CN105061595A - 利用gst表达体系制备的mzf1-n端抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的MZF1抗体及应用。利用基因工程技术，将MZF1基因克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后,用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-MZF1融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western？blot检测。该抗MZF1多克隆抗体效价与特异性良好,可以应用于细胞中MZF1蛋白的检测并能有效检出MZF1蛋白在不同细胞中的差异表达，对于系统研究MZF1蛋白功能意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域,具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-MZF1融合蛋白的多克隆抗体及应用。
背景技术
MZF1蛋白(髓锌指基因1)属于锌指蛋白Kruppel转录因子家族的成员，包含13个C2H2锌指结构。这些锌指结构均能结合至相应的DNA序列上从而调节基因的表达。已知MZF1是一个双功能的转录因子，它既可作为转录抑制子也能作为转录激活子调控细胞的分化、迁移和增生。MZF1已经被证明对一些重要的蛋白的转录活性具有重要的调节作用。例如：AR、PKM和P53等等。
随着研究的深入我们对于MZF1蛋白功能及作用机制产生了更多的思考，如它是否与生殖系统的发育及功能密切相关，它是否对肿瘤起抑制作用，它是否能够促进癌细胞凋亡等等。而研究一种新的蛋白质的功能,抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的MZF1蛋白高效价抗体对于系统研究MZF1在肿瘤细胞增殖和凋亡中的作用机制意义重大。
发明内容
本发明的目的是建立一种能够用于MZF1蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入研究MZF1蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。
利用基因工程技术，将MZF1蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-MZF1融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。
本发明的GST-MZF1融合蛋白是将利用特殊序列(MZF1蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段)构建MZF1融合蛋白原核表达载体,转化BL21得到的高效表达特异性的GST-MZF1融合蛋白，这段N端128个氨基酸序列为：
其对应核苷酸序列为：
这种GST-MZF1融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：
第一步，克隆载体的构建
从人MZF1基因全长上应用PCR技术以小鼠心脏基因组为模板,扩增得到的目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后,酶切鉴定并测序。
第二步，原核表达载体pG`EX-4T-1的构建
将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后,利用回收试剂盒获得MZF1基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定。
第三步，GST-MZF1融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒PGEX-4T-1/MZF1转化大肠杆菌BL21,利用IPTG诱导,GST-MZF1融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定,，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose4B柱纯化,SDS-PAGE鉴定纯化产物。
第四步，兔抗MZF1抗血清的制备及纯化
以纯化的MZF1融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-MZF1融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100000时,颈动脉放血,收集血清。用ProteinA/G纯化抗hZimp10血清，准备蛋白AsepharoseCL-4B亲和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果显示该抗体可特异性的与MZF1蛋白结合。
利用MZF1蛋白N端128个氨基酸基因序列成功地构建GST-MZF1融合蛋白原核表达载体,转化BL21后可高效表达特异性的GST-MZF1融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-MZF1融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性，结果表明抗体效价高达1:100000且特异性良好。抗体可应用于细胞中MZF1蛋白的检测并能有效检出MZF1蛋白在不同细胞株中的差异表达，对于进一步探究MZF1蛋白在癌细胞中的表达强度与肿瘤恶性程度的相关性上很有帮助，对于系统研究MZF1蛋白功能及其在肿瘤细胞增殖和凋亡中的作用机制意义重大。另外，MZF1蛋白表达有不同的剪切体(isoform)，包括全长和N-128缺失型等，我们制备的MZF1-N-128aa抗体为检测不同疾病条件下不同MZF1isoform表达并以此判定MZF1蛋白表达与疾病的关系奠定了基础。为应用该抗体建立一种肿瘤恶性程度的检测模型提供了条件。
附图说明：
图1为PCR扩增出的MZF1基因N-128片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图2为双酶切质粒pGEX-4T-1和重组T载体琼脂糖凝胶电泳图；
图3为pGEX-4T-1/MZF1重组体酶切鉴定结果；
图4为纯化后的GST及GST-MZF1融合蛋白SDS-PAGE图；
图5为ProteinA/G纯化后MZF1抗体和纯化前的抗MZF1血清SDS-PAG图；
图6为间接ELISA法测定抗体的效价；
图7为抗血清特异性的Westernblot分析；
具体实施方式：
实施例1:抗GST-MZF1血清的在制备
1.PCR-PMD18-T/MZF1重组质粒的构建
MZF1基因全长从Genebank得到,基因序列号为NM003422。以小鼠心脏基因组为模板,上游引物为5’-GAATCCATGAGGCCTGCGGTGCTGG(含EcoRI酶切位点)；下游引物为5’-CTCGAGCTATCCGCCCGGCTCCCG(含XhoI酶切位点)。应用PCR成功扩增出了MZF1基因N端128个氨基酸对应DNA序列长度384bp【图1】。扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中,在含Amp+琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后,以EcoRI和XholI双酶切鉴定。
2.原核表达载体pGEX-4T-1的构建
将含有MZF1基因N-128片段的pMD18-T质粒经EcoRI和Xho1双酶切后(片段约0.4kbp),利用回收试剂盒获得MZF1基因该区片段,同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1(约4.9kbp)【图2】。然后将回收的MZF1基因N-128片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体,结果显示该MZF1基因N-128片段正确【图3】。
3.GST-MZF1融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒PGEX-4T-1/MZF1转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中,37℃振摇培养过夜。次日,将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中,继续在37℃摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L,不加入IPTG者为阴性对照,置25℃继续培养4～5h。离心收集菌体,以SDS-PAGE进行鉴定GST-MZF1融合蛋白的表达,并优化表达条件,进行大量扩增诱导。以5000r/min于4℃离心5min,收集菌体,用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀。用超声裂解细菌,再以9600rpm,于4℃离心15min,取上清,过Glutathione-Sepharose4B柱,先以等体积洗脱缓冲液1(含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl,pH＝8.0)洗脱,收集洗脱液,再以等体积洗脱缓冲液2(含100mM谷胱甘肽)洗两遍,收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定纯化产物【图4】。
4.兔抗MZF1抗血清的制备
以纯化的GST-MZF1融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-MZF1融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100000时,颈动脉放血,收集血清。
5.ProteinA/G纯化抗MZF1血清
将ProteinA/GsepharoseCL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色结果显示纯化效果明显，纯化后的样品有清晰的轻、重链带【图5】。
实施例2:GST-MZF1抗体的分析及应用
1.GST-MZF1抗体效价的测定
用GST-MZF1融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照,将纯化后的GST-MZF1抗体先稀释10倍再倍比稀释后,用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示,免疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-MZF1的抗体,GST-MZF1抗体的滴度高达1∶100000以上【图6】。
2.GST-MZF1抗体应用于细胞中MZF1蛋白的检测
收集培养的前列腺癌细胞LNCaP和正常细胞293T，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定量，之后将样品等蛋白量进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上。以5％脱脂奶粉封闭1h,依次滴加兔抗MZF1抗体(室温2h、PBS洗3次)及山羊抗兔IgG2HRP(室温反应1h、PBS洗涤3次),最后加底物DAB显色,并拍照。结果显示【图7】，我们制备的MZF1抗体与LNCaP和293T细胞株中所表达的MF1蛋白都发生了抗原-抗体反应，在Marker指示的80KD处出现了一条特异的蛋白带，并且在不同的细胞株中特异蛋白带的表达强度有所不同，293T细胞的特异蛋白带强度高，证明293T细胞高表达MZF1。
。
Claims (2)
1.利用GST表达体系制备的MZF1-N端抗体,其特征在于利用GST表达体系以MZF1蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST-MZF1融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-MZF1抗体的滴度高达1∶100000，并经过Westernblot鉴定该抗GST-MZF1血清具有较好的特异性，其中，
N端128个氨基酸序列为：
其对应核苷酸序列为：
1atgaggcctgcggtgctgggctccccagaccgagcacccccagaagatgaggggcctgtc
61atggtgaagctagaggactctgaggaggagggtgaggctgccttatgggacccaggccct
121gaagctgcacgcctgcgtttccggtgcttccgctatgaggaggccacagggccccaagag
181gccctggcccagctccgagagctgtgtcgccagtggctgcgtccagaggtacgctccaag
241gagcagatgctggagctgttggtgctggagcagttcctgggcgcactgccccctgagatc
301caggcccgtgtgcaggggcagcggccaggcagccccgaggaggctgctgccctagtagat
361gggctgcgccgggagccgggcgga。
2.如权利要求1所述的原核表达GST-MZF1融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-MZF1融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-MZF1抗血清，具体包括四步：
第一步，PCR-PMD18-T/GST-MZF1重组质粒的构建，MZF1基因N-128片段从Genebank得到,基因序列号为NM003422，以pcCDNA3.1-Flag-MZF1为模板,上游引物为5’-GAATCCATGAGGCCTGCGGTGCTG(含EcoRI酶切位点)；下游引物为5’-CTCGAGCTATCCGCCCGGCTCCCG(含XhoI酶切位点)，扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中,在含Amp+琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后,以EcoRI，XholI单酶切鉴定；
第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建，将含有MZF1基因N-128片段的pMD18-T质粒EcoRI和Xho1双酶切后,利用回收试剂盒获得MZF1基因N-128片段,同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1，然后将回收的MZF1基因N-128片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定；
第三步，GST-MZF1融合蛋白的诱导表达和纯化，重组质粒PGEX-4T-1/MZF1转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中,37℃振摇培养过夜，次日,将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中,继续在37℃摇床培养至对数生长中期，在培养液的A600为0.5～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L,不加入IPTG者为阴性对照,置25℃继续培养4～5h，离心收集菌体,以SDS-PAGE进行鉴定GST-MZF1融合蛋白的表达,并优化表达条件,进行大量扩增诱导，以5000r/min于4℃离心5min,收集菌体,用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀，用超声裂解细菌,再以9600rpm,于4℃离心15min,取上清,过Glutathione-Sepharose4B柱,先以等体积洗脱缓冲液1，含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl,pH=8.0，洗脱,收集洗脱液,再以等体积洗脱缓冲液2，含100mM谷胱甘肽，洗两遍,收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定纯化产物；
第四步，兔抗MZF1抗血清的制备及纯化，以纯化的MZF1融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-MZF1融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100000时,颈动脉放血,收集血清，将ProteinA/GsepharoseCL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定；
第五步，MZF1抗体的免疫学检测，用GST-MZF1融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照,将纯化后的GST-MZF1抗体先稀释10倍再倍比稀释后,采用间接ELISA方法测定抗体的效价，并采用Westernblot方法分析抗MZF1血清特异性，将纯化的融合蛋白GST-MZF1样品,经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉封闭1h,依次滴加兔抗鼠MZF1抗血清，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应1h、PBS洗涤3次,最后加底物DAB显色,并拍照。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151118 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |