CN113121683B - 棉花GraiRGA转录因子特异识别抗体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物信息学与分子遗传学技术领域，尤其涉及棉花GraiRGA转录因子特异识别抗体制备方法，通过分析棉花GraiRGA转录因子氨基酸序列后选取了长度为318个氨基酸的序列，经原核表达、新西兰大白兔免疫进行抗血清制备，再经抗原亲和纯化后，可以得到GraiRGA转录因子的特异结合抗体。本发明制得的GraiRGA抗体可用于GraiRGA转录因子的亚细胞定位研究，也可通过染色质免疫沉淀技术(ChIP)进行该转录因子在细胞中的染色质作用位点以及互作蛋白分析，为该转录因子介导的棉花抗逆机制研究提供重要工具，具有较高的应用价值和潜力。

Description

棉花GraiRGA转录因子特异识别抗体制备方法

技术领域

本发明涉及生物信息学与分子遗传学技术领域，尤其涉及棉花GraiRGA转录因子特异识别抗体制备方法。

背景技术

转录因子即能结合在特异的染色质序列位点(即顺式调控元件)的蛋白质，亦被称为反式作用因子。通过与顺式作用元件相互结合作用，或与其他调控因子蛋白的相互作用，来调控基因转录，借以行使其调控生物体生长发育、信号转到以及胁迫应答等生物学功能。RGA(repressor of GA1-3 mutant)属于植物特有的GRAS转录因子家族，该蛋白家族的成员具有其特有的GRAS结构域，部分成员还具有DELLA蛋白结构，该结构与植物的抗逆机制有着密切的联系，是植物逆境响应机制研究及抗逆材料培育的重要目标基因。

开展转录因子介导的生物学功能研究就要对转录因子进行深入分析，包括其在细胞中的分布、染色质结合位点以及互作蛋白等分析。其中，一个重要的研究手段是制备转录因子蛋白的特异抗体，通过应用特异识别抗体，来示踪并开展互作分析，解析其功能机制。但是，抗体制备往往受抗原序列设计、免疫效果等众多因素影响，制备可以特异、高效识别目标抗原蛋白的抗体较为困难，这一点在植物尤其是重要农作物棉花中相关工作开展较为缓慢，极少有成功应用的转录因子抗体报道。

棉花是世界性重要的经济作物。近年来，全球水资源短缺、土壤盐渍化、频繁的极端天气严重影响着作物的生长环境。我国耕地有限，同时保证粮棉油安全供给的矛盾日益突出。充分、有效利用大面积的滩涂和盐碱地，发掘棉花抗胁迫能力和提高单产潜力的需求越来越迫切。因此，培育抗逆性强的棉花新品种、新材料对于拓展土地可利用资源，保障并提高棉花生产水平具有重要意义。GraiRGA转录因子是棉花中鉴定的一个参与抗逆响应生理过程的重要转录因子，其在不同棉种中具有高度保守性，因此，GraiRGA转录因子特异抗体的制备对于研究该转录因子的作用机制提供了重要工具，对于棉花抗逆遗传育种研究也将有着重要的意义和应用潜力。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的棉花GraiRGA转录因子特异识别抗体制备方法，通过分析棉花GraiRGA转录因子的氨基酸序列，设计一条多肽序列，经动物免疫后制备出棉花GraiRGA转录因子的特异抗体。该抗体可用于GraiRGA转录因子的亚细胞定位研究，也可通过染色质免疫沉淀技术(ChIP)进行该转录因子在细胞中的染色质作用位点以及互作蛋白分析。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

棉花GraiRGA转录因子特异识别抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤1、首先利用生物信息学将棉花GraiRGA转录因子的基因的核苷酸序列翻译为氨基酸序列；根据氨基酸序列进行蛋白结构分析，确定蛋白非跨膜区，结合抗原表位分析以及亲水性分析，最终确定抗原多肽序列；

步骤2、根据抗原序列构建原核表达载体，并进行原核表达：

步骤3、将原核表达多肽作为抗原免疫新西兰大白兔；

步骤4、收集免疫后动物血清，进行抗原亲和纯化，获得抗体；

步骤5、抗体经ELISA验证，显示抗体可特异识别棉花GraiRGA转录因子，证实抗体制备成功。

优选地，所述步骤1中，抗原多肽是根据棉花GraiRGA转录因子基因的蛋白氨基酸序列分析后选取的1-318位氨基酸多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MKRDHQEISGSGSKPAESSSIKGKLWEEDPDAGGMDDELLAVLGYKVRSSDMADVAQKLEMLEKVMGTAQEDGISQLGDTVHFNPSDLSGWVQNLLIEFNGPTTTPDPNFNDDSEYDLRAIPGVAAYPPVKSDPGLENTRKRAKTESSSSSSSTTTRPVVLIDSQETGVRLVHTLMACAEAVQQDNLKLADALVKHIGLLASSQTGAMRKVATYFAEALARRIYRIFPPDSLDPSYNDKLQIPFYETCPYLKFAHFTANQAILEAFSMASRVHVIDFGLKQGMQWPALMQALALRHGGPPAFRLTGIGPPQPDNTDAL。

优选地，所述步骤1中，棉花GraiRGA转录因子，氨基酸全长序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

MKRDHQEISGSGSKPAESSSIKGKLWEEDPDAGGMDDELLAVLGYKVRSSDMADVAQKLEMLEKVMGTAQEDGISQLGDTVHFNPSDLSGWVQNLLIEFNGPTTTPDPNFNDDSEYDLRAIPGVAAYPPVKSDPGLENTRKRAKTESSSSSSSTTTRPVVLIDSQETGVRLVHTLMACAEAVQQDNLKLADALVKHIGLLASSQTGAMRKVATYFAEALARRIYRIFPPDSLDPSYNDKLQIPFYETCPYLKFAHFTANQAILEAFSMASRVHVIDFGLKQGMQWPALMQALALRHGGPPAFRLTGIGPPQPDNTDALQQVGWKLAQLAERIGIEFEFRGFVANSLADLEPEMLDIRPPEIEVVAVNAVFELHPLLARPGGIEKVVSSIKAMKPKIVTVVEQEANHNGPVFLDRFTEALHYYSTLFDSLEGSGVAPPSQDLAMSELYLGRQICNVVACEGMDRVERHEPLTQWRTRMETAGFSPVHLGSNAYKQASMLLALFASGDGYRVEENNGCLMLGWHTRPLIATSAWRLAGTESGSELTQELS。

优选地，所述步骤1中，编码所述棉花GraiRGA转录因子的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：

ATGAAGAGAGATCATCAAGAAATTTCTGGGAGTGGTTCAAAACCAGCTGAGAGTTCATCCATTAAAGGGAAATTATGGGAAGAAGATCCAGATGCTGGTGGCATGGACGACGAGTTATTAGCTGTTTTGGGTTACAAAGTTCGGTCATCAGATATGGCGGATGTAGCTCAAAAATTGGAAATGCTGGAGAAAGTTATGGGTACTGCTCAAGAAGATGGGATTTCACAGCTTGGTGATACTGTTCATTTTAATCCTTCAGATCTATCCGGTTGGGTTCAAAATTTGTTGATCGAGTTCAACGGTCCAACAACAACCCCAGATCCCAATTTCAACGATGATTCTGAGTACGATCTTAGAGCAATACCAGGGGTCGCCGCTTACCCACCGGTGAAATCGGATCCGGGTCTAGAAAATACCCGGAAACGAGCTAAAACTGAGTCCTCCTCATCATCATCTTCAACAACTACTCGTCCTGTTGTGTTGATTGACTCACAAGAAACTGGGGTTCGACTCGTTCATACATTAATGGCTTGTGCTGAAGCTGTTCAACAAGATAATCTTAAACTAGCTGATGCATTAGTGAAACATATTGGGTTACTTGCTTCATCACAAACTGGTGCTATGAGAAAAGTTGCTACTTATTTTGCTGAAGCTTTAGCTCGAAGAATTTATAGAATTTTCCCACCAGATTCACTTGATCCATCATATAATGATAAGTTACAAATTCCCTTCTATGAAACTTGTCCTTATTTGAAATTTGCTCATTTTACAGCCAATCAAGCCATATTGGAAGCTTTTTCAATGGCTAGTAGAGTTCATGTTATTGATTTTGGGCTAAAACAAGGTATGCAATGGCCAGCTTTAATGCAAGCACTTGCATTAAGACACGGTGGACCACCGGCGTTTCGATTGACCGGAATTGGACCGCCTCAACCGGATAATACTGATGCGTTGCAACAAGTGGGGTGGAAGCTAGCTCAATTGGCCGAACGCATCGGGATCGAATTCGAGTTTCGGGGATTCGTGGCTAATAGTTTAGCCGATCTCGAACCCGAAATGCTCGATATTCGTCCTCCCGAGATTGAAGTAGTAGCGGTGAACGCTGTTTTCGAGCTTCATCCCTTGTTAGCTCGACCGGGTGGGATCGAAAAAGTTGTTTCCTCTATTAAAGCGATGAAACCCAAGATTGTCACGGTTGTTGAACAAGAAGCGAATCACAACGGTCCGGTTTTCTTAGACCGTTTTACTGAAGCTCTCCATTATTATTCTACCCTTTTCGACTCGTTGGAAGGTTCAGGGGTGGCGCCACCGAGTCAAGACCTGGCTATGTCCGAGTTATACTTAGGAAGACAGATTTGTAACGTGGTTGCTTGTGAAGGGATGGACCGAGTTGAACGACACGAGCCATTGACTCAGTGGAGAACTCGGATGGAAACGGCCGGGTTTAGCCCTGTTCATTTGGGTTCCAATGCTTATAAACAAGCTAGTATGTTGTTGGCCCTCTTCGCCAGCGGCGATGGGTATAGAGTGGAGGAGAATAATGGGTGTTTAATGCTTGGGTGGCATACAAGGCCACTTATCGCCACCTCGGCTTGGCGACTCGCTGGTACTGAGTCAGGTAGTGAGTTAACTCAGGAGCTGAGTTGA。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明获得的棉花GraiRGA转录因子抗体是经分析该基因序列和由该基因序列获得的氨基酸序列自主设计的一段抗原多肽制备获得；抗体经ELISA验证显示可以高效、特异识别GraiRGA转录因子蛋白，证实抗体真实可靠，可以进行后续的使用。

2、本发明为GraiRGA转录因子介导的棉花抗逆等机制研究提供了有力工具。该抗体可用于GraiRGA转录因子的亚细胞定位研究，也可通过染色质免疫沉淀技术(ChIP)进行该转录因子在细胞中的染色质作用位点分析，同时也可以进行互作蛋白分析，发掘与之相互作用的其它蛋白因子，从而为揭示其遗传机理提供重要信息，也将有助于未来新种质材料的研发。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：棉花GraiRGA转录因子蛋白序列的获得

不同转录因子具有一定的保守结构，根据植物中RGA转录因子具有一定保守性，采用来自萝卜的RGA基因(XM_018628495.1)通过BLAST同源性搜索棉花基因组，获得一个来自雷蒙德氏棉高度同源基因序列，获得了该基因的全长核苷酸序列，由此得到了棉花GraiRGA转录因子的基因序列以及蛋白序列。

本发明使用BLAST序列比对的方法，根据植物中RGA转录因子具有一定保守性得到了棉花GraiRGA蛋白相应的序列信息。

需要说明的是，这里使用的BLAST序列比对的方法为现有技术，且也并非本发明重点保护的技术方案，因此其比对的具体步骤在这里不再详细阐述。

实施例2：抗原的设计与制备

根据获得的棉花GraiRGA蛋白氨基酸序列，通过生物信息学软件分析其蛋白结构，首先采用TMHMM软件进行跨膜区分析，排除跨膜区序列；再将非跨膜区段序列进行表位分析，根据得分选取得分较高的区段作为抗原候选区；结合蛋白质性质分析，分析候选抗原的亲水性、抗原性、柔韧性以及表面暴露性等参数，选择可溶性好且抗原性、柔韧性和暴露性高的区段，再结合螺旋折叠结构最终确定1-318位氨基酸序列较为理想，作为最终的抗原序列。

根据确定的抗原序列构建原核表达载体，并进行原核表达，收集纯化后即获得相应的抗原蛋白。

实施例3：抗体的制备与评价

(1)以上述获得的抗原蛋白进行动物免疫，制备抗血清。

免疫2只新西兰大白兔，首先要预采血，然后在第0天用完全福氏佐剂+抗原，600～800ug/只，进行初次免疫，在第21天用不完全福氏佐剂+抗原，400～500ug/只，进行第一次加强免疫，在第35天用不完全福氏佐剂+抗原，400～500ug/只，进行第二次加强免疫，在第42天进行血清检测，所需要的抗血清ELISA效价为1：20000，若效价达到要求，在第49天采全血，分离抗血清，如达不到要求，在第49天用不完全福氏佐剂+抗原，200ug/只，进行第三次加强免疫，在第56天进行血清检测，若效价达到要求，第63天采全血，分离抗血清。

(2)抗原亲和纯化。

每抗体纯化一只兔子30ml抗血清，得到的抗体经SDS-PAGE检测纯度在90％以上。

(3)抗体验证。

为了进一步确定该抗体能够特异的识别棉花GraiRGA蛋白，将抗体进行ELISA验证，显示抗体可特异识别棉花GraiRGA转录因子，证实抗体制备成功。

表1抗体制备ELISA检测结果

Animal	Blank	Negative	1:1K	1:4K	1:16K	1:64K	1:128K
								Rabbit1	0.038	0.097	2.789	2.544	2.112	1.541	0.977
Rabbit2	0.034	0.105	2.862	2.558	2.123	1.671	1.168

本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.棉花GraiRGA转录因子特异识别抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、首先利用生物信息学将棉花GraiRGA转录因子的基因的核苷酸序列翻译为氨基酸序列；根据氨基酸序列进行蛋白结构分析，确定蛋白非跨膜区，结合抗原表位分析以及亲水性分析，最终确定抗原多肽序列；

步骤2、根据抗原序列构建原核表达载体，并进行原核表达：

步骤3、将原核表达多肽作为抗原免疫新西兰大白兔；

步骤4、收集免疫后动物血清，进行抗原亲和纯化，获得抗体；

步骤5、抗体经ELISA验证，显示抗体可特异识别棉花GraiRGA转录因子，证实抗体制备成功；

所述步骤1中，抗原多肽是根据棉花GraiRGA转录因子基因的蛋白氨基酸序列分析后选取的1-318氨基酸多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述步骤1中，棉花GraiRGA转录因子，氨基酸全长序列如SEQ ID NO.2所示；

所述步骤1中，编码所述棉花GraiRGA转录因子的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。