CN116042533A - 抗虫蛋白Cry 1F杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Cry 1F杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8及其产生的抗体和应用，所述杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8，已依次于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45008和45009，其制备方法包括：a)纯化转基因玉米种子中Cry 1F蛋白；b)将Cry 1F蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；c)收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；d)通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5‑7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存，所述杂交瘤细胞株分泌的单抗为实现抗虫蛋白Cry 1F转基因作物中的检测奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及到抗虫蛋白Cry 1F杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8及其产生的抗体和应用。
背景技术
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ-内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入农作物使其具有抗虫性。Cry 1F蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。
转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物及其衍生物中Cry 1F蛋白进行快速分析，研究并得到抗Cry 1F蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供两种杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8及其产生的抗体和制备方法，其分泌的单抗为实现抗虫蛋白Cry 1F在转基因作物中的检测奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供了杂交瘤细胞株，包括于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的生物保藏编号为CGMCC No.45008和CGMCCNo.45009的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8。
具体的，杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：
a)纯化转基因玉米种子中Cry 1F蛋白；
b)免疫动物：将Cry 1F蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
其中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。
本发明还提供一种前述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
具体的，杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价分别为1:6140000和1:2050000，抗体的类型分别为IgG1和IgG2b。
杂交瘤细胞株1D7 1C6所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示序列；杂交瘤细胞株1F7 1D8所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4。具体序列为：
本发明还提供了上述单克隆抗体在Cry 1F抗虫蛋白定性、定量检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用转基因玉米种子中纯化得到的抗虫蛋白Cry 1F作为抗原，通过杂交瘤技术制备了2株分泌抗Cry 1F的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价分别为1:6140000和1:2050000，所述单抗可以特异识别转基因玉米中Cry 1F蛋白，分泌抗Cry 1F抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
保藏信息
本发明提供的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8，已依次于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类名称为Cry1Fa单抗杂交瘤细胞株，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为CGMCCNo.45008和CGMCC No.45009。
附图说明
图1是根据本发明的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳结果图；
图2是根据本发明的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体滴度；
图3是根据本发明的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体特异性检测转基因玉米中的Cry 1F Western结果图；
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫抗原的制备
约1kg的转基因玉米种子液氮充分研磨后溶于蛋白提取液中，经高速冷冻离心、变性溶液溶解沉淀、离心分离、离子交换层析和凝胶过滤及复性等多个纯化步骤得到相对较纯的Cry 1F蛋白。
2.免疫动物
用Cry 1F蛋白作为抗原免疫8只8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠(购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018)，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)或不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μL的PBS中，具体免疫次数及免疫剂量如表1所示：
表1免疫次数及免疫剂量
免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。
3.细胞融合
末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)，50％ PEG1450作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％ CO2，37℃下培养。
4.细胞建株
1)融合板检测：
待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在ELISA质控合格(即阴性对照OD450<0.2，阳性对照OD450>1.0)后挑选阳性孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。
2)亚克隆方法及检测：
挑出融合板中检测阳性值高(OD450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。
3)细胞株建立：
将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及western-blotting验证其稳定性，Cry 1F单抗杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8分泌的单抗能特异检测到转基因玉米样本中的Cry 1F蛋白，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出OD450>2.0的2株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存，即杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8，已依次于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号依次为CGMCC No.45008和CGMCC No.45009。
4)细胞株冻存鉴定在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：
①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA(OD450>2.0)，以确定是否分泌阳性抗体的同时做western-blotting的鉴定，通过图3可知，Cry 1F单抗杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F71D8分泌的单抗能特异检测到转基因玉米中Cry 1F蛋白。
5.制备腹水
先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8接种到小鼠腹腔中，细胞定株后扩大培养选用10％胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×106-2×106/mL时，800rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。
6.抗体纯化
收集后的腹水经过预处理后选用Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：
1)缓冲液：起始缓冲液为pH7.0，20mM磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.70.1mM甘氨酸盐酸。
2)准备收集管：取1.5mL离心管，每支离心管加70μL pH9.0 1M Tris-HCL。
3)样品准备：经50％ SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm微孔滤膜滤过。
4)纯化过程：用足够的起始缓冲液(8-10mL)平衡Protein A-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein A 1mL，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2-21.1mg)15-25mL上柱，流速为0.5mL/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7-8mL、洗脱缓冲液6-7mL、起始缓冲液5mL洗涤，每管1mL收集洗脱液。
5)纯度及活性鉴定纯化的单克隆抗体(McAb)用SDS-PAGE鉴定其纯度，详见图1，杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带(55kDa和30kDa)。
7.单克隆抗体的效价测定
以转基因玉米中纯化的Cry 1F为抗原，用间接ELISA方法检测纯化单抗效价，通过图2可知，经ELISA测定，纯化得到的1D7 1C6和1F7 1D8单抗滴度为1:6140000和1:2050000。
表2杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体的浓度
| 单抗杂交瘤细胞编号 | 抗体(IgG)浓度 |
| 1D7 1C6 | 6.0mg/mL |
| 1F7 1D8 | 2.0mg/mL |
8.单克隆抗体特异性检测
分别提取转基因玉米及其其转化亲本内源蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜用纯化单抗(1D7 1C6和1F7 1D8)作为一抗western检测结果，通过图3可知，纯化得到的1D7 1C6和1F71D8单抗能特异识别内源样本中的Cry 1F。
其中，转基因玉米蛋白提取方法:
组织液氮速冻，磨碎，加1mL(按样品量，一般0.5g加1-2mL)蛋白提取液，4℃混匀30分钟，(12,000rpm 4℃离心15min，取上清)，蛋白提取液配方见表3：
表3蛋白提取液配方
| 成分 | 用量 |
| 1M Tris,pH 7.5 | 500uL |
| 1M NaCL | 1.5mL |
| 0.5M EDTA | 20uL |
| 50％glycerol | 2mL |
| 10％SDS | 1mL |
| <![CDATA[双蒸水(DDH<sub>2</sub>O)]]> | 配成10mL |
| 蛋白酶抑制剂(Roche) | 用时添加一片 |
| 1mM PMSF(苯甲基磺酰氟,Sigma) | 用时添加50uL |
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (8)
1.杂交瘤细胞株，其特征在于，包括于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的生物保藏编号为CGMCC No.45008和CGMCC No.45009的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
a)纯化转基因玉米种子中Cry 1F蛋白；
b)免疫动物：将Cry 1F蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。
4.权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价分别为1:6140000和1:2050000。
6.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F71D8所产生的单克隆抗体的类型分别为IgG1和IgG2b。
7.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，杂交瘤细胞株1D7 1C6所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示序列；杂交瘤细胞株1F7 1D8所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4。
8.根据权利要求4-7任一项所述的单克隆抗体在Cry 1F抗虫蛋白定性、定量检测中的应用。
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| CN117143832A (zh) * | 2023-11-01 | 2023-12-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种抗虫蛋白Cry 1Ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 |
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| CN117143831B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-01-26 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种抗虫蛋白杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 |
| CN117143832A (zh) * | 2023-11-01 | 2023-12-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种抗虫蛋白Cry 1Ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 |
| CN117143832B (zh) * | 2023-11-01 | 2024-02-13 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种抗虫蛋白Cry 1Ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 |
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