CN104342452A - 一种双功能抗体、其构建方法及双功能抗体基因工程药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双功能抗体及其构建方法。该双功能抗体包括抗体的重链恒定区、抗体的轻链恒定区、以及分别与所抗体的重链恒定区和抗体的轻链恒定区相连接的第一目的蛋白和第二目的蛋白。该双功能抗体的构建方法包括：分别获取抗体的重链恒定区基因、抗体的轻链恒定区基因、第一目的基因和第二目的基因；采用表达载体构建包括上述基因的重组载体穿梭质粒；将重组载体穿梭质粒转染至表达细胞株中进行培养，表达得到双功能抗体；以及离心收集上清或细胞进行纯化后得到双功能抗体。本发明的构建方法在基因水平上对抗体分子进行组装，构建过程针对性强且易于实现。构建得到的双功能抗体可具有两个抗原结合部位，从而可同时针对两个不同抗原。

Description

一种双功能抗体、其构建方法及双功能抗体基因工程药物

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，并涉及一种重组抗体。更具体地，本发明涉及一种包括两种目的蛋白的双功能抗体、其构建方法、以及含有该双功能抗体的基因工程药物。

背景技术

天然存在的抗体分子具有相似的结构，即均具有由两条相同的重链和两条相同的轻链所组成的对称结构。基于该对称结构，可以设计得到类似于天然抗体结构的重组抗体，即保留重链和轻链的保守恒定区结构，而将可变区替换成目标抗体的分子。此时，与重链的可变区和和轻链的可变区相连接的两种不同基因既具有抗体识别的特异性，又能起到不同抗体双重功能的作用。虽然目前已经提出了设计上述重组抗体的概念，但现有技术中尚未建立完善的构建该重组抗体的方法。

发明内容

本发明希望解决的技术问题在于，针对现有技术中尚未建立完善的双功能重组抗体的构建方法，提供一种易于实现且针对特定目标抗原的双功能抗体的构建方法。另外，本发明也提供采用上述方法得到的双功能抗体及包含该抗体的基因工程药物。

本发明希望解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种双功能抗体的构建方法，该方法包括以下步骤：

A：分别获取抗体的重链恒定区基因、抗体的轻链恒定区基因、第一目的基因和第二目的基因；

B：采用表达载体构建包括所述抗体的重链恒定区基因、所述抗体的轻链恒定区基因、所述第一目的基因和所述第二目的基因的重组载体穿梭质粒；

C：将步骤B中形成的重组载体穿梭质粒转染至表达细胞株中进行培养，表达得到所述双功能抗体。

在上述双功能抗体的构建方法中，在所述步骤A中，根据目标抗原决定簇获取所述第一目的基因和所述第二目的基因。

在上述双功能抗体的构建方法中，所述步骤A包括：

设计所述抗体的重链恒定区基因的引物、所述抗体的轻链恒定区基因的引物、所述第一目的基因的引物和所述第二目的基因的引物；

引物1：5’-CCC AAG CTT CCA AAA CGA CAC CCC CAT CTG-3’；

引物2：5’-AAA AGG GAC TCC CCG GTT CAT CTA GGG CGC TTG CCCAAT CAT-3’；

引物3：5’-GTC GCG GCC GC ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC-3’；

引物4：5’-GAA GAG AAA TAA ATA AAC AAT CAT ACA CTC TCC CCTTTT GAA GCT-3’；

引物5：5’-ATG ATT GGG CAA GCG CCC TAG ATG AAC CGG GGAGTC CCT TTT-3’；

引物6：5’-AGA GGA TCC CCA GGT GCC ACT ATC CTG GAG-3’；

引物7：5’-TTC AAA AGG GGA GAG TGT ATG ATT GTT TAT TTT CTCTTC-3’；

引物8：5’-GAA GGTACC CAA GCC CAC AGA TAT TTCCTG-3’；

基于PCR方法，使用引物1和引物2扩增出所述抗体的重链恒定区基因，使用引物3和引物4扩增出所述抗体的轻链恒定区基因，使用引物5和引物6扩增出所述第一目的基因，以及使用引物7和引物8扩增出所述第二目的基因。

在上述双功能抗体的构建方法中，在步骤B中，所述表达载体是pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/TO TOPO TA、pEGFP-N1或pBudce4.1。

在上述双功能抗体的构建方法中，在步骤C中，所述表达细胞株为293细胞、AD293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。

在上述双功能抗体的构建方法中，所述构建方法还包括离心收集上清或细胞，对所述双功能抗体进行纯化。

根据本发明的另一方面，提供一种双功能抗体，其包括抗体的重链恒定区和抗体的轻链恒定区，所述双功能抗体还包括分别与所述抗体的重链恒定区和所述抗体的轻链恒定区相连接的第一目的蛋白和第二目的蛋白。

在上述双功能抗体中，所述抗体的重链恒定区还包括激活免疫功能的抗体Fc片段。

在上述双功能抗体中，所述第一目的蛋白为CD4，第二目的蛋白为CCR5。

根据本发明的另一方面，提供一种双功能抗体基因工程药物，该双功能基因工程药物含有上述双功能抗体。

实施本发明可以获得以下有益效果：本发明的构建方法运用DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平上对抗体分子进行组装，构建过程针对性强且易于实现。构建得到的双功能抗体可具有两个抗原结合部位，从而针对两个不同抗原，具有比天然抗体更广阔的应用前景。

附图说明

图1是重组抗体CD4-FC（分子量约为60Kd）和CCR5-CL（分子量约为30Kd）的表达鉴定结果，其中M表示蛋白质分子MARKER标准品；

图2是重组抗体与目标蛋白gp120结合鉴定示意图；其中1表示阳性对照gp120的抗原抗体反应，2表示重组抗体与gp120的结合反应，3表示阴性对照，M表示蛋白质标准分子MARKER标准品。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种运用DNA重组技术构建双功能抗体的方法。该方法主要包括基因获取、穿梭质粒构建、重组抗体表达和分离纯化四个步骤。通过该方法制得的双功能抗体具有两个抗原结合部位，可针对两种类型的不同抗原。为具体说明本发明的构建方法，以下使用CD4和CCR5作为目的基因，使用人抗体的重链和轻链作为待重组目标；具体选用人抗体IgG的恒定区。

一、基因获取

在美国国立生物信息中心（NCBI）、欧洲生物信息中心（EBI）、法国免疫球蛋白基因序列数据库（IMGT）等数据库中，找到人抗体IgG的重链恒定区基因（FC基因）、人抗体IgG的轻链恒定区（CL基因）、CD4基因和CCR5基因的基因序列，并分别设计如下引物,

上游引物的引物序列1：5’-CCC AAG CTT CCA AAA CGA CAC CCCCAT CTG-3’,

下游引物的引物序列2：5’-AAA AGG GAC TCC CCG GTT CAT CTAGGG CGC TTG CCC AAT CAT-3’，

上游引物的引物序列3:5’-GTC GCG GCC GC ACT GTG GCT GCACCA TCT GTC-3’,

下游引物的引物序列4:5’-GAA GAG AAA TAA ATA AAC AAT CAT ACACTC TCC CCT TTT GAA GCT-3’,

上游引物的引物序列5:5’-ATG ATT GGG CAA GCG CCC TAG ATGAAC CGG GGA GTC CCT TTT-3’,

下游引物的引物序列6:5’-AGA GGA TCC CCA GGT GCC ACT ATC CTGGAG-3’,

上游引物的引物序列7:5’-TTC AAA AGG GGA GAG TGT ATG ATT GTTTAT TTT CTC TTC-3’,

下游引物的引物序列8:5’-GAA GGTACC CAA GCC CAC AGA TATTTCCTG-3’。

上述引物中，引物1和引物2用于扩增FC基因，引物3和引物4用于扩增CL基因，引物5和引物6用于扩增CD4基因，引物7和引物8用于扩增CCR5基因。在上述引物序列中加入了酶切位点，并同时设计了使FC-CD4和CL-CCR5相拼接的序列。

随后从人新鲜血样中提取总RNA，反转录成cDNA，以人cDNA为模板，以FC基因、CL基因、CD4基因和CCR5基因各自的上游和下游引物分别扩增，各自得到约1100bp、300bp、600bp和400bp大小的基因片段。同时分别以FC基因和CD4基因、以及CL基因和CCR5基因为模板分别PCR扩增连接成FC-CD4与CL-CCR5基因。随后，将扩增得到的基因片段分别装入T载体，经基因测序分析证实各基因片段为所需要的目的基因。

二、穿梭质粒的构建

本发明以真核表达载体为实例构建穿梭质粒，具体步骤如下：首先将FC-CD4基因用对应的限制性内切酶酶切，同样对应酶切表达载体，构建成含有FC-CD4基因的质粒表达载体-FC-CD4。然后，将CL-CCR5基因用对应的限制性内切酶酶切，同样对应酶切表达载体-FC-CD4，构建成含有FC-CD4基因和CL-CCR5基因的质粒表达载体-FC-CD4+CL-CCR5。

三、重组抗体的表达及提取纯化

将真核表达粒体pBudce4.1-FC-CD4+CL-CCR5转化于哺乳动物细胞293中，进行筛选鉴定，收取细胞和上清，以亲核层析法进行蛋白提取。

为便于多方面考察本发明的双功能重组抗体的可行性和实际应用方面的可靠性，本发明采用以下真核表达载体pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/TOTOPO TA、pEGFP-N1或pBudce4.1。另外，由于重组抗体的表达水平主要取决于表达载体的宿主细胞（表达细胞株），因此，适用于本发明的表达细胞株的选取也比较重要。对于本研究的双功能抗体，哺乳动物细胞表达系统是最佳的选择。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确空间结构所必需的分子伴侣和折叠酶，其内质网为抗体分子正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化还原环境。此外，哺乳动物细胞表达系统还拥有完整的转录和转录后、翻译和翻译后修饰、信号肽的剪切以及糖基化等优势，使表达的抗体空间结构近似于天然，有利于发挥其生物学功能，并延长其在体内的半衰期。本发明可选用293细胞、293T细胞（又称为人肾上皮细胞系Flp-In T-Rex293）或中国仓鼠卵巢细胞，并优选使用293细胞作为表达载体的宿主细胞，来建立起重组抗体稳定表达的293细胞。

以下实施例将详细说明如何采用获得的基因片段构建本发明的双功能重组抗体。

实施例1：以真核表达载体pBudce4.1得到稳定表达的细胞株

取人新鲜血液，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录cDNA。分别以引物1和引物2扩增FC基因、以引物3和引物4扩增CL基因,、以引物5和引物6扩增CD4基因、以引物7和引物8扩增CCR5基因。经DNA电泳分析后得到大小分别为1100bp、300bp、600bp和400bp的DNA片段。

以引物1和引物4、以FC基因和CD4基因为模板扩增得到1400bp的FC-CD4片段，该片段中分别引入了Hind III和BamH I酶切位点。以引物5和引物8、以CL基因和CCR5基因为模板扩增得到700bp的CL-CCR5片段,该片段中分别引入了Not I和Kpn I酶切位点。

以Hind III和BamH I双酶切FC-CD4基因片段和载体pBudce4.1，经DNA凝胶电泳回收后，按比例取适量酶切产物以连接酶连接，于16℃反应2小时，转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有Zeocin抗生素的平板上，于37℃过夜培养，挑取单克隆菌落于含有Zeocin抗生素的LB培养基中培养。当菌液达到OD值为1.0时提取质粒，得到重组质粒pBudce4.1-FC-CD4；进一步酶切鉴定pBudce4.1-FC-CD4，并通过DNA测序确认序列正确无误。

同样以Not I和Kpn I分别双酶切CL-CCR5片段和质粒pBudce4.1-FC-CD4，将CL-CCR5克隆入pBudce4.1-FC-CD4中构建成pBudce4.1-FC-CD4+CL-CCR5双表达质粒。

将双表达质粒pBudce4.1-FC-CD4+CL-CCR5转染于293细胞中：利用脂质体转染法，48小时后采用抗生素Zeocin进行抗性筛选，10天后用96孔板稀释法筛选得到稳定表达的细胞株，并进行大量细胞培养，收集细胞并裂解。采用HIS binds进行抗体提纯，取30μl HIS binds，加入TBST洗涤三次，去尽TBST后再加入300μl TBST溶液，加入细胞裂解液50μl，4℃轻轻摇动2-3小时，去尽上清，加入1000μl TBST溶液洗涤三次，去尽上清，加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后，进行SDS－PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，采用His单抗做为一抗，反应2小时后，TBST洗涤，加上兔抗鼠二抗反应一小时，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。

以下通过体外结合试验测定该实施例中制得的重组抗体与目标蛋白gp120的结合。各取30μl His纯化树脂二份，采用TBST溶液进行洗涤（预处理），随后加入300μl TBST溶液，分别标记为样品管和阴性对照管。在样品管中加入重组抗体蛋白液30μl，阴性对照管中不加任何成分，4℃下轻轻晃动反应4小时，离心去上清，采用TBST溶液充分洗涤后，再次分别加入300μl TBST溶液。随后同时在样品管和阴性对照管加入10μl gp120蛋白液，4℃下轻轻晃动反应过夜，离心去上清，采用TBST溶液充分洗涤并去尽上清，加入20μl蛋白电泳上样液loading buffer于95℃温度下变性5分钟后。同时准备2μlgp120蛋白液作为阳性对照进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测。采用gp120单抗做为一抗，反应2小时后TBST洗涤，加上羊抗兔二抗反应一小时，ECL显色。从图2所示的结果中可以清楚检测到重组抗体蛋白与目标蛋白的结合，阴性结果则无反应带。样品管所对应的反应带说明重组抗体与目标蛋白gp120具有良好的结合性。

实施例2：以真核表达载体pCDNA5/FRT/TO TOPO TA得到稳定表达的细胞株

设计下游引物9序列为:5’-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3’。以引物1和引物9从实施例1中的表达质粒中扩增含有FC-CD4片段和表达CL-CCR5蛋白的表达盒。该表达盒中含有EF-1α启动子序列，经DNA电泳分析后大小约为4600bp。经DNA凝胶电泳回收后，按比例取适量PCR产物和载体pCDNA5/FRT/TO TOPO TA以连接酶连接，于16℃反应2小时，转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有氨卞抗生素的平板上，于37℃过夜培养，挑取单克隆菌落于含有氨卞抗生素的LB培养基中培养。当菌液达到OD值为1.0时提取质粒，得到重组质粒pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-FC-CD4+CL-CCR5双表达质粒。

将双表达质粒pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-FC-CD4+CL-CCR5转染于Flp-In T-Rex293细胞中，24小时后采用抗生素Blasticidin B进行抗性筛选，10天后用96孔板稀释法筛选得到稳定表达的细胞株，并进行大量细胞培养，提取蛋白进行Western Blot检测。采用HIS binds进行抗体提纯，取30μl HISbinds,加入TBST洗涤三次，去尽TBST，再加入300μl TBST溶液，加入细胞裂解液50μl，4℃轻轻摇动2-3小时，去尽上清，加入1000μl TBST溶液洗涤三次，去尽上清，加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，采用His单抗做为一抗，反应2小时后，TBST洗涤，加上兔抗鼠二抗反应一小时，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。

实施例3：以真核表达载体pEGFP-N1得到稳定表达的细胞株

设计上游引物10序列为:5’-CTC CAG GAT AGT GGC ACC TGG TGAGCC CCT CTC CCT CCC CCC CCC-3’,

设计下游引物11序列为:5’-TGT GGC CAT ATT ATC ATC GTG GACAGA TGG TGC AGC CAC AGT-3’,

分别以引物10和引物11从质粒pIRES2-EGFP中扩增出IRES基因（约500bp），接着以引物1和引物11、以FC-CD4片段和IRES基因为模板扩增得到大小约1900bp的FC-CD4-IRES片段。分别以引物10和引物8、以IRES片段和CL-CCR5片段为模板扩增得到约1500bp的IRES-CL-CCR5片段。分别以引物1和引物8,以FC-CD4-IRES片段和IRES-CL-CCR5片段为模板扩增FC-CD4-IRES-CL-CCR5基因片段,得到约2900bp基因片段.

分别以Hind III和Kpn I分别双酶切FC-CD4-IRES-CL-CCR5基因片段和质粒pEGFP-N1构建成pEGFP-N1-FC-CD4-IRES-CL-CCR5双表达质粒。

将双表达质粒pEGFP-N1-FC-CD4-IRES-CL-CCR5转染于293细胞中，24小时后采用抗生素G418进行抗性筛选，10天后用96孔板稀释法筛选得到稳定表达的细胞株，并进行大量细胞培养，提取蛋白进行Western Blot检测。采用HIS binds进行抗体提纯，取30μl HIS binds，加入TBST洗涤三次，去尽TBST，再加入300μl TBST溶液，加入细胞裂解液50μl，4℃轻轻摇动2-3小时，去尽上清，加入1000μl TBST溶液洗涤三次，去尽上清，加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，采用His单抗做为一抗，反应2小时后，TBST洗涤，加上兔抗鼠二抗反应一小时，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。

实施例4：以原核表达载体pET28a得到稳定表达的菌株

将双表达质粒pEGFP-N1-FC-CD4-IRES-CL-CCR5以Hind III和BamH I双酶切得到FC-CD4-IRES-CL-CCR5,同时以Hind III和BamH I双酶切pET28a,构建得到原核表达质粒pET28a-FC-CD4-IRES-CL-CCR5,将表达质粒pET28a-FC-CD4-IRES-CL-CCR5转化于大肠杆菌Rosetta中,培养细菌OD值达0.6时，采用IPTG诱导表达，收集细胞并裂解，采用HIS binds进行抗体提纯，取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次，去尽TBST，再加入300μl TBST溶液，加入细胞裂解液50μl，4℃轻轻摇动2－3小时，去尽上清，加入1000μlTBST溶液洗涤三次，去尽上清，加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后，进行SDS－PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，采用His单抗做为一抗，反应2小时后，TBST洗涤，加上兔抗鼠二抗反应一小时，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。

Claims (9)

1.一种双功能抗体的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A：分别获取抗体的重链恒定区基因、抗体的轻链恒定区基因、第一目的基因和第二目的基因；

B：采用表达载体构建包括所述抗体的重链恒定区基因、所述抗体的轻链恒定区基因、所述第一目的基因和所述第二目的基因的重组载体穿梭质粒；

C：将步骤B中形成的重组载体穿梭质粒转染至表达细胞株中进行培养，表达得到所述双功能抗体。

2.根据权利要求1所述的双功能抗体的构建方法，其特征在于，在所述步骤A中，根据目标抗原决定簇获取所述第一目的基因和所述第二目的基因。

3.根据权利要求1或2所述的双功能抗体的构建方法，其特征在于，所述步骤A包括：

设计所述抗体的重链恒定区基因的引物、所述抗体的轻链恒定区基因的引物、所述第一目的基因的引物和所述第二目的基因的引物；

引物1：5’-CCC AAG CTT CCA AAA CGA CAC CCC CAT CTG-3’；

引物2：5’-AAA AGG GAC TCC CCG GTT CAT CTA GGG CGC TTG CCCAAT CAT-3’；

引物3：5’-GTC GCG GCC GC ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC-3’；

引物4：5’-GAA GAG AAA TAA ATA AAC AAT CAT ACA CTC TCC CCTTTT GAA GCT-3’；

引物5：5’-ATG ATT GGG CAA GCG CCC TAG ATG AAC CGG GGAGTC CCT TTT-3’；

引物6：5’-AGA GGA TCC CCA GGT GCC ACT ATC CTG GAG-3’；

引物7：5’-TTC AAA AGG GGA GAG TGT ATG ATT GTT TAT TTT CTCTTC-3’；

引物8：5’-GAA GGTACC CAA GCC CAC AGA TAT TTCCTG-3’；

基于PCR方法，使用引物1和引物2扩增出所述抗体的重链恒定区基因，使用引物3和引物4扩增出所述抗体的轻链恒定区基因，使用引物5和引物6扩增出所述第一目的基因，以及使用引物7和引物8扩增出所述第二目的基因。

4.根据权利要求1所述的双功能抗体的构建方法，其特征在于，在步骤B中，所述表达载体是pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/TO TOPO TA、pEGFP-N1或pBudce4.1。

5.根据权利要求1所述的双功能抗体的构建方法，其特征在于，在步骤C中，所述表达细胞株为293细胞、AD293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。

6.一种双功能抗体，包括抗体的重链恒定区和抗体的轻链恒定区，其特征在于，所述双功能抗体还包括分别与所述抗体的重链恒定区和所述抗体的轻链恒定区相连接的第一目的蛋白和第二目的蛋白。

7.根据权利要求6所述的双功能抗体，其特征在于，所述抗体的重链恒定区还包括激活免疫功能的抗体Fc片段。

8.根据权利要求6或7所述的双功能抗体，其特征在于，所述第一目的蛋白为CD4，第二目的蛋白为CCR5。

9.一种双功能抗体基因工程药物，其特征在于，含有权利要求6-8中任一权利要求的双功能抗体。