)连接，装入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建真核表达载体pDR(4A3-3E2-H)。 

于24孔组织培养板中接种1×10⁵/孔的CHO细胞(ATCC CRL 1650)，用10％FCS的RPMI1640/DMEM混合培养基培养至90-95％融合度时进行转染：取质粒1 μg(轻链表达载体0.6μg；重链表达载体0.4μg)和2μg Lipofectamine2000 Reagent分别溶于50μl无血清16/DM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用0.5ml无血清的16/DM培养基替换24孔板中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到孔中，CO₂孵箱培养4小时后补加0.5ml含20％FCS的16/DM培养基，置于CO₂孵箱中继续培养，48小时后取培养上清进行分析，采用ELISA确定培养上清中抗体的含量：2ug/mlGoat anti-human IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃孵育2小时，加入HRP-goat anti-human kappa进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H₂SO4终止反应，测A450值。 

取细胞培养上清沸水中煮5分钟，加样于6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，加入蛋白分子量标准作为指示，以4A3和3E2为对照抗体，采用电转移法将电泳后的凝胶转至PVDF膜上。将转膜装置放在转移槽中，保持在冰浴中360mA电流转膜1小时，转移完毕后，小心取下膜，去离子水漂洗印迹膜，室温下用10％脱脂奶粉封闭2小时。用10％脱脂奶粉稀释HRP-羊抗人IgG(H+L)抗体(1∶8000)，覆盖印迹膜，室温下震荡1小时，0.1％PBST漂洗3次，各10分钟。混合等体积Supersignal发光检测试剂，覆盖印迹膜，室温下震荡1分钟。用塑料膜包好，在暗室中胶片曝光，显影。 

结果见图16A：DVD-Ig抗体瞬时转染上清western blot检测结果显示，DVD-Ig抗体分子量约为220kDa，比一般的IgG分子高70kDa。 

实验例2DVD-Ig抗体结合活性 

以100μg/ml KLH-3E2P包被96孔酶联板，每孔100μl，4℃孵育过夜，每 个样设3个平行孔。倾去包被液，加入封闭液(10％脱脂奶粉，PBS pH 7.4配制)，4℃封闭2h。倾去封闭液，PBST洗5次。加入预先与生物素标记的4A3P孵育2h的3E2、4A3和DVD-Ig抗体。37℃，孵育1h。PBST洗5次，每孔加入HRP标记的avidin(1∶5000)100μl，37℃，孵育1h。PBST洗6次，TMB显色后测定450nm处的吸光值。 

结果见图16B：仅DVD-Ig双功能抗体同时与4A3P和3E2P肽段结合，4A3或者3E2抗体不具备桥联双表位肽的能力。 

实施例DVD-Ig抗体的体外中和保护试验 

实验例1DVD-Ig抑制SEB诱导的T细胞增殖 

外周血单核细胞的分离和纯化(PBMC)的纯化。无菌采取区静脉血6ml，用负压采血管，立即混匀防止血液凝固。加入等体积的无菌PBS，等倍稀释血液，提高分离效果。加入温浴好的淋巴细胞分离液(分离液∶混合液＝2∶3)于15ml离心管，管壁倾斜45度，缓慢加入血液混合液，注意保持两者界面清晰。室温2000rpm，20min(不开刹车)。用吸管将单核细胞层抽出，到新的15ml离心管。离心后管内分为四层：上层为血浆，血液和血小板；下层为红细胞和粒细胞；中间层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位灰白层即单个核细胞层。PBMC悬液用5倍体积的无血清1640洗涤2次，分别以2000rpm，1500rpm室温离心10min，可以去掉大部分混杂的血小板。用含10％FBS 1640培养基定容细胞，计数细胞后调整细胞浓度1×10⁶cells/ml。重悬细胞铺倒96孔细胞培养板，1×10⁵cells/well含10％FBS 1640培养基。SEB蛋白与4株单克隆抗体孵育2h，纯化的DVD-Ig抗体做梯度稀释。SEB与抗体混合物，加到96孔PBMC细胞培养的 相应孔中，37℃，5％CO₂，培养72h。加1μCi[³H]thymidine(体积50μl)，18h。培养结束后，离心吸去上清液，用200μl的预冷的PBS洗涤2次，2000rpm，10min。用多头细胞收集仪收集样品，用玻璃纤维滤纸抽洗至少2次，减压抽滤，依次以生理盐水，10％三氯醋酸(若有颜色物质用30％H₂O₂)和无水乙醇。取出滤膜，排列好，置于干燥箱中，60-80℃，30min烘干。对号剪下各个滤膜片，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中。闪烁瓶暗处放置15min。β液闪仪计数测定放射性cpm值。 

结果显示见图17，T细胞增殖实验证实DVD-Ig双功能抗体在体外可以抑制SEB诱导的T细胞增殖，与单个单克隆抗体使用时有明显差异。与对照抗体相比，在0.005ng/ml剂量时，单克隆抗体4A3和3E2对T细胞增殖的抑制作用达到50％；双功能抗体DVD-Ig抑制效果达到80％，与单个抗体单独使用时相比，有显著差异(P＜0.001)。4A3和3E2抗体联合使用时，抑制T细胞增殖的效率是80％，其抑制效果与双功能抗体没有差异。 

实验例2DVD-Ig对SEB体外诱导PBMC释放细胞因子的抑制作用 

外周血单核细胞的分离和纯化(PBMC)的纯化。无菌采取区静脉血6ml，用负压采血管，立即混匀防止血液凝固。加入等体积的无菌PBS，等倍稀释血液，提高分离效果。加入温浴好的淋巴细胞分离液(分离液∶混合液＝2∶3)于15ml离心管，管壁倾斜45度，缓慢加入血液混合液，注意保持两者界面清晰。室温2000rpm，20min(不开刹车)。用吸管将单核细胞层抽出，到新的15ml离心管。离心后管内分为四层：上层为血浆，血液和血小板；下层为红细胞和粒细胞；中间层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位灰白层即单个核细胞层。PBMC悬液用5倍体积的无血清1640洗涤2次，分别以2000rpm，1500rpm室温离心10 min，可以去掉大部分混杂的血小板。用含10％FBS 1640培养基定容细胞，计数细胞后调整细胞浓度1×10⁶cells/ml。重悬细胞铺倒48孔细胞培养板，5×10⁵cells/well含10％FBS 1640培养基，总体积为：500μl。SEB和mAb混合物，加到48孔板对应孔中。37℃，7％CO₂，培养到48h收集细胞上清液。吸取上清液到1.5ml离心管，1400rpm，5min离心，上清转移到1个新的离心管，-80℃保存，待测细胞因子时取出。 

血清中细胞因子检测：每孔各加入标准品(TNF-α，INF-γ和IL-2)或待测样品(平分成3份)100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，120min。用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。每孔加入第一抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，60min。洗板同前。每孔加酶表抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，30min。每孔加入底物工作液100μl，置37℃，暗处反应15min。每孔加入100μl终止液。30min内用酶标仪在A₄₅₀nm处测吸光值。 

结果显示见图18：双功能抗体抑制SEB诱导的T细胞激活和细胞因子的释放，与单独使用4A3或3E2时比较，抑制效果有显著增强。与对照抗体相比，双功能抗体对TNF-α，INF-γ和IL-2抑制作用达到90％，而3E2和4A3对TNF-α，INF-γ和IL-2抑制作用只有60％；双功能抗体与单独使用单克隆体相比，对细胞因子的抑制效果也有显著差异(P＜0.001)。并且4A3和3E2联合使用时，也有协同作用，对TNF-α，INF-γ和IL-2抑制作用也达到90％，其抑制效果与双功能抗体没有差异。 

实施例DVD-Ig抗体的体内中和保护试验 

实验例1DVD-Ig对SEB诱导的小鼠的保护作用 

6-8周，雌性Balb/c小鼠，每只Balb/c小鼠腹腔注射20mg D-GaIN，0.001ng LPS和20μg SEB混合物，溶于PBS溶液，总体积200μl。2h，注射总体积为300μl的抗体或PBS溶液。观察72h，并记录小数死亡数。 

结果显示见图19：双功能抗体对使小鼠的保护效率达到90％，而单克隆抗体3E2和4A3保护效率为70％。显著提高了小鼠的生存率。4A3和3E2联合使用对小鼠的保护效率是90％的效果，与双功能抗体的保护效率无差异。 

实验例2DVD-Ig在体内对细胞因子的抑制试验 

每只Balb/c小鼠腹腔注射20mg D-GaIN，0.001ng LPS和20μg SEB混合物，溶于PBS溶液，总体积200μl。2h，注射的总体积为300μl的抗体或PBS溶液。9h时，收集小鼠血清，保存于-80℃，直到检测。每孔各加入标准品(TNF-α，INF-γ和IL-2)或待测样品(平均分成3份)100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，120min。用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。每孔加入第一抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，60min。洗板同前。每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置于37℃，30min。每孔加入底物工作液100μl，置37℃，暗处反应15min。每孔加入100μl终止液。30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。 

结果显示见图20：双功能抗体可以抑制SEB诱导的T细胞激活和细胞因子的释放。与4A3或3E2单独使用时相比，DVD-Ig的抑制效果有显著增强。与对照抗体相比，双功能抗体可以使血清中TNF-α，INF-γ和IL-2水平明显下降，分别达到95％，95％和90％。而单克隆抗体4A3和3E2对血清中TNF-α，INF-γ和IL-2抑制作用为70％，70％和60％，与双功能抗体之间有25％，25％和30％的差异，统计学上有显著意义(P＜0.001)。4A3和3E2联合使用时，对血清中 TNF-α，INF-γ和IL-2抑制作用达到90％，显示4A3和3E2联合使用有协同作用，可以达到与双功能抗体相同的抑制效果。 

Claims (7)

1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白的功能表位¹⁹⁵SFWYDMMP²⁰²、¹²HKSSKFTGL²⁰、¹⁸TGLMEN²³和⁴³QFLFYFIY⁵¹

2.与权利要求1所述的功能表位特异性结合的抗金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白的单克隆抗体4A3和3E2。

3.权利要求2所述的单克隆抗体4A3和3E2，其重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8，轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQID NO.10。

4.权利要求3所述的单克隆抗体4A3和3E2，其恒定区均为小鼠IgG。

5.一种DNA分子，分别编码权利要求3所述的抗金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白的单克隆抗体4A3和3E2。

6.权利要求5所述的DNA分子，其编码单克隆抗体4A3和3E2重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7和编码单克隆抗体4A3和3E2轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.9。

7.权利要求2～4所述的单克隆抗体4A3和3E2在制备治疗SEB诱导中毒性休克综合症药物中的应用。

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